徐永軍，董舒，王昊

（咸陽市中心醫(yī)院1.骨一科，2.骨四科，陜西 咸陽 712000）

骨肉瘤是常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，具有青少年兒童發(fā)病率高、疾病進(jìn)展快、惡性程度高及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[1]。盡管手術(shù)治療與化療相結(jié)合可以提高骨肉瘤患者的生存率，但骨肉瘤患者的預(yù)后仍然不能令人滿意，尤其是在初次檢查時(shí)出現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)移的患者中[2]。表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域的新證據(jù)表明，骨肉瘤是由遺傳改變和遺傳積累引起的。腫瘤的惡性進(jìn)展取決于基因的調(diào)控，因此尋找與骨肉瘤惡性表型顯著相關(guān)及在骨肉瘤中發(fā)揮關(guān)鍵作用的基因至關(guān)重要[3]。E26轉(zhuǎn)錄因子1（E-twenty six transcription factor 1,ELK1）是屬于ETS家族和三元復(fù)合因子（ternary complex factor,TCF）亞家族的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化及存活中起關(guān)鍵作用[4]。ELK1在結(jié)直腸癌、骨肉瘤、胃癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)升高，促進(jìn)惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[5-7]，而ELK1在骨肉瘤中發(fā)揮的具體生物學(xué)功能未知。PI3K/Akt信號(hào)通路是與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)的重要調(diào)控途徑[8]，抑制其激活可作為抗腫瘤治療的有效策略[9]。因此，本文對(duì)ELK1在骨肉瘤中發(fā)揮的生物學(xué)功能及其通過調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路的作用機(jī)制進(jìn)行了初步研究，旨在獲得ELK1作為骨肉瘤治療潛在分子靶點(diǎn)的重要實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與主要試劑

骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、MG-63、HOS及正常成骨細(xì)胞hFOB11.9（中國科學(xué)院細(xì)胞庫提供），培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶（美國Hibco公司）；6孔板、96孔板及培養(yǎng)瓶（美國Coring公司），RIPA（北京索萊寶試劑有限公司），BCA蛋白檢測(cè)試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），PVDF膜（美國Promega公司），ECL發(fā)光液（美國millipore公司），ELK1 siRNA（廣州銳博生物生物技術(shù)有限公司），MTS增殖檢測(cè)試劑盒（中國北京百奧萊博科技有限公司），吉姆薩染色（上海歌凡生物科技有限公司），ELK1、pPI3K和pAkt抗體（英國Abcam公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、MG-63、HOS及正常成骨細(xì)胞hFOB11.9復(fù)蘇后重懸至含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，全濕度條件下放置在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。觀察培養(yǎng)基的顏色，變?yōu)辄S色時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，細(xì)胞融合度為95%左右時(shí)，以1∶2進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.3 Western blotting檢測(cè)ELK1蛋白相對(duì)表達(dá)量

骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、MG-63、HOS及正常成骨細(xì)胞hFOB11.9長滿后，胰酶進(jìn)行消化后收集細(xì)胞，PBS洗3次，獲得細(xì)胞斑塊，加入RIPA混勻于冰上裂解細(xì)胞10 min，4℃高速離心30 min。取4μL上清液檢測(cè)ELK1蛋白，其余的上清液移至新的EP管中，加入上樣緩沖液煮沸蛋白變性。蛋白加至SDS-PAGE凝膠中，電泳儀80 V分離蛋白，100 V轉(zhuǎn)膜（PVDF膜），PVDF膜放至8%脫脂牛奶中室溫孵育1 h，TBST洗3次，加入ELK1和內(nèi)參GAPDH一抗稀釋液4℃孵育過夜，TBST洗3次后，加入兔二抗室溫孵育1 h，ECL試劑盒顯示蛋白條帶。Image J軟件分析各組細(xì)胞中ELK1的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

對(duì)常規(guī)培養(yǎng)中ELK1蛋白相對(duì)表達(dá)量最高的骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行ELK1 siRNA感染。細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長時(shí)，胰酶進(jìn)行消化后收集細(xì)胞數(shù)，以1×105個(gè)/孔接種至6孔板中，分為si-NC組（對(duì)照）、si-ELK1-1組（ELK1干擾siRNA序列1）及si-ELK1-2組（ELK1干擾siRNA序列2）。細(xì)胞貼壁后采用Lipofectamine 2000進(jìn)行各組siRNA轉(zhuǎn)染，全濕度條件下放置在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后更換新鮮培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，按照1.3中方法檢測(cè)各組細(xì)胞中ELK1蛋白相對(duì)表達(dá)量，驗(yàn)證各組ELK1 siRNA轉(zhuǎn)染效率。

1.5 MTS實(shí)驗(yàn)

對(duì)常規(guī)培養(yǎng)中ELK1蛋白相對(duì)表達(dá)量最高的骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行MTS實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長時(shí)，胰酶進(jìn)行消化后收集細(xì)胞數(shù)，以1 000個(gè)/孔接種至96孔板中，分為si-NC組、si-ELK1-1組及si-ELK1-2組，按照1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染48 h后，向96孔板中加入30μL/孔MTS試劑，全濕度條件下放置在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2 h后，檢測(cè)各孔在490 nm波長處的OD值。細(xì)胞增殖率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)

對(duì)常規(guī)培養(yǎng)中ELK1蛋白相對(duì)表達(dá)量最高的骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長時(shí)，胰酶進(jìn)行消化后收集細(xì)胞數(shù)，以500個(gè)/孔接種至6孔板中，分為si-NC組、si-ELK1-1組和si-ELK1-2組，按照1.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染。全濕度條件下放置在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2周左右，肉眼可見克隆團(tuán)形成時(shí)終止細(xì)胞培養(yǎng)，培養(yǎng)過程中培養(yǎng)基變黃時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基。PBS洗3次，加入甲醇固定10 min，加入吉姆薩染液進(jìn)行細(xì)胞染色，掃描拍照計(jì)數(shù)各組細(xì)胞克隆團(tuán)形成數(shù)目，檢測(cè)各組細(xì)胞克隆形成能力。

1.7 PI3K/Akt信號(hào)通路檢測(cè)

收集轉(zhuǎn)染的各組細(xì)胞，按照1.3中Western blotting檢測(cè)si-NC組、si-ELK1-1組及si-ELK1-2組中PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白pPI3K和pAkt的相對(duì)表達(dá)量。

1.8 SC79處理骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)

對(duì)常規(guī)培養(yǎng)中ELK1相對(duì)表達(dá)最高的骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞呈對(duì)數(shù)生長時(shí)，胰酶進(jìn)行消化后收集細(xì)胞數(shù)，以1×105個(gè)/孔接種至6孔板中，分為si-NC組、si-ELK1組及si-ELK1+SC79組，細(xì)胞貼壁后si-NC組轉(zhuǎn)染對(duì)照siRNA、si-ELK1組轉(zhuǎn)染干擾ELK1表達(dá)效果較好的ELK1 siRNA，si-ELK1+SC79組轉(zhuǎn)染ELK1 siRNA的同時(shí)加入5μmol SC79作用48 h，采用MTS實(shí)驗(yàn)和平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖率和克隆形成能力。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間的比較用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用Dunnett-t法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ELK1在骨肉瘤細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量

Western blotting結(jié)果顯示，ELK1在骨肉瘤細(xì)胞系U2OS、MG-63、HOS中 的 表 達(dá) 分 別 為（6.12±1.05）、（2.51±0.11）和（2.99±0.13），在正常成骨細(xì)胞hFOB11.9中的表達(dá)為（0.98±0.07），多組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.155，P=0.000），與正常成骨細(xì)胞比較，ELK1在骨肉瘤細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量均升高（P＜0.05），其中，在U2OS細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量最高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 ELK1在骨肉瘤細(xì)胞系和正常成骨細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量比較（±s）

2.2 ELK1 siRNA轉(zhuǎn)染效果

選擇ELK1相對(duì)表達(dá)量最高的骨肉瘤細(xì)胞U2OS進(jìn)行ELK1 siRNA轉(zhuǎn)染，Western blotting結(jié)果顯示，ELK1在si-NC組、si-ELK1-1組及si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量分別為（1.95±0.35）、（0.85±0.08）和（0.62±0.09），3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=33.195，P=0.001）；與si-NC組比較，si-ELK1-1組和si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞中ELK1蛋白的相對(duì)表達(dá)量降低（P＜0.05），si-ELK1-2組的干擾效果較好，可進(jìn)行后續(xù)的功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)。見圖2。

圖2 ELK1 siRNA轉(zhuǎn)染效果

2.3 干擾ELK1對(duì)U2OS細(xì)胞增殖率的影響

MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-NC組、si-ELK1-1組及si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞增殖率分別為（100.00±0.00）%、（47.22±6.22）%和（35.42±5.44）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=311.746，P=0.000）；與si-NC組比較，si-ELK1-1組和si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 干擾ELK1對(duì)U2OS細(xì)胞增殖率的影響

2.4 ELK1對(duì)U2OS細(xì)胞克隆形成能力的影響

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-NC組、si-ELK1-1組及si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞克隆形成數(shù)目分 別 為（116.33±13.54）個(gè)、（69.67±6.29）個(gè) 和（36.67±8.42）個(gè)，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=49.075，P=0.000）；與si-NC組比較，si-ELK1-1組和si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞克隆形成能力降低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 干擾ELK1對(duì)U2OS細(xì)胞克隆形成能力的影響

2.5 ELK1對(duì)U2OS細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-NC組、si-ELK1-1組及si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞中PI3K和Akt蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；si-NC組、si-ELK1-1組及si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞中pPI3K和pAkt蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），si-ELK1-1組和si-ELK1-2組的pPI3K和pAkt蛋白相對(duì)表達(dá)量較si-NC組降低（P＜0.05）。見表1和圖5。

圖5 干擾ELK1對(duì)U2OS細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)通路的影響

表1 干擾ELK1對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響（±s）

表1 干擾ELK1對(duì)PI3K/Akt信號(hào)通路的影響（±s）

組別si-NC組si-ELK1-1組si-ELK1-2組F值P值PI3K 3.65±0.43 4.31±0.15 4.46±0.27 4.514 0.053 pPI3K 4.09±0.76 2.08±0.28 0.26±0.05 50.163 0.000 Akt 3.41±0.25 3.18±0.18 3.94±0.24 4.965 0.056 pAkt 4.88±0.81 1.55±0.19 1.98±0.23 41.638 0.000

2.6 ELK1調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路影響U2OS細(xì)胞增殖和克隆形成能力

采用PI3K/Akt信號(hào)通路激活劑SC79處理ELK1 siRNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)的研究。MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-NC組、si-ELK1組和si-ELK1+SC79組U2OS細(xì)胞增殖率分別為（100.00±0.00）%、（37.36±6.44）%、（56.14±7.19）%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=99.820，P=0.000），與si-NC組比較，si-ELK1組和si-ELK1+SC79組U2OS細(xì)胞增殖率降低（P＜0.05）。與si-ELK1組比較，si-ELK1+SC79組U2OS細(xì)胞增殖率增加（P＜0.05），SC79減弱ELK1對(duì)細(xì)胞增殖率的抑制作用。

平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，si-NC組、si-ELK1-1組和si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞克隆形成數(shù)目分別為（109.67±18.66）個(gè)、（35.33±6.85）個(gè)、（72.67±5.22）個(gè)，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.44，P=0.001）；與si-NC組比較，si-ELK1-1組和si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞克隆形成數(shù)目減少（P＜0.05）。與si-ELK1-1組比較，si-ELK1-2組U2OS細(xì)胞克隆形成數(shù)目增加（P＜0.05），SC79減弱ELK1對(duì)細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用。見圖6。

圖6 ELK1調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路影響U2OS細(xì)胞增殖和克隆形成能力

3 討論

骨肉瘤的發(fā)病率為3/100萬，是骨組織中最常見的惡性腫瘤[1]。骨肉瘤最常見的發(fā)病部位是股骨遠(yuǎn)端，其次是脛骨近端和肱骨長骨的干骺端。骨肉瘤通常發(fā)生在青少年中，0～24歲骨肉瘤患者的發(fā)病率為2.0%～7.6%，在所有兒童和青少年骨惡性腫瘤死亡者中，約有8.9%是由骨肉瘤引起的[10]。手術(shù)聯(lián)合放化療是骨肉瘤患者的主要治療方法，對(duì)早期患者療效較好，但是約有20%的骨肉瘤患者在初次檢查時(shí)就出現(xiàn)了肺部臨床轉(zhuǎn)移癥狀，長期生存率較差，骨肉瘤患者的5年生存率僅為60%左右[10]。骨肉瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致病死率升高，研究報(bào)道局限性早期骨肉瘤患者5年生存率為80%，而晚期骨肉瘤患者的5年生存率僅為15%～30%[11]。因此研究骨肉瘤進(jìn)展的分子機(jī)制對(duì)改善患者預(yù)后具有重要意義。骨肉瘤的發(fā)病機(jī)制是錯(cuò)綜復(fù)雜的，主要由遺傳和環(huán)境因素組成[3]。針對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展中關(guān)鍵基因的治療是新近發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤治療，即分子靶向治療，骨肉瘤的分子靶向治療仍處于研究階段，在分子水平研究骨肉瘤的惡性進(jìn)展機(jī)制是尋找抗骨肉瘤治療的關(guān)鍵途徑[12]。

E26（E-twenty six,ETS）家族是較大的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控家族之一，該家族大多數(shù)的成員在生理和病理過程中具有重要的作用，包括胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖與凋亡、細(xì)胞與細(xì)胞間的相互作用等，在包括惡性腫瘤在內(nèi)的人類疾病中發(fā)揮重要調(diào)控作用[13]。ETS家族重要調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子之一的ELK1同樣在調(diào)控細(xì)胞增殖、分化及存活過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，研究報(bào)道[14]ELK1是新型的腫瘤促癌基因，在前列腺癌中ELK1表達(dá)與較高的臨床T期、病理T期，格里森評(píng)分、預(yù)后等級(jí)及陽性淋巴結(jié)狀態(tài)相關(guān)，并是前列腺癌疾病復(fù)發(fā)的獨(dú)立預(yù)后因子。在宮頸癌中ELK1誘導(dǎo)GPC3-AS1/GPC3軸促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖和遷移[15]。而SU等[6]研究報(bào)道長鏈非編碼RNA（lncRNA）MIR100HG在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中高表達(dá)，其高表達(dá)是骨肉瘤患者預(yù)后不良因素，干擾MIR100HG的表達(dá)可抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的進(jìn)程，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制是被轉(zhuǎn)錄因子ELK1上調(diào)。因此ELK1上調(diào)促進(jìn)骨肉瘤的進(jìn)程。而本文對(duì)ELK1在骨肉瘤中的直接生物學(xué)作用進(jìn)行研究。首先Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，ELK1在骨肉瘤細(xì)胞系中的相對(duì)表達(dá)量高于其在正常成骨細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)量，并選擇ELK1相對(duì)表達(dá)最高的骨肉瘤細(xì)胞進(jìn)行干擾，MTS和平板克隆實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖能力下降，表明ELK1在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞的增殖。由于組織樣本的限制，本文未在骨肉瘤組織水平對(duì)ELK1的表達(dá)水平進(jìn)行驗(yàn)證，仍需在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行補(bǔ)充。

ELK1在骨肉瘤中發(fā)揮作用的分子機(jī)制需進(jìn)一步研究。研究報(bào)道ELK1作為轉(zhuǎn)錄因子，通過激活有絲分裂原激活的蛋白激酶（MAPK）/細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（ERK）途徑而被磷酸化并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，從而導(dǎo)致包括原癌基因c-fos下游靶點(diǎn)的調(diào)控發(fā)揮生物學(xué)功能[16]。WANG等[17]發(fā)現(xiàn)在腎透明細(xì)胞癌中ELK1可以調(diào)節(jié)NDUFA4L2的表達(dá)，參與細(xì)胞生長和死亡過程，而NDUFA4L2可能與PI3K/Akt發(fā)揮相互作用。PI3K/Akt激活可促進(jìn)腫瘤的惡性增殖，由于其密切參與多種腫瘤的各種惡性生物學(xué)行為[18-19]，PI3K/Akt可作為抗腫瘤治療的分子靶點(diǎn)，PI3K/Akt信號(hào)通路抑制劑已經(jīng)在抑制腫瘤的進(jìn)展中取得了一定的療效[20]。研究報(bào)道在骨肉瘤中PI3K/Akt信號(hào)通路也處于異常激活狀態(tài)，PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白PI3K和Akt發(fā)生磷酸化，促進(jìn)或抑制其下游通路分子的表達(dá)，以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[21-22]。本文采用Western blotting檢測(cè)ELK1的表達(dá)對(duì)骨肉瘤細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾ELK1的表達(dá)后，骨肉瘤細(xì)胞中PI3K/Akt信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白pPI3K和pAkt蛋白表達(dá)降低，表明ELK1可能通過調(diào)控PI3K/Akt促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖。并進(jìn)一步采用PI3K/Akt信號(hào)通路激活劑SC79進(jìn)行功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示SC79恢復(fù)si-ELK1組部分增殖能力，表明ELK1通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖。

綜上所述，ELK1在骨肉瘤細(xì)胞中高表達(dá)，通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞增殖的能力，ELK1可作為治療骨肉瘤的潛在靶點(diǎn)。