程嬌梅，齊祥明，郭曉華

(1.中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266000；2.青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東 青島 266000；3.山東美佳集團(tuán)有限公司，山東 日照 276826)

阿魏酸酯酶，又稱為肉桂酸酯酶，屬于羧酸酯水解酶亞類，該酶可以水解植物細(xì)胞壁中由阿魏酸、對香豆酸及二聚阿魏酸等酚酸與半纖維素和木質(zhì)素形成的酯鍵，打破它們形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，將半纖維素和木質(zhì)素分開，使纖維素酶可以與纖維素充分接觸，大大提高纖維素的降解率。因此阿魏酸酯酶可以實現(xiàn)木質(zhì)素、纖維素等的加速降解，同時還釋放出阿魏酸、對香豆酸等抗氧化活性物質(zhì)，在飼料、食品工業(yè)中具有廣泛的應(yīng)用前景[1]。

酶活力是酶制劑生產(chǎn)、應(yīng)用中的關(guān)鍵定量指標(biāo)。目前，阿魏酸酯酶的研究主要集中在產(chǎn)酶菌的篩選[2-3]、晶體結(jié)構(gòu)研究[4]、基因表達(dá)[5]、發(fā)酵條件優(yōu)化[2-6]、酶學(xué)性質(zhì)研究[7]、應(yīng)用[8-9]及與其他酶的協(xié)同作用[10]等。而這些研究中，涉及到阿魏酸酯酶酶活力測定的內(nèi)容往往過于簡單、含糊。目前可查的步驟清晰的阿魏酸酯酶酶活力測定方法還是十幾年前報道的分光光度法[11-12]，該法易受樣品中其他組分的干擾，測定準(zhǔn)確度不高，且檢測過程無法自動化，時間成本較高，無法滿足阿魏酸酯酶發(fā)酵生產(chǎn)時的檢測需求。

因此，本研究嘗試基于該酶反應(yīng)產(chǎn)物阿魏酸的液相色譜定量檢測法，確定該酶活力的檢測方法。酶活力測定的關(guān)鍵在于，通過液相色譜將底物阿魏酸甲酯和產(chǎn)物阿魏酸分離，實現(xiàn)對阿魏酸甲酯和阿魏酸兩種物質(zhì)含量的精確定量。在此基礎(chǔ)之上，我們還對該酶的酶促反應(yīng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)的研究，進(jìn)而建立了操作簡單、準(zhǔn)確可靠的酶活力測定方法，為該酶制劑的生產(chǎn)技術(shù)開發(fā)及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供酶活力檢測方法上的支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

阿魏酸酯酶：液體，由青島蔚藍(lán)生物集團(tuán)有限公司提供。

阿魏酸：≥99.5%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；阿魏酸甲酯：≥99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；甲醇、乙酸均為市售色譜純；十二水合磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉、一水合檸檬酸均為市售分析純；分析用水為自制純凈水。

1.2 儀器與設(shè)備

e2695、2489高效液相色譜儀，美國沃特世公司；PHS-3E pH計，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；TG16-WS高速離心機(jī)，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；DK-98-IIA恒溫水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；QT-1漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司。

1.3 分析方法

1.3.1酶活力定義及酶促反應(yīng)步驟

阿魏酸酯酶酶活力定義：在一定的溫度、pH值下，每分鐘產(chǎn)生1 μmol阿魏酸，定義為1個酶活力單位，用U表示。

酶促反應(yīng)步驟：取2支試管，加入1 ml稀釋后的酶液，一定溫度下預(yù)熱5 min，然后加入1 ml阿魏酸甲酯溶液，反應(yīng)一定時間，加入2 ml終止液，混勻，過0.22 μm的水系膜，用液相色譜儀測定反應(yīng)后阿魏酸含量，計算阿魏酸酯酶酶活力。

阿魏酸酯酶酶活力計算公式：

式中，U為阿魏酸酯酶酶活力，U/ml；C為通過標(biāo)準(zhǔn)曲線算得的阿魏酸濃度，mg/L；0.004為反應(yīng)總體積，L；1 000為mg與μg的轉(zhuǎn)換系數(shù)；n為樣品的稀釋倍數(shù)；194.19為阿魏酸的摩爾系數(shù)，g/mol；t為反應(yīng)時間，min；m為樣品的量，ml。

1.3.2阿魏酸含量測定

色譜條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18，流動相為甲醇∶1%乙酸溶液=70∶30，流速為1.0 ml/min，檢測波長為254 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣溫度為25℃，進(jìn)樣量為10 μl，運(yùn)行時間為5 min。

在該色譜條件下測定阿魏酸含量，對該方法的線性范圍、檢測限、定量限、重復(fù)性、加標(biāo)回收率進(jìn)行實驗。

1.3.3酶活力測定過程中最適條件探索

終止液的確定：阿魏酸在弱酸條件下具有良好的穩(wěn)定性，選擇乙酸溶液作為終止液，配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%的乙酸溶液，在37℃，反應(yīng)15 min后加入，放置0、10、20、30、60、120、150、180 min測定阿魏酸的含量，確定終止液能否徹底終止酶促反應(yīng)。

阿魏酸生成量范圍的確定：用pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸溶液將阿魏酸酯酶樣品進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋，以0.416 g/L阿魏酸甲酯為底物，在37℃下，進(jìn)行酶促反應(yīng)，測定反應(yīng)后阿魏酸含量，計算阿魏酸甲酯的殘余率和單位酶的阿魏酸生成量。

最適溫度的確定：用pH6.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制濃度為0.416 g/L阿魏酸甲酯溶液，分別在30、35、40、45、50、55、60、65、70℃條件下，進(jìn)行酶促反應(yīng)15 min，計算每個溫度下酶活力，做溫度-酶活力曲線。

最適pH值的確定：分別用pH值為2.0、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制0.416 g/L 阿魏酸甲酯溶液，在37℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)15 min，計算每個pH值下酶活力，做pH值-酶活力曲線。

1.3.4阿魏酸酯酶酶活力測定方法驗證

選取10個不同酶活力的樣品，用pH5.0的緩沖液配制濃度為0.416 g/L的阿魏酸甲酯溶液，在55℃下進(jìn)行酶促反應(yīng)，計算每個樣品的酶活力，重復(fù)測定5次，計算其RSD。

2 結(jié)果與討論

2.1 高效液相色譜定量檢測阿魏酸

實驗首先確定較優(yōu)的色譜條件：色譜柱為安捷倫ZORBAX Eclipse Plus C18，流動相為甲醇∶1%乙酸溶液=70∶30，流速為1.0 ml/min，檢測波長為254 nm，柱溫為35℃，進(jìn)樣溫度為25℃，進(jìn)樣量為10 μl，運(yùn)行時間為5 min。色譜出峰結(jié)果如圖1所示。

圖1 阿魏酸與阿魏酸甲酯色譜圖

圖1顯示，在此條件下可實現(xiàn)阿魏酸與阿魏酸甲酯的有效分離。進(jìn)一步探索可知，阿魏酸的檢測限(S/N=3)為69.15 μg/L；定量限(S/N=10)為234.78 μg/L；在測酶活力擬采用的產(chǎn)物濃度范圍10～100 mg/L內(nèi)，線性度良好，R2=0.999 9。驗證實驗結(jié)果表明，該檢測方法對阿魏酸標(biāo)準(zhǔn)樣檢測的重復(fù)性(RSD)小于1.0%；加標(biāo)回收率為99.25%。

2.2 酶活力測定最適條件探索

在確定阿魏酸及阿魏酸甲酯的定量檢測方法后，酶活的檢測則基于對特定條件下過飽和的底物阿魏酸甲酯與阿魏酸甲酯酶樣在特定條件(溫度、pH值)下反應(yīng)一定的時間(本試驗選取反應(yīng)時間為15 min)來進(jìn)行。

2.2.1終止液乙酸濃度的確定

在酶活力測試過程中，當(dāng)酶反應(yīng)到達(dá)終點需采用恰當(dāng)?shù)姆绞浇K止反應(yīng)才能為后續(xù)的反應(yīng)產(chǎn)物定量提供有效的樣品。通常酶活力測試的終止液往往采用該酶的抑制劑。因阿魏酸酯酶的抑制劑方面目前相關(guān)報道較少，因此本研究嘗試采用低pH環(huán)境(用高濃度乙酸溶液來實現(xiàn))促使蛋白質(zhì)變性的方法來終止反應(yīng)，結(jié)果如圖2。

圖2顯示，當(dāng)終止液乙酸濃度小于20%時，在其加入后的時間里，產(chǎn)物阿魏酸的含量仍呈逐步增長趨勢，說明此時不能完全終止酶反應(yīng)。乙酸濃度大于等于25%時，放置30 min，阿魏酸含量比較穩(wěn)定；對4個終止液濃度下所測得的4組阿魏酸含量進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果表明這些數(shù)據(jù)均無顯著性差異(P>0.05)，說明濃度大于等于25%的乙酸溶液能終止酶反應(yīng)。

圖2 乙酸濃度與阿魏酸含量關(guān)系圖

為了進(jìn)一步考察酶促反應(yīng)是不是徹底終止，選擇延長放置時間，結(jié)果如圖3所示。乙酸濃度為25%時，隨著時間延長，阿魏酸含量還在增加，說明酶促反應(yīng)終止的不徹底；乙酸濃度大于等于30%的3組，放置240 min，阿魏酸含量無明顯變化。顯著性分析結(jié)果表明，這3組數(shù)據(jù)在長時間背景下均無顯著性差異(P>0.05)，說明酶促反應(yīng)已被徹底終止。考慮高濃度乙酸溶液可能對儀器設(shè)備產(chǎn)生較大的損壞，最終選擇30%乙酸溶液作為終止液。

圖3 乙酸濃度與阿魏酸含量關(guān)系圖

2.2.2產(chǎn)物阿魏酸生成量控制范圍

實驗中阿魏酸甲酯加入量已提前設(shè)定，如測試體系中阿魏酸酯酶酶活較高則可能出現(xiàn)底物過飽和度不夠。根據(jù)酶反應(yīng)動力學(xué)，此時的產(chǎn)物生成量將不與酶活之間呈線性關(guān)系。本方法為防止這一問題出現(xiàn)，采用對酶樣提前稀釋的做法。根據(jù)上述機(jī)理，只要稀釋后產(chǎn)物阿魏酸的生成量得到較好的控制，則在特定阿魏酸甲酯加入量下，測試體系的反應(yīng)動力學(xué)仍在線性區(qū)。為此本研究對試驗條件下阿魏酸生成量范圍進(jìn)行了探索，結(jié)果如圖4所示。

圖4 單位酶的阿魏酸生成量

圖4所示為某待測樣品在不同稀釋倍數(shù)下的阿魏酸甲酯殘余率和單位酶的阿魏酸生成量。結(jié)果顯示，當(dāng)稀釋倍數(shù)小于7 500倍時，單位酶的阿魏酸生成量隨著稀釋倍數(shù)的增加而增加，阿魏酸甲酯殘余率也在增加(從20.8%提升至71.3%)。這首先說明稀釋倍數(shù)小于7 500倍時，阿魏酸甲酯過飽和度明顯不夠。其次，所計算出的阿魏酸生成量其實就和后續(xù)的阿魏酸酯酶酶活測量結(jié)果是線性相關(guān)，此時該數(shù)字并未穩(wěn)定，說明該區(qū)域不是可以進(jìn)行酶活測試的適宜區(qū)域。

隨著稀釋倍數(shù)的繼續(xù)增加，單位酶的阿魏酸生成量和阿魏酸甲酯殘余率均不再明顯增加，而是保持在一個比較穩(wěn)定的水平。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，這些數(shù)據(jù)已無顯著性差異(P>0.05)。在此條件下，對反應(yīng)后體系中的阿魏酸生成量進(jìn)行檢測分析，結(jié)果表明，當(dāng)該值在15～25 mg/L時，酶活測量結(jié)果(即單位酶的阿魏酸生成量)穩(wěn)定。

2.2.3溫度的確定

溫度與酶活力關(guān)系見圖5。

圖5 溫度與酶活力關(guān)系

由圖5可見，酶樣在各溫度下的活力測量結(jié)果。在30～55℃時，酶活力隨著溫度增加而增加，55℃時酶活力達(dá)到最高；在55～70℃時，酶活力隨著溫度增加逐步下降。以上數(shù)據(jù)說明，55℃是該酶樣的最適溫度。為使酶活測定結(jié)果具有盡可能高的精確度，酶活力測定過程中反應(yīng)溫度一般選擇55℃。

2.2.4pH值的確定

圖6所示為酶樣在各pH值下的活力測量結(jié)果。pH值在2.0～5.0時，酶活力隨著pH值的增加而增加，pH5.0時，酶活力測量值達(dá)到最大；pH值在5.0～8.0時，酶活力隨pH值增大而下降。以上數(shù)據(jù)說明，pH5.0是該酶最適pH值。因此，為使酶活測定結(jié)果具有盡可能高的精確度，酶活力測定過程中pH值一般選擇5.0。

圖6 pH與酶活力關(guān)系

2.3 阿魏酸酯酶酶活力測定方法驗證

在上述確定的酶反應(yīng)條件下，本實驗對10個阿魏酸酯酶樣品進(jìn)行了酶活力測定實驗，結(jié)果表明酶活力測定值的RSD均小于3.0%(見表1)，符合酶制劑檢測方法建立的要求，證明了高效液相色譜法測定阿魏酸酯酶酶活力的方法是準(zhǔn)確可靠的。

表1 阿魏酸酯酶酶活力測定方法驗證

3 結(jié)論

本研究以阿魏酸甲酯為底物，擬通過反應(yīng)后生成物阿魏酸的含量來進(jìn)行酶活測定。所研究方法首先基于Waters高效液相色譜儀(E2695、2489)，采用ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱，建立了阿魏酸定量方法。該方法以甲醇∶1%乙酸=70∶30作為流動相，等度洗脫(柱溫35℃，流速1.0 ml/min，進(jìn)樣量10 μl)，在254 nm下測定阿魏酸含量，其檢測限為69.15 μg/L，定量限為234.78 μg/L。待測酶活擬選產(chǎn)物阿魏酸的濃度在10～100 mg/L線性度良好(R2=0.999 9)，重復(fù)性(RSD)小于1.0%，加標(biāo)收回率為99.25%。

在高效液相色譜法測定阿魏酸含量的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步建立了阿魏酸酯酶酶活力測定方法。試驗首先選擇了簡便易得的乙酸溶液作為終止液，確定了終止液乙酸濃度為30%，進(jìn)而確定當(dāng)體系內(nèi)阿魏酸生成量在15～25 mg/L范圍時，酶反應(yīng)動力學(xué)處于線性區(qū)，可用于酶活測定。最后確定酶樣的最適溫度為55℃，最適反應(yīng)pH值為5.0。在該條件下，對阿魏酸酯酶酶活力測定方法進(jìn)行驗證，10個樣品酶活力測定值的RSD均小于3.0%，說明高效液相色譜法測定阿魏酸酯酶酶活力是準(zhǔn)確可靠的。