＊李振中 夏小燕 莫斯銳 李容 黃鎖義

（右江民族醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，右江民族醫(yī)學(xué)院廣西高校右江流域特色民族藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 廣西 533000）

川木瓜也稱皺皮木瓜，別名有貼梗海棠、貼梗木瓜、鐵腳海棠、鐵桿海棠、鐵腳梨、川木瓜、宣木瓜?？茖俜诸悶樗N薇科木瓜屬，是我國(guó)特有的珍稀水果之一，有很高的藥用價(jià)值和食用價(jià)值。川木瓜的功效作用為健脾消食、抗疫殺蟲、抗痙攣，具有防治高血壓、腎炎、便秘和助消化、治胃病，對(duì)人體有促進(jìn)新陳代謝和抗衰老的作用，還有美容護(hù)膚養(yǎng)顏的功效[1]。本試驗(yàn)以凌云縣特產(chǎn)川木瓜為原料探究川木瓜中總黃酮的提取工藝優(yōu)化。

1.材料與方法

(1)材料

①供試原料。薔薇科川木瓜，產(chǎn)地為廣西百色市凌云縣，使用前晾干，粉碎備用。

②主要試劑。乙醇；纖維素酶，北京索萊寶科技有限公司；亞硝酸鈉，西隴化工有限股份公司；硝酸鋁，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；氫氧化鈉，西隴化工有限股份公司；蘆丁，上海源葉生物科技有限公司。

③主要儀器。冷凝管；500mL圓底燒瓶；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-6，國(guó)華電器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-3000，上海亞榮生化儀器廠；FA1104型電子天平，上海良平儀器儀表有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；SHZ-Ⅲ A循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司。

(2)試驗(yàn)方法

①蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液配制[2]。精密稱定蘆丁0.2000g，加蒸餾水并定容至100.00mL容量瓶中，稀釋得0.20mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，于0℃條件下冷藏備用。

②樣品溶液制備。稱取廣西凌云川木瓜干粉10g和纖維素酶50mg于200mL燒杯中，再加入醋酸-醋酸鈉溶液（pH=4.5）40mL浸潤(rùn)，于50℃恒溫下攪拌45min，移入500mL圓底燒瓶中。在80℃恒溫條件下加入70%乙醇200mL回流提取90min，趁熱抽濾，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，濃縮液用水飽和正丁醇萃取，取上層液于500mL燒杯，置通風(fēng)環(huán)境下將正丁醇揮發(fā)完全，得總黃酮浸膏。取少量70%乙醇將總黃酮浸膏溶解，移到25ml容量瓶中，再用70%乙醇定容到刻度線，于0℃環(huán)境下冷藏備用。取300μl樣品溶液測(cè)定其中總黃酮化合物含量。

③確定測(cè)量波長(zhǎng)[3-4]。在兩支10.00mL容量瓶中，分別加入300μl蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液，再加入0.30mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置10min；加入0.30mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置10min；再加入1.00mL 5%氫氧化鈉溶液，加水至刻度，搖勻，放置30min。以試劑空白為參比溶液。紫外可見分光光度計(jì)在200～800nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行波長(zhǎng)掃描，結(jié)果二者均在510nm處有最大吸收，因此選擇510nm為含量測(cè)定波長(zhǎng)。

④蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[5]。精密量取0.00mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL 0.20mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液分別于10mL容量瓶中，加入0.30mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置10min；加入0.30mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置10min；再加入1.00mL 5%氫氧化鈉溶液，加水至刻度，搖勻，放置30min。于510nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，得圖1，得到回歸方程A=22.009c+0.0216，R=0.994，在試驗(yàn)測(cè)定范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

⑤總黃酮的含量檢測(cè)[6-7]。精密吸取樣品液0.30mL，置10.00mL容量瓶中，按“1.2.4”測(cè)定方法測(cè)其吸光度值，根據(jù)回歸方程計(jì)算樣品中總黃酮的含量，并計(jì)算其提取率。川木瓜中總黃酮提取率的計(jì)算公式：

⑥正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[6-8]。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)L9（3^4）探索乙醇溶液體積分?jǐn)?shù)、料液比、回流時(shí)間、加酶量四個(gè)因素對(duì)川木瓜總黃酮類化合物提取率的影響。相關(guān)設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)

2.結(jié)果與分析

(1)單因素提取試驗(yàn)

①乙醇體積份數(shù)對(duì)凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響。在回流提取中，選擇不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇作為溶劑，所得不同的提取率見圖2。根據(jù)相似相溶的原理，極性相似的情況下，川木瓜中的總黃酮類化合物與70%乙醇的極性最為接近，所以提取率最高。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)(%)對(duì)川木瓜總黃酮提取率的影響

②料液比對(duì)凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響。由圖3可以看出，在取樣原料質(zhì)量不變的前提下，提取過程中加入不同體積的乙醇對(duì)黃酮提取率也有不一樣的影響。提取率首先從1:10g/mL到1:20g/mL緩慢上升，然后從1:20g/mL到1:40g/mL逐漸下降。造成這個(gè)現(xiàn)象的原因推測(cè)是因?yàn)橐掖嫉挠昧繒?huì)影響川木瓜中提取出來的總黃酮在溶劑中的溶解，從而影響提取率。

圖3 料液比(g/mL)對(duì)凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響

③回流時(shí)間對(duì)凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響。回流時(shí)間長(zhǎng)短，對(duì)黃酮的提取也有一定的影響，隨著回流時(shí)間的變化，提取率先是上升后下降。如圖4所示，在90min前提取率緩慢上升，90min后，提取率驟降。90min前提取率低可能是因?yàn)樵线€未反應(yīng)完全，原料結(jié)構(gòu)還沒壞完全。90min后提取率低的原因可為溶解出來的總黃酮被持續(xù)的反應(yīng)破壞了。

圖4 回流時(shí)間(min)對(duì)凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響

④加酶量對(duì)凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響。在回流之前需要對(duì)原料進(jìn)行酶處理。加的酶多少，對(duì)提取率存在較大影響。由圖5可知，隨著加酶量的增加，提取率先升后降，其中加酶50mg為最佳。少于50mg，一定量的原料的細(xì)胞壁未被破壞完全，所以總黃酮溶出得少。多于50mg，加的酶過多，酶的濃度對(duì)酶的作用產(chǎn)生自身抑制，從而導(dǎo)致提取率下降。

圖5 加酶量(mg)對(duì)凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響

⑤提取溫度對(duì)凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響。從圖6看出80℃以下，總黃酮類化合物提取率一直為上升趨勢(shì)，到80℃以上的溫度提取率才緩慢下降。高溫會(huì)影響原料中分子結(jié)構(gòu)，隨著溫度升高，分子運(yùn)動(dòng)越劇烈，越容易脫離原有結(jié)構(gòu)，進(jìn)入到溶劑分子中去。溫度高于90℃時(shí)，可能由于總黃酮結(jié)構(gòu)受到高溫破壞以致提取率下降。

圖6 提取溫度(℃)對(duì)凌云縣特產(chǎn)川木瓜總黃酮提取率的影響

(2)正交試驗(yàn)結(jié)果

正交試驗(yàn)結(jié)果見表2。從表2可以看出，各因素對(duì)川木瓜總黃酮類化合物提取率影響大小依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、回流時(shí)間、加酶量，最佳提取組合為A2B1C2D3，此條件下總黃酮提取率為0.2158%，高于正交試驗(yàn)其他組合。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

(3)分析方法的評(píng)價(jià)

①精密度試驗(yàn)[9-10]。精密吸取樣品溶液0.30mL置于5個(gè)10mL容量瓶中，平行5份，按“1.2.3”的方法測(cè)定。結(jié)果RSD值為1.26%，重現(xiàn)性試驗(yàn)符合要求。

表3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

②穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密吸取樣品溶液0.30mL于5個(gè)10mL容量瓶中，平行5份，按照上述方法于0min、30min、60min、90min、120min后測(cè)定吸光度，RSD為1.25%，結(jié)果表明在120min以內(nèi)基本穩(wěn)定。

表4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

③回收率試驗(yàn)。精密吸取配置的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL，分別置10mL的容量瓶中，再分別加入“1.2.2”配制的樣品待測(cè)溶液0.30mL，分別測(cè)定其總黃酮含量，計(jì)算加樣回收率，RSD為1.38%。

表5 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.結(jié)論

采用廣西凌云縣特產(chǎn)的川木瓜作為原料進(jìn)行總黃酮提取工藝優(yōu)化探究，通過進(jìn)行單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)探索了乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、回流時(shí)間、加酶量、提取溫度對(duì)總黃酮提取率的影響。最終得出的結(jié)論是在以乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，料液比為1:10g/mL，回流時(shí)間90min，加酶量為70mg，提取溫度為80℃等的五個(gè)因素水平為最佳提取條件，提取率高，為0.2158%。本試驗(yàn)方法操作簡(jiǎn)單，重現(xiàn)性、穩(wěn)定性良好，可為廣西凌云縣特產(chǎn)川木瓜的開發(fā)提取提供優(yōu)化依據(jù)。