李嘉義，孫蔚旻，孫曉旭，孔天樂(lè)，李寶琴，劉振鴻，高品*

1.東華大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 201600；2.廣東省科學(xué)院生態(tài)環(huán)境與土壤研究所，廣東 廣州 510650

尾礦是礦產(chǎn)資源開(kāi)采過(guò)程中衍生出來(lái)的固體廢棄物。尾礦因產(chǎn)量大、有毒金屬浸出風(fēng)險(xiǎn)高而備受全球關(guān)注。據(jù)《中國(guó)礦產(chǎn)資源節(jié)約與綜合利用報(bào)告 (2018)》顯示，截至2017年底，我國(guó)尾礦的堆存量為195億噸左右（王雪峰等，2018）。尾礦往往未經(jīng)任何處理直接露天堆放，在雨水的沖刷作用下，尾礦中的有毒金屬離子會(huì)隨地表徑流匯入江河或被土壤顆粒所吸附，從而造成水體和土壤污染（程睿，2021）。例如，“世界銻都”錫礦山尾礦庫(kù)周邊土壤存在多種有毒金屬污染，其中銻、砷及汞質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高達(dá) 141.92—8733.26、14.95—363.19、0.16—5.68 mg·kg?1（孔天樂(lè)等，2020）。

自然界中的金屬礦物主要以硫化物形式存在，如黃鐵礦（FeS2）、輝銻礦（Sb2S3）、方鉛礦（PbS）等，因此尾礦環(huán)境中往往富含硫元素（黃小龍等，2018）。硫元素循環(huán)是自然界最重要的元素循環(huán)之一，其中微生物硫氧化過(guò)程是硫元素生物地球化學(xué)循環(huán)中不可或缺的部分（Cao et al.，2018）。微生物硫氧化是指硫氧化細(xì)菌將低價(jià)態(tài)的還原性硫化物或單質(zhì)硫完全氧化為硫酸鹽（SO42?）或部分氧化為更高價(jià)態(tài)的硫化物的過(guò)程（劉陽(yáng)等，2018）。硫氧化微生物廣泛存在于各種生境中，如網(wǎng)箱養(yǎng)殖區(qū)、深海熱液區(qū)、污水處理廠(chǎng)硝化污泥池等（陳小紅等，2016；林旭等，2018；曲珊珊等，2021）。已有研究表明，硫氧化微生物代謝過(guò)程會(huì)產(chǎn)生SO42?，而SO42?會(huì)加快土壤中Cr、Pb等重金屬離子的解吸，顯著增強(qiáng)其活性形態(tài)（郭朝暉等，2002）。除此以外，含硫尾礦中的硫氧化過(guò)程會(huì)導(dǎo)致尾礦酸化，進(jìn)而導(dǎo)致Cd、Hg、Ni、Pb、As等重金屬元素的活性和遷移能力提高（王存龍等，2012），加劇重（類(lèi)）金屬對(duì)環(huán)境的污染（楊濤濤等，2020）。尾礦作為硫氧化過(guò)程的熱點(diǎn)區(qū)域，會(huì)促使酸性礦山廢水的產(chǎn)生。已有研究表明，微生物可以影響黃鐵礦、砷黃鐵礦、黃銅礦、白鐵礦和閃鋅礦溶解過(guò)程中的硫氧化速率，并且微生物對(duì)硫和中間硫化合物的利用可顯著地促進(jìn)尾礦酸化和黃鐵礦溶解（Baker et al.，2003）。當(dāng)前已有的研究對(duì)硫氧化過(guò)程機(jī)制及其環(huán)境效應(yīng)進(jìn)行了初步探究，但對(duì)尾礦中硫氧化微生物的分離鑒定及其對(duì)尾礦原位環(huán)境的影響仍需進(jìn)一步解析。因此，本文圍繞尾礦中能驅(qū)動(dòng)硫氧化過(guò)程的功能微生物種群開(kāi)展研究，探討硫氧化功能微生物對(duì)尾礦酸化過(guò)程的貢獻(xiàn)，這對(duì)于尾礦治理與修復(fù)具有重要意義。

為了解析尾礦原位條件下參與硫氧化過(guò)程的關(guān)鍵微生物種類(lèi)和硫氧化過(guò)程對(duì)尾礦酸堿度的影響，本項(xiàng)目以典型礦區(qū)土壤錫礦山尾礦作為實(shí)驗(yàn)土壤，利用定向分離培養(yǎng)的方式獲得原位環(huán)境中的硫氧化微生物純菌菌株。對(duì)于分離所得純菌，通過(guò)16S rRNA和soxB基因測(cè)序等手段確定其種屬和功能基因，并驗(yàn)證其硫氧化速率。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)室模擬的方式，驗(yàn)證硫氧化過(guò)程對(duì)土壤酸化過(guò)程的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和實(shí)驗(yàn)試劑

聚苯乙烯細(xì)菌皿，規(guī)格為90 mm×15 mm，品牌為BIOLOGIX；一次性接種環(huán)，品牌為Biosharp；涂布棒，品牌為Biosharp；無(wú)菌離心管，規(guī)格為50 mL，品牌為 BIOLOGIX；核酸提取試劑盒，品牌為QIAGEN凱杰；電泳儀，型號(hào)為L(zhǎng)F-31DN；高壓滅菌鍋，型號(hào)為 MLS-3781L；恒溫振蕩器，型號(hào)為SHZ-82；生化培養(yǎng)箱，型號(hào)為L(zhǎng)RH-250；PCR擴(kuò)增儀，型號(hào)為bio-rad t100；Ged Dox xpt凝膠成像系統(tǒng)；pH計(jì)，型號(hào)為 LEICI/雷磁 PHS-3C；離子色譜儀，型號(hào)為ICS-600；升華硫（化學(xué)純），廣州化學(xué)試劑廠(chǎng)生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)土壤與培養(yǎng)基

實(shí)驗(yàn)土壤采自湖南冷水江市錫礦山（27°27′N(xiāo)，111°33′E），去除表層土壤（約1 cm）后，用消毒鐵鍬收集尾礦樣本（約1—5 cm），采集的樣品用干冰覆蓋運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。本研究分離純化所用固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基參考Huang et al.（2020）分離硫氧化菌所報(bào)道的選擇性培養(yǎng)基，其具體成分如表1所示。液體培養(yǎng)基滅菌冷卻后分裝到50 mL的無(wú)菌離心管待用，固體培養(yǎng)基在液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上另加15 g·L?1的瓊脂，而后高溫滅菌，待固體培養(yǎng)基凝固前分裝倒入平板，等其自然凝固，放于無(wú)菌操作臺(tái)中待用。

表1 硫氧化菌液體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基Table1 Sulfur-oxidizing bacteria liquid medium and solid medium

1.3 土壤微生物的分離與純化

稱(chēng)取10 g錫礦山尾礦土于無(wú)菌錐形瓶中，并加入100 mL無(wú)菌水，隨后振蕩30 min，得到土壤懸濁液。在無(wú)菌環(huán)境下，移取100 μL土壤懸濁液于固體培養(yǎng)基上，通過(guò)稀釋涂布法使土壤懸濁液均勻涂布于固體培養(yǎng)基上，并用封口膜將平板進(jìn)行密封，密封完全后將平板倒置于生化培養(yǎng)箱（27 ℃）中進(jìn)行培養(yǎng)，直至平板表面出現(xiàn)明顯菌落。隨后采用平板劃線(xiàn)法將平板中的單一菌落分離至新的固體培養(yǎng)基上，并于生化培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，以此重復(fù)傳代，直到每個(gè)平板上的菌落從形態(tài)、顏色、光滑度以及濕潤(rùn)度等特征來(lái)看均表現(xiàn)為單一菌種后結(jié)束傳代。接著用核酸提取試劑盒提取純菌的DNA，再將得到的純菌 DNA以 BoxAIR（5′-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3′）為引物進(jìn)行Box-PCR（PCR首先在95 ℃變性5 min；94 ℃變性10 s，52 ℃退火1 min，68 ℃延伸4 min，共10個(gè)循環(huán)；然后在接下來(lái)的25個(gè)循環(huán)中，每增加一個(gè)循環(huán)，延伸步驟就延長(zhǎng)10 s）。Box-PCR所得產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行電泳分析，以驗(yàn)證菌株分離純化情況。

1.4 純菌物種鑒定及其硫氧化功能基因檢測(cè)

本研究使用引物 27F（5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′）和 1492R（5′-GGTTACCTTGTTACG ACTT-3′）對(duì)純菌16S rRNA基因序列進(jìn)行擴(kuò)增，并將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送于上海生工生物工程有限公司進(jìn)行一代測(cè)序（Lilian et al.，2021）。此外，采用引物 710F（5-ATCGGYCAGGCYTTYCCSTA-3′）和 1184R（5′-MAVGTGCCGTTGAARTTGC-3′）對(duì)純菌的硫氧化soxB基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物分為兩部分，一部分通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)進(jìn)行電泳分析，另一部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送于上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序（儲(chǔ)巧玲等，2018）。測(cè)序所得序列于NCBI基因庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)對(duì)比，以獲取純菌的物種信息。同時(shí)，使用MEGAX軟件對(duì)得到的堿基序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（Alignment方式選擇 ClustalW，構(gòu)建方式選擇Maximum Likelihood），并比較分離純化得到的純菌與發(fā)育樹(shù)中各菌種之間在系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的關(guān)系和相似性。

1.5 硫氧化功能的驗(yàn)證

在無(wú)菌條件下，將分離純化得到的純菌（200 μL菌液）分別接種于含有30 mL液體培養(yǎng)基和0.1 g升華硫的無(wú)菌西林瓶中。每種純菌設(shè)置5個(gè)重復(fù)組，同時(shí)設(shè)置了3個(gè)不加菌液的空白對(duì)照組。硫氧化實(shí)驗(yàn)體系構(gòu)建完成后將西林瓶靜置放于室溫條件下，最后采用離子色譜儀對(duì)各微宇宙中SO42?濃度進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證純菌的硫氧化功能。

1.6 硫氧化微生物原位條件模擬實(shí)驗(yàn)

尾礦是礦物提取殘?jiān)c水的混合物，但由于礦石碎渣保水性較差，尾礦堆積一段時(shí)間后含水率降低，會(huì)由尾礦與水的混合形態(tài)變?yōu)闈駶?rùn)狀態(tài)。因此，為了更加真實(shí)地模擬尾礦土壤的實(shí)際狀態(tài)，本研究構(gòu)建了兩組原位條件模擬實(shí)驗(yàn)，一組為淹水處理，另一組為濕潤(rùn)處理。具體操作如下：淹水條件下，在超凈工作臺(tái)中向無(wú)菌錐形瓶中加入20 g滅菌尾礦土，1 g升華硫，并且加入50 mL無(wú)菌水使尾礦土壤完全被水淹沒(méi)，然后接種500 μL菌液于無(wú)菌錐形瓶中；濕潤(rùn)條件下，向100 mL西林瓶中加入50 g滅菌并且冷凍干燥后的干土，12.5 mL滅菌水，控制含水率在20%左右，最后加入1 g升華硫，1 mL菌液。兩組實(shí)驗(yàn)每種硫氧化微生物均設(shè)置5個(gè)重復(fù)組，同時(shí)設(shè)置3個(gè)不加菌液的空白對(duì)照組。微宇宙構(gòu)建完成后將其放于室溫條件下進(jìn)行培養(yǎng)。每間隔一段時(shí)間監(jiān)測(cè)一次pH值，并計(jì)算氫離子濃度。對(duì)于淹水處理的尾礦土pH，搖勻后直接使用pH計(jì)進(jìn)行測(cè)量；對(duì)于濕潤(rùn)處理的尾礦土，則需稱(chēng)取2 g尾礦，加入5 mL去離子水，振蕩搖晃30 min后，用pH計(jì)測(cè)量土壤浸出液的pH。

2 結(jié)果

2.1 硫氧化功能微生物分離鑒定

本研究以錫礦山尾礦土為研究對(duì)象，以還原態(tài)硫作為唯一電子供體，通過(guò)稀釋涂布平板法和平板劃線(xiàn)法成功分離得到了24株純菌?；贐ox-PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)的對(duì)比分析，確認(rèn)了12個(gè)非冗余菌株。通過(guò)16S rRNA測(cè)序和NCBI基因庫(kù)比對(duì)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這 12株非冗余純菌分別為Pseudoxanthomonasjiangsuensis、Limnobacter、Ciceribacterthiooxidans、Pseudomonasoryzihabitans、Cellvibriozantedeschiae、Methyloversatilis、Nocardioidesalbus、Microbacteriumtrichothecenolyticum、Azoarcus olearius、Thauerasp.、Stenotrophomonasrhizophila和Flavobacteriumtructae。此外，從12株純菌的硫氧化功能基因（soxB基因片段）的PCR擴(kuò)增及其瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，具有soxB硫氧化功能基因片段的純菌有兩株，如圖1所示，標(biāo)記為1和2，分別命名為Methyloversatilissp.LJY-1和Limnobactersp.LJY-2（以下分別簡(jiǎn)稱(chēng)為L(zhǎng)JY-1和LJY-2）。

2.2 純菌LJY-1和LJY-2硫氧化功能驗(yàn)證

硫氧化基因檢測(cè)結(jié)果表明，LJY-1和LJY-2兩株純菌具有硫氧化潛能。經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，在所得到的全部12株純菌中，僅LJY-1和LJY-2在試驗(yàn)條件下展現(xiàn)出硫氧化能力。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這兩株純菌的硫氧化潛力，對(duì)硫氧化微宇宙體系中SO42?濃度進(jìn)行檢測(cè)。在硫氧化體系中，發(fā)現(xiàn)前8天內(nèi)所有處理組中SO42?濃度均無(wú)明顯變化（圖2）。經(jīng)過(guò)8 d的調(diào)整期后，接種了LJY-1的處理組中SO42?濃度以 (64.55±5.90) mg·L?1·d?1的平均速率快速增長(zhǎng)，第 22天 SO42?濃度達(dá)到了 (1154.07±81.83)mg·L?1。與之相比，在培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，接種了LJY-2的處理組的 SO42?濃度為 (387.978±24.04) mg·L?1，僅略高于空白對(duì)照組 (254.78±13.63) mg·L?1。

2.3 純菌16S rRNA和soxB基因序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的建立

基于硫氧化實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，LJY-1表現(xiàn)出了較強(qiáng)的硫氧化性能。為了進(jìn)一步深入了解LJY-1，本研究對(duì)LJY-1進(jìn)行基于16S rRNA基因和soxB基因的系統(tǒng)發(fā)育分析?；?6S rRNA系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LJY-1與Methyloversatilisdiscipulorum親緣關(guān)系最近，相似性達(dá)到了99.16%（BLAST對(duì)比得到）（圖3）。除此以外，LJY-1與Pandoraea、Ralstonia、Polynucleobacter等菌屬位于同一簇上，說(shuō)明LJY-1與這些菌的相似性較高?；趕oxB基因系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明LJY-1含有兩個(gè)soxB基因片段（圖4），將其命名為Methyloversatilissp.LJY-1soxB1和Methyloversatilissp.LJY-1soxB2，還可發(fā)現(xiàn)LJY-1與Methyloversatilisdiscipulorum的相似度最高，達(dá)到了86.05%（BLAST對(duì)比得到）。

圖3 菌株Methyloversatilis sp.LJY-1基于16S rRNA基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 3 Phylogenetic tree of Methyloversatilis sp.LJY-1 based on the 16S rRNA gene homology

圖4 菌株Methyloversatilis sp.LJY-1基于soxB基因序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Figure 4 Phylogenetic tree of Methyloversatilis sp.LJY-1 based on the soxB gene homology

2.4 原位土壤硫氧化微生物對(duì)土壤酸化作用的影響

原位條件模擬實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在淹水狀態(tài)下（圖5），各處理組中pH隨著時(shí)間的推移均逐漸降低，尤其是接種LJY-1的實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)了28 d后，pH由8.05左右降至7.30左右，氫離子濃度顯著升高了 (6.10±0.35)倍，而接種 LJY-2實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組中氫離子濃度分別升高了 (4.74±0.64) 倍和 (3.51±0.10) 倍。類(lèi)似地，濕潤(rùn)狀態(tài)下（圖6）接種 LJY-1的實(shí)驗(yàn)組氫離子濃度上升幅度(3.18±0.21) 倍顯著大于接種純菌 LJY-2的實(shí)驗(yàn)組(2.79±0.16) 倍和空白對(duì)照組 (2.59±0.66) 倍。綜上所述，LJY-1對(duì)尾礦土壤酸化具有顯著促進(jìn)作用。與濕潤(rùn)狀態(tài)相比，淹水狀態(tài)下LJY-1實(shí)驗(yàn)組氫離子濃度提升更為明顯，加劇了尾礦土壤的酸化程度。

圖5 淹水狀態(tài)下微生物對(duì)土壤酸化的影響Figure 5 The influence of microorganisms on soil acidification under flooded conditions

圖6 濕潤(rùn)狀態(tài)下微生物對(duì)土壤酸化的影響Figure 6 The influence of microorganisms on soil acidification under humid conditions

3 討論

伴隨著礦石的開(kāi)采，尾礦產(chǎn)生量逐漸增多，進(jìn)而帶來(lái)一系列污染問(wèn)題（楊勇等，2015）。自然界中含硫礦物分布廣泛，種類(lèi)繁多，主要以單質(zhì)硫和化合態(tài)硫兩種形式存在。含硫礦石開(kāi)采后的尾礦含有高含量的硫化物，一般在 2.1%—2.5%之間（蘇雄，2016）。微生物硫氧化是硫元素生物地球化學(xué)循環(huán)的重要過(guò)程。硫氧化菌作為硫元素循環(huán)中不可缺少的一部分，能利用硫氧化物獲取能量，并把低價(jià)硫化物氧化為硫酸鹽，同時(shí)產(chǎn)生大量氫離子，導(dǎo)致土壤酸化，嚴(yán)重影響土壤理化性質(zhì)，尤其會(huì)促進(jìn)土壤中重（類(lèi)）金屬活性和遷移性，加劇重（類(lèi)）金屬污染（楊濤濤等，2020）。

尾礦環(huán)境中廣泛存在硫氧化微生物，soxB基因驅(qū)動(dòng)的硫氧化過(guò)程被認(rèn)為是硫氧化的基本和原始分子機(jī)制，在硫氧化過(guò)程中具有重要作用（Ghosh et al.，2009）。soxB基因編碼硫酸鹽硫酯酶或硫水解酶亞基，這是硫氧化酶系的重要組成部分，與其他物質(zhì)組成的酶復(fù)合體能催化硫單質(zhì)、硫代硫酸鹽、硫化物進(jìn)行氧化反應(yīng)生成硫酸鹽（Meyer et al.，2010）。例如，soxB基因能編碼一種硫代硫酸鹽氧化多酶，其反應(yīng)中心含有一個(gè)假錳簇，是Paracoccus pantotrophusGB 17氧化硫代硫酸鹽所必需的（Schneider et al.，1994）。因此，本研究采用分離純化技術(shù)從尾礦中成功分離純化得到 12株非冗余細(xì)菌，并結(jié)合 Box-PCR和瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì) 12株非冗余細(xì)菌的soxB基因進(jìn)行鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中兩株細(xì)菌存在soxB功能基因片段，即Methyloversatilissp.LJY-1和Limnobactersp.LJY-2，表明 LJY-1和 LJY-2具有硫氧化潛能。據(jù)報(bào)道，Methyloversatilis是一種甲基營(yíng)養(yǎng)生物，能從活性甲基化合物上將甲基催化轉(zhuǎn)移到其他化合物上，從而形成各種甲基化合物，或是對(duì)某些蛋白質(zhì)或核酸等進(jìn)行化學(xué)修飾形成甲基化產(chǎn)物（Chistoserdova et al.，2015）。Methyloversatilis存在于多種生境中，在華盛頓湖沉積物、火山口溫泉、活性污泥等環(huán)境中均被分離純化得到（Cai et al.，2011；Doronina et al.，2014；Smalley et al.，2015）。Methyloversatilis具有廣泛代謝能力，除甲醇和甲胺外，還能夠利用許多有機(jī)酸、醇和芳香族化合物（Zhang et al.，2015）。目前尚未有Methyloversatilis屬微生物具有硫氧化能力的相關(guān)報(bào)道，本研究首次發(fā)現(xiàn)Methyloversatilis屬中菌株具有硫氧化功能，這為菌株LJY-1應(yīng)用于脫硫以及有機(jī)污染物轉(zhuǎn)化提供了重要理論基礎(chǔ)。此外，Limnobacter是一種能將硫代硫酸鹽氧化成硫酸鹽而進(jìn)行化學(xué)異養(yǎng)生長(zhǎng)的微生物（Spring et al.，2001）。盡管如此，本研究結(jié)果表明，LJY-2作為L(zhǎng)imnobacter屬類(lèi)菌株，具有硫氧化功能基因卻未表現(xiàn)出明顯的硫氧化性能，這可能與硫氧化實(shí)驗(yàn)體系中未提供有機(jī)碳源，限制其生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證LJY-1和LJY-2的硫氧化功能，本研究進(jìn)行了硫氧化模擬實(shí)驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接種LJY-1的處理組中SO42?濃度快速增長(zhǎng)，而接種LJY-2的處理組 SO42?濃度在整個(gè)周期內(nèi)無(wú)明顯變化，說(shuō)明在模擬試驗(yàn)條件下，LJY-1具有快速將還原態(tài)硫氧化為硫酸根的能力。已有研究發(fā)現(xiàn)，Methyloversatilis在黃鐵礦尾礦、中性礦山排水、S2?自養(yǎng)顆粒污泥等環(huán)境微生物群落中均有分布（Kisková et al.，2018；Yang et al.，2018；Zhao et al.，2021），表明Methyloversatilis在環(huán)境中廣泛存在，且多出現(xiàn)于硫循環(huán)過(guò)程活躍的生態(tài)環(huán)境中。在本研究中，LJY-1菌株分離自錫礦山尾礦土，硫含量較高，證實(shí)Methyloversatilis可能對(duì)高硫環(huán)境具有良好適應(yīng)性。

微生物硫氧化過(guò)程加快尾礦酸化。硫氧化微生物會(huì)在金屬硫化物表面附著并形成微生物膜，在礦物-微生物膜界面微環(huán)境中存在著強(qiáng)烈的微生物氧化和化學(xué)氧化作用，兩種氧化作用相互協(xié)同、共同促進(jìn)，生成穩(wěn)定硫酸鹽的同時(shí)還會(huì)產(chǎn)生大量酸性廢水（陸現(xiàn)彩等，2019）。對(duì)于采礦業(yè)來(lái)說(shuō)，采礦增加了某些礦石暴露在空氣和水中的表面積，從而增加了產(chǎn)酸率（Baker et al.，2003）。硫氧化細(xì)菌通過(guò)協(xié)助分解硫化礦物會(huì)加速酸性礦山廢水的產(chǎn)生，進(jìn)一步造成尾礦土壤的酸化（Akcil et al.，2006）。為此，有研究使用硫氧化細(xì)菌對(duì)鹽堿土進(jìn)行改良，降低土壤 pH（張靜等，2009）。土壤酸化會(huì)促進(jìn)尾礦土壤中重金屬和類(lèi)金屬活性升高并進(jìn)行遷移，甚至?xí)茐奈驳V土壤微生物生態(tài)功能（Bolan et al.，2003）。由于礦石碎渣保水性較差，尾礦堆積一段時(shí)間后含水率降低，呈現(xiàn)濕潤(rùn)狀態(tài)。本研究設(shè)置了兩組原位條件的模擬實(shí)驗(yàn)，其中一組模擬新產(chǎn)生固液混合狀態(tài)的尾礦，另一組模擬堆放了一段時(shí)間含水率下降后濕潤(rùn)狀態(tài)的尾礦。結(jié)果顯示，在硫氧化菌作用下，尾礦土壤在淹水狀態(tài)下的酸化速度更快，酸化程度更高?；诖?，礦石開(kāi)采所產(chǎn)生的尾礦應(yīng)盡早完成礦渣與廢液的分離，減緩?fù)寥浪峄?，削弱重金屬污染物?duì)周邊環(huán)境的不利影響。

4 結(jié)論

（1）以“世界銻都”錫礦山尾礦土為研究對(duì)象，在硫氧化條件下對(duì)原位微生物種群進(jìn)行分離純化，成功獲得兩株具有硫氧化基因的純菌，分別為Methyloversatilissp.LJY-1和Limnobactersp.LJY-2。

（2）通過(guò)硫氧化驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，本研究首次發(fā)現(xiàn)了Methyloversatilis中的菌種具有硫氧化功能。

（3）基于硫氧化微生物原位條件模擬實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了Methyloversatilissp.LJY-1驅(qū)動(dòng)的硫氧化過(guò)程，特別是在淹水條件下，會(huì)顯著加快尾礦酸化過(guò)程。