邱雅若 李星霖 陳丹瑛 劉永梅 宋焱君 李國力 宋 川 王 璽 趙學(xué)森

(1. 北京大學(xué)地壇醫(yī)院教學(xué)醫(yī)院，北京 100015；2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京地壇醫(yī)院傳染病研究所，北京 100015 )

截至2022年3月1日，新型冠狀病毒肺炎疫情在全球累計確診病例超過4億，累計死亡病例達到590多萬[1-2]。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)是一種單股正鏈RNA病毒，其基因組長度為30 kb[3]。結(jié)構(gòu)蛋白包括刺突蛋白S、包膜蛋白E、基質(zhì)蛋白M和核衣殼蛋白N[3]。刺突蛋白S由S1和S2亞基組成，可以利用來自不同動物的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶Ⅱ (angiotensin-converting enzyme Ⅱ，ACE2) 侵入宿主細胞[4-5]，該過程是病毒成功侵入細胞的關(guān)鍵步驟。

SARS-CoV-2在傳播的過程中不斷產(chǎn)生突變，Omicron(B.1.1.529)變異株于2021年11月24日首次由南非報告給世界衛(wèi)生組織 (World Health Organization, WHO)，此后該變異株迅速成為南非的主要流行株，并傳播至全球多個國家和地區(qū)，截至2022年2月全球共有80多個國家和地區(qū)報告了Omicron株感染病例[6]。目前已有研究[6-7]表明，與其他關(guān)切變異株(variant of concern, VOC)相比，Omicron變異株出現(xiàn)免疫逃逸和再次感染的風(fēng)險增加，這對全球新型冠狀病毒肺炎(COVID-19) 疫情防控提出了新的挑戰(zhàn)。

與之前發(fā)現(xiàn)的變異株相比，Omicron變異株具有更多的突變位點，其中Spike蛋白上的突變位點為32個[8]；而2020年在印度和其他國家引發(fā)大流行的Delta變異株，在Spike蛋白上僅有8個突變[9]。因此，Han等[10]認為Omicron株和ACE2之間的親和力將會發(fā)生改變。此外，在Omicron株中檢測到的突變,有很多在之前的SARS-CoV-2變異株中幾乎沒有被報道過，這讓人們對Omicron的進化和來源產(chǎn)生了一些爭議[11]，即Omicron株的變異過程具體是發(fā)生在哪些動物身上[12]。由此可見，驗證Omicron變異株可能存在的中間宿主是有必要的。

已有研究[4]證明Omicron變異株可利用來自人類、果子貍、大鼠、穿山甲等哺乳動物的ACE2受體侵入細胞，但是否可以利用其他哺乳動物(如兔、浣熊狗)的ACE2受體侵入細胞仍有待研究。為了研究Omicron株可能存在的潛在中間宿主，證明其潛在的種間傳播能力，本研究利用本實驗室所建立的Omicron假病毒感染系統(tǒng)，驗證Omicron株利用13種不同哺乳動物來源的ACE2受體的能力，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人類ACE2質(zhì)粒、果子貍ACE2質(zhì)粒、中華菊頭蝠ACE2質(zhì)粒、豬獾A(chǔ)CE2質(zhì)粒、雪貂獾A(chǔ)CE2質(zhì)粒、貓科動物ACE2質(zhì)粒、大鼠ACE2質(zhì)粒、墨西哥無尾蝠ACE2質(zhì)粒均由本實驗室提供；浣熊狗ACE2質(zhì)粒由加拿大西安大略大學(xué)Dr. Hanxin Lin饋贈；293T細胞系由本實驗室提供；細胞培養(yǎng)皿、12孔板、 96孔板、磷酸緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、胎牛血清均購自美國Corning公司；0.05%(質(zhì)量分數(shù))胰蛋白酶與DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Turbo轉(zhuǎn)染試劑盒購自美國Thermoscientific公司；熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 構(gòu)建蛋白表達質(zhì)粒

首先將來自13種不同哺乳動物的ACE2分子被克隆至修飾后的pcDNA3.1載體(pcDNA3.1-N-Myc/C-C9)。從該載體表達的ACE2蛋白在氨基(N)末端含有Myc標(biāo)簽，在羧基(C)端含有C9標(biāo)簽。再從美國國立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI) GenBank數(shù)據(jù)庫下載VSV-G蛋白及新型冠狀病毒野生型的DNA序列，進行密碼子優(yōu)化后合成至pSecTag2載體上，獲取單克隆質(zhì)粒后大量擴增，測序鑒定其序列正確。隨后將密碼子優(yōu)化后的Omicron株S蛋白序列送至生物公司合成至pSecTag2載體上。通過PCR定點突變以及分子克隆，構(gòu)建新型冠狀病毒D614G株、Delta株的S蛋白表達質(zhì)粒，測序鑒定其序列正確。

1.2.2 包裝D614G株、Delta株及Omicron 株VSV-ΔG-luc假病毒

用0.05%(質(zhì)量分數(shù))胰酶消化并接種293T細胞至6孔板中，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h；待6孔板細胞密度達到80%～90%時，按照Lipo 2000轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染新型冠狀病毒Spike蛋白表達質(zhì)粒。6 h后每孔以3.0×104TCID 50/mL的濃度感染VSV-G/VSV-ΔG-luc假病毒，并補充2 mL新鮮培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染24 h后，每孔更換4 mL新鮮培養(yǎng)基；收取轉(zhuǎn)染后48 h及72 h的細胞上清液，經(jīng)0.45 μm的聚醚砜(polyethersulfone，PES)濾膜濾過，分裝后于-80 ℃儲存，即獲得SARS-CoV-2 D614G株、Delta株及Omicron株的VSV-ΔG-luc假病毒。

1.2.3 假病毒感染實驗

用0.05%(質(zhì)量分數(shù))胰酶消化并接種293T細胞至12孔板中，置37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16～18 h；待12孔板中的293T細胞密度達到80%～90%時，按照Turbofect轉(zhuǎn)染方法轉(zhuǎn)染不同動物來源的ACE2質(zhì)粒和pcDNA3.1空載質(zhì)粒；轉(zhuǎn)染24 h后，將細胞消化并接種至96孔板，37 ℃ 培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)；待96孔板中的細胞密度達到80%時，棄掉培養(yǎng)基，將病毒按1∶5比例進行稀釋，每孔加入100 μL假病毒稀釋液；感染24 h后，棄掉病毒液。每孔加入30 μL細胞裂解液，室溫下放置10 min，待細胞充分裂解后，每孔加入50 μL熒光素酶底物，立即置于熒光素發(fā)光儀器上讀數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Omicron的Spike蛋白高度突變

根據(jù)全球共享流感數(shù)據(jù)庫(Global Initiative on Sharing all Influenza Data, GISAID)[13-14]發(fā)布的Omicron變異株基因組序列信息顯示，Omicron株和其他已知的VOC基因序列存在顯著差異，其在Spike蛋白上有32個氨基酸發(fā)生了突變，主要集中于受體結(jié)合域(receptor-binding domain, RBD)和N段(N-terminal domain, NTD)(圖1)。

圖1 SARS-CoV-2 D614G、Delta、Omicron變異株Spike蛋白的示意圖概括和結(jié)構(gòu)域分布Fig.1 Overview and domain distribution of spike proteins of SARS-CoV-2 D614G, Delta, and Omicron variantsGISAID: Global Initiative on Sharing all Influenza Data; NTD：N-terminal domain; RBD：receptor-binding domain; TD：terminal domain.

2.2 新型冠狀病毒Omicron變異株可有效利用多種動物的ACE2進入細胞

結(jié)果顯示，不同ACE2的表達并不影響 Lassa virus (LASV) 對細胞的侵入，但卻明顯增強了D614G株、Delta株和Omicron株對細胞的侵入(圖2)。與D614G株和Delta株相比，Omicron利用中華菊頭蝠和

圖2 與D614G和Delta spike相比，Omicron spike以不同的效率介導(dǎo)進入細胞系，有效利用不同動物的ACE2受體侵入細胞Fig.2 Compared to D614G and Delta spikes, Omicron spike mediate entry into cell lines with different efficiencies, effectively utilizing ACE2 receptors from different animals to invade cellsn=3； ACE2:angiotensin-converting enzyme Ⅱ;LASV: Lassa virus.

雪貂獾的ACE2的能力顯著減弱(P<0.05)。此外，與D614G株相比，Omicron株利用中華菊頭蝠、墨西哥無尾蝠、雪貂獾、豬獾、貓、兔和穿山甲的ACE2受體侵入細胞的能力降低(P<0.05)；與Delta株相比，Omicron株利用中華菊頭蝠、雪貂獾、豬獾和貓的ACE2受體侵入細胞的能力降低(P<0.05)。

3 討論

目前對新冠肺炎疫情防治而言，最大的困難即是病毒不斷地發(fā)生突變，產(chǎn)生新的變異株，這些變異株都出現(xiàn)了不同程度的免疫逃逸，以及毒力和傳染性的增強。目前WHO一共命名了5種VOC，分別是Alpha株(B.1.1.7)、Beta株(B.1.351)、Gamma株(P.1)、Delta株(B.1.617.2)和Omicron株(B.1.1.529)。與之前發(fā)現(xiàn)的變異株相比，Omicron變異株具有更多的突變位點[8-9]，其中不乏一些從未出現(xiàn)過的位點，RBD是病毒中首先與細胞接觸的部分，RBD與ACE2的親和力決定了SARS-CoV-2 的傳染性[15]。Chen等[16]在Omicron的RBD上共發(fā)現(xiàn)了15個突變，包括K417N、S477N、T478K、E484A、N501Y、G339D、S371L、S373P、S375F、N440K、G446S、Q493R、G496S、Q498R和Y505H，突變位點遠超于之前發(fā)現(xiàn)的VOC，這意味著Omicron變異株的毒力和傳染性可能發(fā)生了顯著的變化[6, 14]。RBD中的一些突變是Omicron株特有的，比如G339D、S371L、S373P、S375F[4]，這可能提示在Omicron株進化的過程中，存在特有的中間宿主或潛在擴增宿主。

研究[12]表明，Omicron變異株的Q493R和Q498R突變在別的VOC中不曾出現(xiàn)，卻在小鼠來源的突變體中被發(fā)現(xiàn)，因此懷疑小鼠是Omicron變異株的重要中間宿主，推進了Omicron株的突變。本研究結(jié)果表明，在13種不同哺乳動物來源的ACE2受體中，Omicron株利用小鼠ACE2受體的能力并沒有顯著優(yōu)勢，這提示在Omicron株的進化過程中存在不止一個關(guān)鍵中間宿主。

目前已有研究[6-7]表明，Omicron變異株會造成康復(fù)患者的再次感染[6]，并且出現(xiàn)了明顯的免疫逃逸[7]。因此，不少人都認為Omicron株將給世界帶來新一輪的疫情風(fēng)暴。Omicron變異株的出現(xiàn)給全球疫情防治帶來了新的挑戰(zhàn)，其傳播能力、毒力、致病性均發(fā)生了改變。Du等[11]推測Omicron株出現(xiàn)的原因可能是某種動物群體感染了SARS-CoV-2，病毒在動物群體傳播過程中發(fā)生了適應(yīng)性進化，突變速率遠高于人類，隨后溢出傳染到人類。因此，本研究選取了Omicron變異株作為研究對象，且以在全球廣泛傳播的D614G株和Delta株作為對照，探討Omicron株利用不同動物受體侵入細胞的能力，以進一步探索其進化來源及其跨物種傳播的特性。本研究利用本實驗室獲得的多種動物來源的ACE2受體分子，結(jié)合VSV假病毒感染系統(tǒng)，證實Omicron株除了可利用人類、果子貍、穿山甲等動物的ACE2受體之外，還可以有效利用兔、小鼠、浣熊狗等動物的受體分子侵入細胞，這提示Omicron株在進化過程中可能利用了多種動物作為中間宿主。總的來說，本研究結(jié)果表明，Omicron株在Spike蛋白的大量突變并不影響其利用多種動物的ACE2作為受體分子侵入細胞的能力，這意味著Omicron存在多種可能的跨宿主傳播途徑來感染人類。