艾鑫，趙文君，律鳳霞

(牡丹江師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157012)

白靈菇(Pleurotusostreatus)，在我國是一個(gè)非常重要的食用菌，常常被認(rèn)為等同于阿魏菇[1]，戴玉成課題研究組從分子生物學(xué)角度鑒定表明：白靈菇為刺芹側(cè)耳獨(dú)立進(jìn)化的新分支，學(xué)名刺芹側(cè)耳托里亞種(Pleurotuseryngiisubsp.tuoliensis)，因此，白靈菇被提升為單獨(dú)的新種[2]。分類學(xué)上隸屬于菌物界、擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌目、側(cè)耳科，其子實(shí)體形似靈芝，顏色純白，故稱白靈菇[3]。白靈菇子實(shí)體較大，菌蓋直徑8～15 cm或更大，厚3～4 cm，初期近扁球形，多側(cè)生或偏生，表面近平滑偶有絨狀膜，菌肉白色，肉質(zhì)脆嫩[4]。

我國白靈菇主要分布于新疆的阿勒泰、伊犁、托里、塔城和木壘等高原地區(qū)，腐生或寄生于阿魏植物的根部或根莖處[5]。近年來，關(guān)于白靈菇在藥理作用研究方面受到廣泛關(guān)注，研究表明白靈菇具有抗氧化活性[6]、免疫活性[7]、抗腫瘤作用[8]、降血脂[9]和疲勞恢復(fù)作用[10]。目前國內(nèi)外對(duì)白靈菇的研究大多集中在營養(yǎng)成分、藥用價(jià)值和栽培技術(shù)等方面的研究，部分有關(guān)白靈菇地理分布和資源利用以及資源品質(zhì)的研究[11-13]，但關(guān)于白靈菇的分子生物學(xué)研究以及轉(zhuǎn)錄組信息和基因組數(shù)據(jù)未見報(bào)道。

本研究基于SBS(sequencing by synthesis)技術(shù)，用IIIumina Hiseq高通量平臺(tái)對(duì)白靈菇菌絲體進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序[14-15]，通過數(shù)據(jù)過濾、拼接、組裝重建形成了白靈菇轉(zhuǎn)錄組Unigene數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)與7大數(shù)據(jù)庫進(jìn)行功能注釋比對(duì)、分類以及SSR分子標(biāo)記。為今后有關(guān)白靈菇的有效成分利用、基因篩選、調(diào)控機(jī)制研究以及功能分析提供一定的理論依據(jù)[16-20]。

1 材料與方法

1.1 研究材料

白靈菇：牡丹江師范學(xué)院生科院教研室提供。

培養(yǎng)基配方：葡萄糖20%，胰蛋白胨1%，KH2PO40.1%，MgSO40.05%，VB10.03%，pH值自然。

白靈菇總RNA：白靈菇菌26 ℃150 r/min振蕩培養(yǎng)10 d過濾得菌絲球，Plant Total RNA Isolation Kit(50T)試劑盒提取總RNA，檢測提取物的濃度、完整性及污染情況，符合要求的RNA進(jìn)行測序。

1.2 白靈菇原始測序數(shù)據(jù)處理

用軟件Bcl2fastq對(duì)測序原始數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像堿基識(shí)別，lllumina內(nèi)置軟件篩選每個(gè)測序結(jié)果片段，形成原始測序數(shù)據(jù)(Pass Filter Data)[21-22]，以FASTQ文件格式儲(chǔ)存。去除3`端接頭序列，過濾低質(zhì)量數(shù)據(jù)，清除基因組污染。利用軟件Trinity(v2.2.0)對(duì)處理后數(shù)據(jù)從頭組裝，通過序列聚類對(duì)組裝結(jié)果進(jìn)一步序列拼接和清冗余處理，保留大于200bp的序列數(shù)據(jù)，獲到非冗余Unigene序列。Unigene序列與COG、GO、KEGG、Nr和Swiss-Prot等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BLAST比對(duì)，對(duì)比對(duì)的注釋基因進(jìn)行功能分類和統(tǒng)計(jì)分析。用三種SSRs預(yù)測軟件對(duì)樣本序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)預(yù)測，將共有結(jié)果保留用于下一步的引物設(shè)計(jì)[23-25]。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序數(shù)據(jù)過濾

利用Illumina測序平臺(tái)對(duì)白靈菇的液體菌球進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，數(shù)據(jù)經(jīng)過嚴(yán)格的質(zhì)量控制后過濾后數(shù)據(jù)共獲得26973356條純凈序列，共計(jì)4.02Gb個(gè)堿基，GC含量為53.09%，堿基質(zhì)量值 Q20 和 Q30 分別為 98.52%和 95.56%(表1)。以上結(jié)果說明白靈菇測序質(zhì)量較高，為后續(xù)的組裝和分析奠定了良好的基礎(chǔ)。

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量統(tǒng)計(jì)

2.2 白靈菇轉(zhuǎn)錄組測序與數(shù)據(jù)組裝

采用軟件Trinity對(duì)樣品數(shù)據(jù)進(jìn)行序列組裝，組裝結(jié)果通過序列聚類做進(jìn)一步序列拼接和去冗余處理，得到長的非冗余的Unigene序列32969條，總堿基數(shù)量57.1318 M，序列數(shù)量與長度是組裝質(zhì)量的重要評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，N50長度為2701 bp ，遠(yuǎn)大于其對(duì)應(yīng)平均長度1732.90 bp，說明組裝結(jié)果較好。統(tǒng)計(jì)Unigene數(shù)量與長度分布情況見表2。

表2 Unigene數(shù)量與長度分布統(tǒng)計(jì)

表2顯示：Unigene最小長度201bp，最大長度15498 bp，平均長度1732.90 bp，以500 bp為間距進(jìn)行分組(除200 bp以下部分)，長度在2000 bp以上的數(shù)目最多，達(dá)到11011條占比33.40%；200～500 bp占比23.83%；500～1000 bp占比17.10%；1000～1500 bp占比13.93%；1500～2000 bp占比11.74%(圖1)。

圖1 白靈菇Unigene 不同長度分布比例

2.3 Unigene的功能注釋

使用BLAST軟件將組裝得到的白靈菇Unigene對(duì)比到常用的7大數(shù)據(jù)庫(圖2)，獲得注釋Unigene共有21808條，占總Unigene的66.15%。白靈菇Unigene在不同數(shù)據(jù)庫的注釋數(shù)目有較大差異，其中注釋數(shù)目最多的是Nr數(shù)據(jù)庫，共有21664條Unigene得到注釋，占比65.71%；其次為Swiss-Prot(12542條，占38.04%)、COG(12461條，占37.80%)；白靈菇Unigene注釋數(shù)目最少的為KEGG數(shù)據(jù)庫，僅有1304條Unigene，占比3.96%。

圖 2 Unigene各數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果Venn圖

2.4 白靈菇Unigene的Nr功能注釋

白靈菇Unigene在Nr數(shù)據(jù)庫比對(duì)后同源序列注釋最多，21664條(99.34%)。同源排序前十位的物種為(圖3)：真姬菇(Hypsizygusmarmoreus)6603條同源注釋(30.48%)；Moniliophthoraroreri1117條(5.16%)；奧氏蜜環(huán)菌(Armillariasolidipes)1072條(4.95%)；光蓋裸蓋菇(Psilocybecyanescens)1028條(4.75%)；高盧蜜環(huán)菌(Armillariagallica)994條(4.59%)；熱帶紫褐裸傘(Gymnopilusdilepis)974條(4.50%)；阿太菌科FibularhizoctoniaspCBS 10969)785條(3.62%)；TermitomycesspJ132 669條(3.09%)；暗藍(lán)斑褶菇(Paneoluscyanescens)647條(2.99%)；白環(huán)菌屬的LeucoagaricusspSymC.Cos636條(2.94%)，另有32.93%的Unigene在其他物種中獲得注釋。

圖3 Unigene的Nr功能注釋物種分布Top10

2.5 白靈菇Unigene的GO功能分類分析

1.催化活性；2.結(jié)合；3.轉(zhuǎn)運(yùn)活性；4.核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；5.酶調(diào)節(jié)劑活性；6.結(jié)構(gòu)分子活性；7.抗氧化活性；8.蛋白質(zhì)結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；9.分子轉(zhuǎn)導(dǎo)活性；10.鳥苷酸交換因子活性；11.電子載流子活度；12.分子功能調(diào)節(jié)劑；13.營養(yǎng)庫活性；14.翻譯調(diào)節(jié)活性；15.蛋白標(biāo)簽；16.受體調(diào)節(jié)活性；17.金屬血紅素活性；18.趨化活性；19.化學(xué)活性；20.通道調(diào)節(jié)活性；21.細(xì)胞部分；22.細(xì)胞器；23.細(xì)胞器部分；24.膜部分；25.大分子復(fù)合物；26.膜；27.胞外區(qū)；28.膜封閉腔；29.胞外區(qū)部分；30.細(xì)胞連接；31.突觸部分；32.突觸；33.細(xì)胞外基質(zhì)；34.細(xì)胞；35.細(xì)胞外基質(zhì)成分；36.類核；37.其他有機(jī)體部分；38.膠原三聚體；39.病毒部分；40.細(xì)胞過程；41.代謝過程；42.單生物過程；43.生物調(diào)控；44.本土化；45.應(yīng)激反應(yīng)的過程；46.發(fā)展過程；47.多細(xì)胞生物進(jìn)程；48.細(xì)胞組織或生物合成；49.免疫過程；50.生長；51.生殖進(jìn)程；52.運(yùn)動(dòng)；53.信號(hào)；54.生物粘附；55.有節(jié)奏的過程；56.再生作用；57.行為；58.多細(xì)胞生物生長過程；59.細(xì)胞死亡；60.激素分泌；61.細(xì)胞聚集

白靈菇Unigene在GO數(shù)據(jù)庫中比對(duì)，主要功能分類包括細(xì)胞組成、分子功能和生物過程三個(gè)主類61個(gè)亞類(圖4)。分子功能功能主類內(nèi)含20個(gè)亞類，Unigene功能以催化活性和結(jié)合的數(shù)量最多；細(xì)胞組成主類內(nèi)含19個(gè)亞類，Unigene功能以細(xì)胞部分?jǐn)?shù)量最多，細(xì)胞器、細(xì)胞器部分和膜部分次之；生物過程主類內(nèi)含22個(gè)亞類，Unigene功能以細(xì)胞過程、代謝過程和單生物過程為主。

2.6 白靈菇Unigene的KEGG生物通路分析

1.全局和總覽圖；2.碳水化合物代謝；3.氨基酸代謝；4.脂質(zhì)代謝；5.核苷酸代謝；6.能量代謝7.其他氨基酸代謝8.輔助因子和維生素的代謝9.糖的生物合成和代謝10.萜類和多酮類化合物的代謝11.其他次生代謝產(chǎn)物的生物合成12.異生素的生物降解和代謝13.翻譯14.折疊、分類和降解15.轉(zhuǎn)錄16.復(fù)制和修復(fù)17.運(yùn)輸和分解代謝18.細(xì)胞生長和死亡19.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)20.膜運(yùn)輸

白靈菇Unigene的KEGG生物通路富集分析顯示，共有1304個(gè)Unigene得到注釋，涉及到111條生物通路。KEGG數(shù)據(jù)庫的生物通路分四大類，細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理和新陳代謝，內(nèi)含20個(gè)二級(jí)亞類。亞類中涉及新陳代謝相關(guān)通路的最多，12條通路2053個(gè)基因(67.09%)；其次是遺傳信息處理有4條通路694個(gè)基因(22.68%)、細(xì)胞過程有2條通路222個(gè)基因(7.25%)、環(huán)境信息處理有2條通路91個(gè)基因(2.97%)。

2.7 白靈菇Unigene的COG功能分類

白靈菇Unigene與COG數(shù)據(jù)庫比對(duì)顯示(圖6)：有12461條Unigene注釋到25個(gè)功能類別。一般功能預(yù)測功能注釋數(shù)目最多，有2187條(17.55%)；翻譯后的修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和分子伴侶類群等功能注釋有1204條(9.66%)；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制功能注釋有1093條(8.77%)；次生代謝產(chǎn)物的生物合成，運(yùn)輸和分解代謝功能注釋有1005條(8.07%)；細(xì)胞運(yùn)動(dòng)功能注釋有15條Unigene，僅占總數(shù)的0.12%，是注釋數(shù)目最少的類別。

A.RNA加工和修飾；B.染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和動(dòng)力學(xué)；C.能量生產(chǎn)及轉(zhuǎn)換；D.細(xì)胞周期控制，細(xì)胞分裂，染色體分裂；E.氨基酸的運(yùn)輸和代謝；F.核苷酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；G.碳水化合物的運(yùn)輸和代謝；H.輔酶的運(yùn)輸和代謝；I.脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝；J.核糖體結(jié)構(gòu)和生物起源；K.轉(zhuǎn)錄；L.復(fù)制重組和修復(fù)；M.細(xì)胞壁/細(xì)胞膜/包膜的生物發(fā)生；N.細(xì)胞運(yùn)動(dòng)；O.翻譯后的修飾，蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換，分子伴侶. P.無機(jī)離子的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝；Q.次生代謝產(chǎn)物的生物合成，運(yùn)輸和分解代謝；R.一般功能預(yù)測；S.未知函數(shù)；T.信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制；U.細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸，分泌和囊泡運(yùn)輸；V.防御機(jī)制；W.細(xì)胞外結(jié)構(gòu)；Y.核結(jié)構(gòu)；Z.細(xì)胞骨架

2.8 白靈菇SSR位點(diǎn)特征分析

白靈菇轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)共檢索到3014個(gè)SSR位點(diǎn)(圖7)，三核苷酸重復(fù)數(shù)為1869個(gè)，占SSR位點(diǎn)總數(shù)的62.01%，而三核苷酸重復(fù)中CGA/GAC重復(fù)基元最多(390個(gè))；單核苷酸重復(fù)有738個(gè)(24.49%)，C/T重復(fù)基元最多(555個(gè))；二核苷酸重復(fù)數(shù)284個(gè)(9.42%)，CG/CT重復(fù)基元最多(167個(gè))；四核苷酸重復(fù)數(shù)65個(gè)(2.16%)，TGAG/AGGG重復(fù)基元為主(46個(gè))；六核苷酸重復(fù)數(shù)最少，65個(gè)占總SSR位點(diǎn)的1.92%。

圖7 白靈菇SSR位點(diǎn)5種類型統(tǒng)計(jì)分析

3 討論與結(jié)論

白靈菇RNA轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)處理后，獲得32969條Unigene，序列平均長度1732.90bp，N50為2701bp。其中21808條Unigene被注釋到GO、KEGG、Nr和COG等7大數(shù)據(jù)庫，占總Unigene的66.15%。這些被注釋的Unigene為今后有關(guān)白靈菇的有效成分利用、基因篩選、調(diào)控機(jī)制研究以及功能分析提供一定的理論依據(jù)。此外，還有11161條Unigene未得到注釋，推測可能是白靈菇的特異性新基因、非編碼RNA序列或目前公共基因數(shù)據(jù)庫尚未完善。

白靈菇Unigene數(shù)據(jù)在Nr數(shù)據(jù)庫中注釋21664條，30.48%同源注釋到真姬菇，真姬菇與白靈菇均屬于菌物界、擔(dān)子菌門、傘菌綱、傘菌目，同目不同屬下同源基因數(shù)目較多；還有32.93%的Unigene序列未匹配到同源序列，可能由于Unigene片段較小而無法同源匹配到單數(shù)據(jù)序列。

白靈菇Unigene數(shù)據(jù)在GO功能分類中共注釋到3個(gè)主類和61個(gè)亞類，主要集中在催化活性、結(jié)合功能和細(xì)胞部分功能等。白靈菇的KEGG代謝通路富集分析主要富集在次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成、抗生素的生物合成和核糖體等路徑，表明白靈菇的生物合成表達(dá)上具有較高的基因豐度。分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于研究的各個(gè)領(lǐng)域，其中SSR位點(diǎn)是目前應(yīng)用較為廣泛的一種標(biāo)記類型。本研究挖掘到3014個(gè)SSR位點(diǎn)在不同核苷酸重復(fù)類型中均有分布，證實(shí)白靈菇基因位點(diǎn)較為豐富。本研究對(duì)白靈菇進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序及數(shù)據(jù)處理，獲得了高質(zhì)量的Unigene序列信息，經(jīng)生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)白靈菇Unigene進(jìn)行功能注釋分類、代謝通路富集分析及SSR位點(diǎn)的類型等多方面分析研究，為后續(xù)白靈菇基因組學(xué)功能研究、分子標(biāo)記輔助育種、種質(zhì)資源開發(fā)利用和遺傳多樣性修復(fù)等提供數(shù)據(jù)參考。