李許濤，武廣鵬，李偉觀，周碩野，田效園

（河南省煙草公司，河南 鄭州 450018）

氮素是植物生長發(fā)育必需的重要營養(yǎng)元素，對植物的物質(zhì)代謝、生化過程以及產(chǎn)品品質(zhì)等都具有重要的影響。在煙草中，氮代謝相關(guān)酶［硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）等］的活性可以直接反映煙草對氮素同化和吸收的水平［1］。周健飛等［2］的研究表明增加施氮量可使GS活性峰值推遲，且不同品種的GS活性不同。張生杰等［3］的研究表明在不同基因型烤煙間的煙葉NR活性均達(dá)到極顯著差異，與劉衛(wèi)群等［4］的研究結(jié)果相近。不同氮效率的烤煙品種的GDH活性不同，氮高效品種的GDH活性較低，增加氮用量不利于烤煙的成熟落黃［5］。同時氮代謝也會對煙葉的次生代謝產(chǎn)生影響，類胡蘿卜素和酚類化合物是煙株的主要次生代謝產(chǎn)物，亦是煙葉的重要香氣前體物質(zhì)［6-8］。劉春梅等［9］的研究表明類胡蘿卜素含量在不同基因型、氮用量處理間存在差異。酚類化合物總量在不同的煙草中有顯著差異［10］，其調(diào)制后的降解產(chǎn)物能起到增加香氣量、改善余味的作用。

此外，氮肥施用量對烤煙煙葉的成熟采烤和煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量均有重大的影響［11-12］。多酚在煙草的調(diào)制特性、色澤、等級，以及煙氣香味等各個方面起著重要作用，是衡量煙草品質(zhì)的一個重要因素，因而在提高煙葉品質(zhì)的研究中，多酚類物質(zhì)是不容忽視的［15］。在烘烤前期煙葉的變黃必須在一定含水量的條件下進(jìn)行，黃色的固定又必須通過失水干燥來實(shí)現(xiàn)［13］。多酚氧化酶的活性與烤煙品種的烘烤特性存在著極為密切的關(guān)系，且不同品種的多酚氧化酶活性與烤后雜色煙比例呈顯著正相關(guān)，在定色期多酚氧化酶的活性對煙葉的耐烤性有重要的影響［14］。目前，對云煙87、NC71氮代謝和烘烤特性的研究報道較多［16-17］，但不同氮用量對烤煙品種氮代謝及烘烤特性影響的研究報道較少。因此，筆者以南陽煙區(qū)的云煙87、NC71為試驗(yàn)材料，研究了在不同氮用量條件下烤煙氮代謝及次生代謝的差異，揭示了烤煙部分香氣前體物質(zhì)形成與氮代謝過程的內(nèi)在聯(lián)系，并且探討了在烘烤過程中水分含量和多酚氧化酶活性的變化，以期為不同烤煙品種選擇適宜的氮用量提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計

供試烤煙品種為NC71、云煙87。取煙株中部葉（從底部向上數(shù)第12～14片）進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測定。各試驗(yàn)處理設(shè)置5次重復(fù)。

氮代謝特性、烘烤特性試驗(yàn)于2018～2019年在南陽市方城縣金葉園進(jìn)行。供試地土壤類型為黃壤土，土壤pH值為7.48，有機(jī)質(zhì)含量為11.45 g/kg，堿解氮含量為55.00 mg/kg，速效磷含量為15.01 mg/kg，速效鉀含量為135.00 mg/kg?？緹煼謩e于2018年4月28日、2019年5月3日移栽。

氮代謝特性試驗(yàn)采取裂區(qū)設(shè)計，其中品種為主區(qū)，施氮量為副區(qū)。施氮量設(shè)置低氮N1（30 kg/hm2）、中 氮 N2（45 kg/hm2）、高 氮N3（60 kg/hm2）3 個處理；于移栽后110 d取樣。烘烤特性試驗(yàn)依據(jù)不同施氮量設(shè)置3個處理，在采收后按照常規(guī)三段式烘烤工藝進(jìn)行烘烤，在烘烤過程中的第0、24、48、60、72、96、120 h取樣。烤煙種植行距120 cm，株距55 cm；其他田間管理措施按當(dāng)?shù)貎?yōu)質(zhì)煙生產(chǎn)要求。

1.2 測定項(xiàng)目與方法

1.2.1 酶活性的測定 使用北京索萊寶科技有限公司提供的試劑盒測定硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）、谷氨酸脫氫酶（GDH）、多酚氧化酶（PPO）的活性。

1.2.2 其他生理指標(biāo)的測定 游離氨基酸含量采用茚三酮顯色法測定；類胡蘿卜素含量采用96%乙醇浸提法測定；煙堿含量采用乙酸萃取法測定；總酚含量采用福林酚法測定；含水量采用《YC/T 311─2009 烤煙品種烘烤特性評價》中的方法測定。

1.2.3 外觀質(zhì)量的評價 根據(jù)《GB 2635─1992烤煙》中的標(biāo)準(zhǔn)，由河南中煙公司的專家對烤后煙葉的顏色、成熟度、身份、油分、色度、葉面組織特征、柔韌性、光澤度等外觀質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行評價。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010、SPSS 20.0統(tǒng)計分析軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析、曲線擬合和方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮用量對烤煙氮代謝酶活性的影響

由表1可知：NR、GOGAT酶活性在品種間整體表現(xiàn)為云煙87＞NC71；GDH、GS酶活性表現(xiàn)為NC71＞云煙87。這說明云煙87品種煙葉在成熟期NR、GOGAT的活性較高，GDH、GS的活性較低，而NC71則相反。

表1 在不同氮用量條件下烤煙氮代謝關(guān)鍵酶活性的比較

在不同施氮量處理間氮代謝關(guān)鍵酶的活性也存在著一定的差異。NR、GS、GOGAT的活性隨施氮量的增加而升高，低氮處理的NR、GS和GOGAT的活性顯著低于中氮、高氮處理。在NC71中GDH的活性隨施氮量的增加而升高，在高氮處理下有最大值；而在云煙87中GDH的活性隨施氮量的增加先增加后降低，在中氮處理下有最大值。這說明GDH活性存在著品種與氮用量互作現(xiàn)象。

NC71在高氮處理下的NR活性與云煙87在中氮處理下的NR活性差異不顯著；NC71在高氮處理下的GOGAT活性也與云煙87在中氮處理下的GOGAT活性差異不顯著，這表明NC71的氮同化和吸收能力較云煙87弱。

2.2 不同氮用量對烤煙次生代謝的影響

由表2可以看出：游離氨基酸、煙堿和類胡蘿卜素含量在不同烤煙品種間整體表現(xiàn)為云煙87＞NC71；總酚含量在2個品種間也存在著差異，整體表現(xiàn)為NC71＞云煙105，這說明云煙87在煙葉成熟期的游離氨基酸、類胡蘿卜素、煙堿含量高于NC71。

表2 在不同氮用量條件下烤煙氮代謝及次生代謝產(chǎn)物含量的比較

在不同施氮量處理間氮代謝及次生代謝產(chǎn)物含量也存在一定的差異，其中游離氨基酸、煙堿含量隨施氮量的增加而增加；云煙87的類胡蘿卜素含量隨施氮量的增加而增加，在高氮處理下有最大值；NC71的類胡蘿卜素含量隨施氮量的增加而先增加后降低，在中氮處理下有最大值；NC71的總酚含量隨施氮量的增加而增加，在高氮處理下有最大值；云煙87的總酚含量隨施氮量的增加而先增加后降低，在中氮處理下有最大值。這說明類胡蘿卜素、總酚的含量存在著品種與氮用量互作現(xiàn)象。

NC71在高氮處理下的游離氨基酸含量與云煙87在中氮處理下的游離氨基酸含量差異不顯著；NC71在高氮處理下的煙堿、類胡蘿卜素含量均顯著低于云煙87在中氮處理下的，這說明NC71的煙株需要在高氮處理下才能進(jìn)行較好的次生代謝，而云煙87的煙株在中氮處理下就可以進(jìn)行較好的次生代謝。

2.3 不同氮用量對烘烤過程中煙葉含水量的影響

由圖1a和圖1b可以看出，在烤煙烘烤過程中煙葉含水量呈“”型曲線下降，不同品種及施氮量處理煙葉含水量的變化趨勢一致，均隨著烘烤時間的增加而呈下降趨勢。云煙87在48 h（定色期）前含水量下降較平緩，在48 h后含水量下降明顯加快，且不同施氮量處理的煙葉含水量均表現(xiàn)為N1＞N3＞N2。NC71在24 h（定色期）前含水量下降較平緩，在24 h后含水量下降明顯加快，且不同施氮量處理的煙葉含水量均表現(xiàn)為N3=N2＞N1。

根據(jù)不同品種及不同施氮量處理煙葉在烘烤過程中含水量的變化曲線（圖1），利用回歸方程y=ax3+bx2+cx+d對曲線進(jìn)行擬合，其中，y為煙葉含水量（%）；x為烘烤時間（h）；a、b、c、d為待定參數(shù)（表3）。所建立的回歸方程經(jīng)F測驗(yàn)，P值均小于0.0001，達(dá)極顯著水平，即擬合方程具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表3 不同品種在烘烤過程中煙葉含水量變化的擬合特征參數(shù)

進(jìn)一步求所建方程中時間的二階導(dǎo)數(shù)，可以計算出不同品種煙葉在烘烤過程中的失水速率。由圖1c和圖1d可以看出，不同品種及不同施氮量處理煙葉的失水速率均隨烘烤時間的增加而呈上升趨勢。云煙87的煙葉失水速率在中氮處理下最大，在低氮處理下次之，在高氮處理下最小。NC71的煙葉失水速率在高氮處理下最大，在中氮處理下次之，在低氮處理下最小。這表明不同品種在不同施氮量條件下煙葉的失水速率不同。

圖1 在不同氮用量條件下烤煙含水量和失水速率的變化（2年平均值）

2.4 不同氮用量對烘烤過程中煙葉PPO活性的影響

由圖2a、圖2b可以看出：云煙87在烘烤過程中煙葉的PPO活性呈“W”型曲線變化，NC71在烘烤過程中煙葉的PPO活性呈鏡像“N”型曲線變化；這2個品種的煙葉PPO活性均在烘烤時間0～24、72 h時出現(xiàn)高點(diǎn)，在48、96～120 h時出現(xiàn)低點(diǎn)，但云煙87在96～120 h出現(xiàn)低點(diǎn)后又有所增加。云煙87的煙葉PPO活性在中氮處理下最低，在高氮處理下次之，在低氮處理下最高。NC71的煙葉PPO活性在高氮處理下最低，在中氮處理下次之，在低氮處理下最高。

利用方程y=ax5+bx4+cx3+dx2+ex+f對圖2a、圖2b中的曲線進(jìn)行擬合，其中，y為煙葉的PPO活性［U/（g·min）］；x為烘烤時間（h）；a、b、c、d、e、f為待定參數(shù)（表4）。對所建立的各個回歸方程進(jìn)行F測驗(yàn)，結(jié)果P值均小于0.0001，達(dá)極顯著水平，即擬合方程具有統(tǒng)計學(xué)意義。

表4 不同品種在烘烤過程中煙葉PPO活性變化的擬合特征參數(shù)

進(jìn)一步求上述擬合方程中時間的二階導(dǎo)數(shù)，可以計算出不同品種煙葉PPO的積累速率。從圖2c、圖2d可以看出，不同品種及施氮量處理煙葉PPO的積累速率均隨著烘烤時間的增加而呈上升趨勢。云煙87在中氮處理下PPO積累速率最慢，NC71在高氮處理下PPO積累速率最慢。這表明不同品種在不同施氮量條件下煙葉PPO的積累速率不同。

圖2 在不同氮用量條件下煙葉PPO活性和積累速率的變化（2年平均值）

2.5 不同氮用量對烘烤過程中煙葉總酚含量的影響

由圖3a、圖3b可以看出，不同品種及不同施氮量處理煙葉的總酚含量在烘烤過程中均呈“N”型曲線變化，在烘烤時間0～48 h期間上升，之后緩慢下降，在72 h后再次上升并達(dá)到最高值。適宜的施氮量能夠有效地提高煙葉總酚的含量，云煙87在中氮處理下煙葉總酚含量最高；NC71在高氮處理下煙葉總酚含量最高。

利用方程y=ax5+bx4+cx3+dx2+ex+f對圖3a、圖3b中的曲線進(jìn)行擬合，其中，y為煙葉的總酚含量（mg/g）；x為烘烤時間（h）；a、b、c、d、e、f為待定參數(shù)（表5）。對所建立的回歸方程進(jìn)行F測驗(yàn)，結(jié)果各方程的P值均小于0.0001，達(dá)極顯著水平，即擬合方程具有統(tǒng)計學(xué)意義.

表5 不同品種在烘烤過程中煙葉總酚含量變化的擬合特征參數(shù)

進(jìn)一步求上述方程中時間的二階導(dǎo)數(shù)，可以計算出不同品種煙葉的總酚氧化速率。由圖3c、圖3d可以看出，不同品種及不同施氮量處理煙葉的總酚氧化速率均隨著烘烤時間的增加而呈上升趨勢。在不同施氮量處理下云煙87煙葉的總酚氧化速率表現(xiàn)為N1＞N2=N3，而NC71的總酚氧化速率表現(xiàn)為N2＞N1＞N3。這表明不同品種在不同施氮量條件下煙葉的總酚氧化速率不同。

圖3 在不同氮用量條件下煙葉總酚含量和氧化速率的變化（2年平均值）

2.6 不同氮用量對烤后煙葉外觀質(zhì)量的影響

由表6可知：烤煙外觀質(zhì)量各項(xiàng)指標(biāo)的評價得分在不同品種間整體差異不顯著，但在不同施氮量處理間存在著一定的差異；NC71在高氮處理下烤煙外觀質(zhì)量各項(xiàng)指標(biāo)的評價得分與云煙87在中氮處理下的差異不顯著，且顯著高于其他處理。

表6 不同施氮量處理對烤煙外觀質(zhì)量評價得分的影響

3 討論與結(jié)論

烤煙吸收的氮素以硝態(tài)氮為主。本試驗(yàn)結(jié)果表明，隨著施氮量的增加，硝酸還原酶（NR）、谷氨酰胺合成酶（GS）、谷氨酸合成酶（GOGAT）的活性均提高，這與岳紅賓［18］、高琴［19］等的研究結(jié)果相同，表明烤煙植株吸收、同化、再同化氮素的能力與施氮水平呈正相關(guān)。本試驗(yàn)在煙葉成熟期取樣，谷氨酸脫氫酶（GDH）表現(xiàn)為脫氨作用，這與前人［20-21］的研究結(jié)果一致。在不同烤煙品種間氮代謝的特性差異較大［22］，煙株葉片中的氮代謝產(chǎn)物含量也可以在一定程度上反映不同品種氮吸收、同化的差異。云煙87在成熟期的NR、GOGAT活性較高，GDH活性較低，表明其吸收、同化氮素的能力較強(qiáng)。NC71在成熟期的NR、GOGAT活性較弱，GDH活性較強(qiáng)，表明其吸收、再同化氮素的能力弱，氮素營養(yǎng)物質(zhì)的降解量較大，此研究結(jié)果與周健飛等［23］的研究結(jié)果相同。本研究還發(fā)現(xiàn)：烤煙中游離氨基酸、煙堿等氮代謝產(chǎn)物的含量亦隨著施氮水平的提高而增加［23-24］；總酚含量在不同品種間存在差異，總體表現(xiàn)為NC71＞云煙87；NC71的總酚含量隨著施氮量的增加而增加，云煙87的總酚含量則隨著施氮量的增加而先增加后減少；不同品種煙葉的類胡蘿卜素含量總體表現(xiàn)為云煙87＞NC71，進(jìn)一步說明NC71在成熟期吸收、再同化氮素的能力弱；高氮（施氮60 kg/hm2）處理有利于烤煙氮代謝及其次生代謝物的積累，從而有助于烤煙部分香氣前體物質(zhì)的形成和煙葉落黃，進(jìn)而可以改善煙葉的香氣質(zhì)量，提高煙葉的產(chǎn)量和品質(zhì)。

目前，烘烤特性多以易烤性和耐烤性來評價，烤煙品種的烘烤特性與烘烤質(zhì)量及烘烤工藝密切相關(guān)，制定適于不同品種的烘烤方法是提高煙葉質(zhì)量的前提［25］。不同烤煙品種具有不同的烘烤特性［26］。在實(shí)際生產(chǎn)中，煙農(nóng)對新品種的烘烤特性認(rèn)識不夠，容易烤壞煙葉。王傳義［27］用失水性、葉綠素降低速率和多酚氧化酶活性來綜合評價品種的烘烤特性。在烘烤過程中，煙葉的失水特性和變黃特性直接反映了易烤性。煙葉在變黃和定色期間對環(huán)境溫濕度的忍耐性反映了耐烤性［28］。本研究結(jié)果表明：云煙87在中氮條件下、NC71在高氮條件下的變黃與失水較為協(xié)調(diào)，表現(xiàn)出較好的易烤性。多酚氧化酶活性高的品種，在定色期間多酚類物質(zhì)容易發(fā)生酶促棕色化反應(yīng)，造成烤后雜色煙的比例較大［29］。在本試驗(yàn)中，各品種的PPO活性在定色期有明顯的高峰，這與蘭俊榮等［30］的研究結(jié)果一致。這可能是由于在烘烤過程中煙葉水分不斷流失，煙葉細(xì)胞裂解較快，導(dǎo)致細(xì)胞完整性被破壞［31］。從本研究定色期（72 h）的結(jié)果來看，云煙87在中氮條件下、NC71在高氮條件下多酚氧化酶的積累速率增加較緩慢，烤后煙品質(zhì)較好，耐烤性較好。