劉紅梅，海香，安克銳，張海芳，王慧，張艷軍，王麗麗，張貴龍，楊殿林

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191

土壤是陸地生態(tài)系統(tǒng)重要的有機(jī)碳庫(kù)，土壤有機(jī)碳固存相關(guān)研究已成為全球農(nóng)田生產(chǎn)力、生物多樣性和固碳減排等相關(guān)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問(wèn)題之一。根據(jù)政府氣候變化專(zhuān)門(mén)委員會(huì)（IPCC）統(tǒng)計(jì)，全球每年的固碳潛力高達(dá)4.3 Pg CO2，其中90%來(lái)自土壤對(duì)大氣CO2的固存（Smith et al.，2008）。增加土壤有機(jī)碳的固存量，既可提高土壤肥力，又可降低土壤CO2釋放，促進(jìn)農(nóng)田土壤向大氣CO2的“匯”轉(zhuǎn)變（Karl-Heinz et al.，2017）。土壤對(duì)大氣 CO2的固定主要是土壤自養(yǎng)微生物參與的同化過(guò)程（陳曉娟等，2014）?？栁难h(huán)是自養(yǎng)微生物同化CO2的最主要途徑（Berg，2011），該過(guò)程中起關(guān)鍵作用的酶是 1, 5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶（RubisCO）。cbbL是RusbisCO的編碼基因之一，具有高度保守性，常作為環(huán)境中卡爾文循環(huán)自養(yǎng)固碳微生物群落多樣性的標(biāo)記物（Nanba et al.，2004；劉瓊等，2017），已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者應(yīng)用到生物固碳分子生態(tài)學(xué)研究中（Tolli et al.，2005；高靜等，2018；蘇鑫等，2020）。

農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)是陸地生態(tài)系統(tǒng)中受人為干擾最大同時(shí)也是固碳潛力最大的碳庫(kù)之一（Simth，2004）。施肥通過(guò)改變土壤養(yǎng)分（李倩等，2018）而改變微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性（陸海飛等，2015；劉紅梅等，2020），進(jìn)而影響土壤微生物的 CO2的固定能力（陳曉娟等，2014）和作物產(chǎn)量（俄勝哲等，2018）。Yuan et al.（2013）通過(guò)功能基因cbbL分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)，稻田土壤cbbL具有高的多樣性，且其與碳同化速率呈顯著正相關(guān)關(guān)系。土壤固碳酶（RusbisCO）活性高，表明土壤自養(yǎng)微生物同化 CO2的潛力高（陳曉娟等，2014）。Selesi et al.（2005）研究發(fā)現(xiàn)，施用化學(xué)肥料和混合堆肥后小麥田土壤cbbL基因群落組成和多樣性發(fā)生了明顯改變。Yuan et al.（2012）研究表明，長(zhǎng)期施肥導(dǎo)致農(nóng)田土壤碳同化自養(yǎng)種群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了明顯差異，固碳優(yōu)勢(shì)菌群也發(fā)生了相應(yīng)變化。張雙雙等（2019）研究表明，土壤pH、有機(jī)碳、總氮等土壤因子是影響固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異的主要影響因子。研究不同施肥措施下土壤固碳細(xì)菌群落變化和引起其變化的主控土壤理化因子，對(duì)明晰不同施肥措施下農(nóng)田土壤固碳機(jī)制和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

華北平原是我國(guó)主要的糧食主產(chǎn)區(qū)，以小麥/玉米輪作一年兩熟制為主要種植制度，在保障我國(guó)糧食生產(chǎn)中起著重要作用。但該地區(qū)存在過(guò)量施氮現(xiàn)象，易造成氮素?fù)]發(fā)損失、面源污染等環(huán)境問(wèn)題，如何在合理施肥同時(shí)提高土壤固碳潛力需要科學(xué)數(shù)據(jù)支持。目前，長(zhǎng)期不同施肥措施對(duì)華北農(nóng)田土壤固碳細(xì)菌微生物群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響還不明確。為此，本研究以農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所武清野外科學(xué)試驗(yàn)站長(zhǎng)期定位試驗(yàn)中小麥-玉米輪作農(nóng)田為研究對(duì)象，利用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)，研究不同施肥措施對(duì)華北農(nóng)田土壤卡爾文循環(huán)功能基因cbbL群落結(jié)構(gòu)多樣性的影響及與土壤理化性質(zhì)間的關(guān)系，以期為提高土壤固碳潛力和農(nóng)業(yè)可持續(xù)管理提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所武清野外科學(xué)試驗(yàn)站（39°21′N(xiāo)，117°12′E）。屬溫帶半濕潤(rùn)大陸性季風(fēng)氣候，四季分明。年平均氣溫11.6 ℃，年均降水量520—660 mm，年平均無(wú)霜期為196—246 d。土壤類(lèi)型為潮土。試驗(yàn)開(kāi)始前土壤基本理化性質(zhì)為：土壤全氮1.18 g·kg?1，全磷0.72 g·kg?1，全碳 10.83 g·kg?1，硝態(tài)氮 19.95 mg·kg?1，銨態(tài)氮 5.06 mg·kg?1，速效磷 18.6 mg·kg?1，pH 7.58。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

自2010年開(kāi)始長(zhǎng)期試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)6個(gè)施肥處理：對(duì)照A0（不施肥），單施有機(jī)肥A1（有機(jī)肥15 t·hm?2），氮肥減量配施有機(jī)肥 A2（有機(jī)肥 15 t·hm?2，N 基肥 55.2 kg·hm?2、追肥 36.8 kg·hm?2，P2O581.0 kg·hm?2，K2O 75.0 kg·hm?2），常量化肥配施有機(jī)肥 A3（有機(jī)肥 15 t·hm?2，N 基肥 117.3 kg·hm?2、追肥 78.2 kg·hm?2，P2O581.0 kg·hm?2，K2O 75.0 kg·hm?2），氮肥增量配施有機(jī)肥A4（有機(jī)肥15 t·hm?2，N基肥 172.5 kg·hm?2、追肥 115.0 kg·hm?2，P2O581.0 kg·hm?2，K2O 75.0 kg·hm?2），單施化肥A5（N 基肥 117.3 kg·hm?2、追肥 78.2 kg·hm?2，P2O581.0 kg·hm?2，K2O 75.0 kg·hm?2）。小區(qū)面積為 400 m2，各小區(qū)間隔50 cm，每個(gè)處理3次重復(fù)。有機(jī)肥由牛糞和雞糞混合堆腐而成，氮含量為0.69%，P2O5含量為0.65%，K2O為0.38%。氮肥為尿素（N，46.4%），磷肥為過(guò)磷酸鈣（P2O5，12%），鉀肥為硫酸鉀（K2O，50%）。每年 9月底玉米收獲后，有機(jī)肥和磷鉀肥全部作基肥和氮肥 60%作基肥在冬小麥播種時(shí)一次性施入，在小麥拔節(jié)期追施40%氮肥。6月初小麥?zhǔn)斋@后，有機(jī)肥和磷鉀肥全部作基肥和氮肥 60%作基肥在夏玉米播種時(shí)一次性施入，玉米小喇叭口期追施40%氮肥。其他田間管理同一般大田生產(chǎn)。種植制度為典型的冬小麥-夏玉米輪作。

2019年9月底在玉米收獲期采集土壤樣品。用直徑為5 cm土鉆，在每個(gè)小區(qū)內(nèi)按照“S”型取樣法選取5個(gè)點(diǎn)，采集0—20 cm土壤樣品，用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室。去除根系、凋落物和其他雜質(zhì)，將土壤樣品分成兩份，一份于?20 ℃冷凍保存，用于土壤微生物和速效養(yǎng)分分析；另一份土樣室內(nèi)自然風(fēng)干，用于其他土壤理化性質(zhì)測(cè)定。

1.3 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤 pH 采用玻璃電極法（水土比為 2.5?1），土壤有機(jī)碳測(cè)定采用重鉻酸鉀外加熱法，土壤全氮采用凱氏定氮法，土壤全磷采用鉬銻抗比色法，土壤銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量采用 2 mol·L?1氯化鉀溶液提取-流動(dòng)分析儀（AA3，德國(guó)）測(cè)定，土壤速效磷采用碳酸氫鈉提取-鉬銻抗比色法（鮑士旦，2000）。土壤微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸-K2SO4提取法測(cè)定（吳金水等，2006）。

1.4 土壤DNA提取、PCR擴(kuò)增及MiSeq測(cè)序

土壤DNA提取采用Power Soil? DNA Isolation Kit試劑盒提取，稱(chēng)取0.5 g土樣，提取步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取后的土壤總DNA用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，使用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop 2000，德國(guó)）進(jìn)行質(zhì)檢。采用Qubit 2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)提取的DNA進(jìn)行精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。采用巢式PCR進(jìn)行擴(kuò)增，第一輪引物為cbbL-F（GACTTCA CCAAAGACGACGA）和cbbL-R（TCGAACTTGA TTTCTTTCCA），第二輪引物為cbbL-F（ACCAYCA AGCCSAAGCTSGG）和cbbL-R（GCCTTCSAGCTT GCCSACCRC）。使用梯度PCR儀（Eppendorf，德國(guó)）進(jìn)行PCR產(chǎn)物的擴(kuò)增。采用25 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系，包含 12.5 μL 2×Taq Plus Master Mix，3 μL BSA（2 ng·μL?1），1 μL 正向引物（5 μM），1 μL 反向引物（5 μM），2 μL 模板 DNA和 5.5 μL ddH2O。第一輪擴(kuò)增：94 ℃ 5 min，30 個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 60 s），最后72 ℃延長(zhǎng)7 min。第二輪擴(kuò)增：94 ℃ 5 min，20個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，52 ℃30 s，72 ℃ 60 s），最后72 ℃延長(zhǎng)7 min。每個(gè)樣本3個(gè)重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后，用2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，利用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收 PCR產(chǎn)物，Tris-HCl緩沖液洗脫，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖電泳檢測(cè)。使用Qubit 2.0熒光定量系統(tǒng)測(cè)定回收產(chǎn)物濃度，將等摩爾濃度的擴(kuò)增子匯集到一起，混合均勻后進(jìn)行測(cè)序。

1.5 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析

測(cè)序由北京奧維森基因科技有限公司完成，利用Illumina MiSeq PE300平臺(tái)上機(jī)測(cè)序。下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Trimmomatic和Flash軟件預(yù)處理，去除低質(zhì)量reads，然后根據(jù)PE數(shù)據(jù)之間overlap關(guān)系將成對(duì)的 reads拼接成一條序列。去除 tags兩端的barcode序列及引物序列，去除嵌合體及其短序列等后得到高質(zhì)量的 clean tags，拼接過(guò)濾后的 clean tags，在0.97相似度下利用Qiime和Vsearch軟件進(jìn)行可操作分類(lèi)單元（Operational taxonomic unit，OTU）聚類(lèi)分析。對(duì)比 GreenGenes數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)每個(gè)OTU進(jìn)行物種注釋。α多樣性是對(duì)單個(gè)樣品物種多樣性的分析，基于OTU的結(jié)果，計(jì)算Chao1指數(shù)、觀測(cè)值指數(shù)（Observed species）、譜系多樣性指數(shù)（phylogenetic diversity，PD whole tree）和香農(nóng)指數(shù)（Shannon）來(lái)進(jìn)行生物多樣性分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析（one-way ANOVA），利用韋恩圖比較樣本間 OTU相似性，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）比較不同處理土壤固碳細(xì)菌群落的差異，利用CANOCO 4.5軟件對(duì)土壤固碳細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌屬水平相對(duì)豐度與土壤化學(xué)性質(zhì)冗余分析（redundancy analysis，RDA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施肥措施下土壤化學(xué)性質(zhì)變化

長(zhǎng)期不同施肥改變了土壤化學(xué)性質(zhì)（表1）。5種施肥處理的pH值均顯著低于對(duì)照A0（P<0.05）。A1、A2、A3和A4的總有機(jī)碳含量顯著高于對(duì)照A0，A5的總有機(jī)碳含量顯著低于對(duì)照A0（P<0.05）。5種施肥處理的土壤全氮和硝態(tài)氮含量均顯著高于對(duì)照（P<0.05）。A2、A3和A5處理的銨態(tài)氮含量顯著高于對(duì)照（P<0.05），A1和A4處理的銨態(tài)氮含量與對(duì)照 A0無(wú)顯著差異（P>0.05）。A1、A2、A3和 A4的全磷和微生物量氮含量顯著高于對(duì)照A0（P<0.05），A5的全磷、微生物量碳和微生物量氮含量與對(duì)照A0無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表1 不同施肥措施下土壤化學(xué)性質(zhì)Table 1 Soil chemical properties in different fertilization treatments

2.2 不同施肥措施下土壤固碳細(xì)菌群落多樣性

α多樣性主要關(guān)注均勻生境下的物種數(shù)目（劉茗等，2021），適合本研究土壤固碳細(xì)菌多樣性的描述。Chao1、Observed species和PD whole tree指數(shù)均可反映樣品中群落的豐富度，其值越大表明樣品中固碳細(xì)菌群落物種的豐富的越高。Shannon指數(shù)表示群落多樣性，其值越大表明固碳細(xì)菌群落多樣性越高。由圖1可知，A1、A2、A3和A4處理的Chao1、Observed_species指數(shù)高于對(duì)照A0，A5處理的Chao1、Observed_species指數(shù)低于對(duì)照A0，但各處理間均無(wú)顯著差異（P>0.05）。各處理的PD_whole_tree指數(shù)均無(wú)顯著差異。A1和A3處理的 Shannon指數(shù)高于對(duì)照 A0，A4和 A5處理的Shannon指數(shù)低于對(duì)照 A0但各處理間均無(wú)顯著差異（P>0.05）。土壤固碳細(xì)菌α多樣性與土壤化學(xué)因子的相關(guān)性分析結(jié)果見(jiàn)表2。土壤固碳細(xì)菌Shannon指數(shù)與pH呈顯著正相關(guān)（P<0.01），與土壤硝態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01）。表明影響土壤固碳細(xì)菌Shannon多樣性指數(shù)的主要土壤環(huán)境因子是土壤pH和硝態(tài)氮含量。

表2 土壤固碳細(xì)菌群落α多樣性與土壤化學(xué)因子之間的相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis between soil CO2-assimilating bacterial α-diversity index and soil chemical properties

圖1 不同施肥措施下土壤固碳細(xì)菌群落多樣性Figure 1 Community diversity of CO2-assimilating bacteria in different fertilization treatments

2.3 不同施肥措施下土壤固碳細(xì)菌群落組成及相對(duì)豐度

在97%序列相似度水平下有12798個(gè)OTU，每個(gè)樣品的OTU數(shù)量從504—575個(gè)不等。研究所得序列主要被歸為3個(gè)門(mén)、4個(gè)綱和18個(gè)屬。不同施肥措施下土壤固碳細(xì)菌群落在門(mén)、綱、屬水平上的組成及相對(duì)豐度見(jiàn)圖2。以門(mén)作為分類(lèi)學(xué)水平，變形菌門(mén)Proteobacteria為cbbL微生物優(yōu)勢(shì)菌，各處理相對(duì)豐度92.83%—94.98%。A1、A2和A3處理的變形菌門(mén)相對(duì)豐度與對(duì)照A0相比無(wú)顯著差異，A4和A5處理顯著降低了變形菌門(mén)的相對(duì)豐度。以綱作為分類(lèi)學(xué)水平，優(yōu)勢(shì)菌綱為γ-變形菌綱Gammaproteobacteria、α-變形菌綱 Alphaproteobacteria和β-變形菌綱Betaproteobacteria，相對(duì)豐度分別為 53.75%—65.80%、16.46%—25.89%和12.28%—18.54%。與對(duì)照A0相比，A2、A3、A4和A5處理顯著降低了γ-變形菌綱相對(duì)豐度；A1處理的γ-變形菌綱相對(duì)豐度低于A0處理，但無(wú)顯著差異。α-變形菌綱相對(duì)豐度，A2、A4和A5顯著高于A0，A1和A3與A0無(wú)顯著差異。β-變形菌綱相對(duì)豐度，A3顯著高于 A0，A5顯著低于A0，A1、A2和A4與A0無(wú)顯著差異。

圖2 不同施肥措施下土壤固碳細(xì)菌群落在門(mén)（a）、綱（b）、屬（c）水平上的組成及相對(duì)豐度Figure 2 Soil CO2-assimilating bacteria community composition and relative abundance at phylum (a), class (b)and genus (c) level with different fertilization treatments

以屬作為分類(lèi)學(xué)水平，各處理均大于 2%的優(yōu)勢(shì)菌屬有堿湖生菌屬Alkalilimnicola（14.12%—19.34%）、堿螺菌屬Alkalispirillum（6.91%—14.54%）、Brevirhabdus（4.18%—14.95%）、紅桿菌屬Rhodobacter（6.54%—9.27%）、Sulfurifustis（5.73%—7.03%）、Marichromatium（3.41%—6.32%）、Diploblechnum（ 4.37%—6.41%）、Sulfuricaulis（2.54%—4.91%）和Thioalkalivibrio（2.87%—6.03%）。與對(duì)照A0相比，A1、A2、A3、A4和A5處理顯著降低了Alkalispirillum和Thioalkalivibrio相對(duì)豐度，顯著提高了Brevirhabdus相對(duì)豐度。A1、A2、A3、A4、A5處理的Sulfurifustis、Marichromatium和Sulfuricaulis相對(duì)豐度與對(duì)照A0相比均無(wú)顯著差異。

2.4 不同施肥措施下土壤固碳細(xì)菌群落組間差異

PCA分析是指運(yùn)用方差分解的方法，將不同數(shù)據(jù)組的差異反映在二維坐標(biāo)圖上，如果兩個(gè)處理距離越近，則表示這兩個(gè)樣品的組成越相似。不同施肥處理之間有顯著差異OTUs豐度的PCA圖如圖3所示，前兩個(gè)主成分分別占細(xì)菌群落變異的31.36%和13.71%。A3、A4、A5位于主成分1右側(cè)，而對(duì)照A0、A1和A2位于主成分1左側(cè)。表明，A3、A4和A5處理有顯著差異OTUs豐度組成相似，而A0、A1和A2處理有顯著差異OTUs豐度組成相似。5個(gè)施肥處理差異OTUs與對(duì)照處理差別顯著，且A3、A4和A5處理與對(duì)照A0、A1和A2處于不同排序區(qū)。說(shuō)明連續(xù) 10年常量化肥配施有機(jī)肥、氮肥增量配施有機(jī)肥和單施化肥處理對(duì)土壤固碳細(xì)菌群落產(chǎn)生了顯著影響。

圖3 不同施肥處理固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的主成分分析Figure 3 Principal components analysis of the soil CO2-assimilating bacteria community structure in different fertilization treatments

2.5 固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤理化因子的冗余分析

為進(jìn)一步分析不同土壤理化因子對(duì)土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，選取土壤具有代表性的優(yōu)勢(shì)菌屬（相對(duì)豐度平均值大于 2%）為物種變量、土壤理化性質(zhì)為環(huán)境變量進(jìn)行冗余分析（圖4）。結(jié)果表明，第一排序軸和第二排序軸分別解釋了76.9%和11.2%的變異，前兩軸共解釋了固碳細(xì)菌群落總變異的88.1%。第一排序軸與土壤pH呈正相關(guān)，與有機(jī)碳、全氮、全磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、微生物量碳和微生物量氮呈負(fù)相關(guān)；第二排序軸與有機(jī)碳、全氮、全磷、硝態(tài)氮、微生物量碳和微生物量氮呈正相關(guān)，與 pH、銨態(tài)氮呈負(fù)相關(guān)。土壤 pH（F=9.969，P=0.002）、全氮（F=10.775，P=0.002）、全磷（F=8.160，P=0.004）、硝態(tài)氮（F=21.608，P=0.002）、銨態(tài)氮（F=7.598，P=0.002）、微生物量碳（F=14.063，P=0.002）、微生物量氮（F=5.631，P=0.010）對(duì)土壤固碳細(xì)菌屬水平達(dá)到顯著影響，有機(jī)碳（F=3.124，P=0.062）對(duì)土壤固碳細(xì)菌屬水平未達(dá)到顯著影響。

圖4 土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤化學(xué)性質(zhì)間的冗余分析Figure 4 Redundancy analysis between CO2-assimilating bacteria community structure and soil chemical properties

3 討論

本研究利用Illumina MiSeq PE300高通量測(cè)序技術(shù)分析華北農(nóng)田土壤固碳細(xì)菌多樣性發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期單施化肥和氮肥增量配施有機(jī)肥的Shannon多樣性指數(shù)低于不施肥對(duì)照。這與Qin et al.（2021）對(duì)貝加爾針茅草原長(zhǎng)期高氮添加試驗(yàn)研究結(jié)果一致。Zhao et al.（2018）研究表明，土壤中高含量的有效氮會(huì)增加固碳微生物多樣性。本研究結(jié)果與這一研究結(jié)論不一致。這可能是因?yàn)楦叩砑訉?dǎo)致土壤中可利用性氮素含量增多，導(dǎo)致喜氮微生物生長(zhǎng)迅速。相關(guān)性分析表明，土壤固碳細(xì)菌Shannon多樣性指數(shù)與硝態(tài)氮含量呈極顯著負(fù)相關(guān)性，也說(shuō)明了這一點(diǎn)。Huang et al.（2018）研究表明，水稻田土壤有效氮含量與cbbL細(xì)菌豐度有顯著相關(guān)性。施肥對(duì)cbbL基因豐度的影響與種群變化規(guī)律不完全一致，與不施肥對(duì)照相比，單施有機(jī)肥、單施化肥及有機(jī)肥與化肥配施均可以提高OUTs豐度，特別是單施有機(jī)肥物種豐度最高。這是由于肥料施用后，土壤中的營(yíng)養(yǎng)元素含量增加，土壤pH下降，土壤養(yǎng)分的有效性提高，為土壤中自養(yǎng)固碳細(xì)菌提供了所需的營(yíng)養(yǎng)元素以及豐富的碳源和能源。Zhou et al.（2019）研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)28年氮添加試驗(yàn)，固碳微生物多樣性與氮素添加量呈顯著正相關(guān)關(guān)系。由于陸地生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境異質(zhì)性，因而不同環(huán)境中土壤固碳微生物多樣性對(duì)不同氮添加水平、氮添加年限、地上植物群落組成的響應(yīng)不一致。

不同長(zhǎng)期施肥措施對(duì)土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了顯著的影響。本研究中所獲得優(yōu)勢(shì)菌門(mén)為變形菌門(mén)，變形菌門(mén)在土壤中占最大比例，這與其他研究結(jié)論一致（Zhou et al.，2019；劉瓊等，2017；蘇鑫等，2020）。本研究發(fā)現(xiàn)，與不施肥對(duì)照相比，氮肥增施配施有機(jī)肥和單施化肥顯著降低了變形菌門(mén)相對(duì)豐度，A1、A2、和A3處理的變形菌門(mén)相對(duì)豐度無(wú)顯著變化。本研究中γ-變形菌綱Gammaproteo bacteria為土壤中的優(yōu)勢(shì)綱，這與蘇鑫等（2020）在松嫩平原鹽堿耕地研究結(jié)果一致。這可能是由于γ-變形菌綱細(xì)菌噬鹽微生物較多，而本研究試驗(yàn)區(qū)土壤pH在8.19—8.71之間，適宜該微生物群落生長(zhǎng)。本研究中，氮肥增量配施化肥和單施化肥處理顯著提高了α-變形菌綱 Alphaproteo bacteria相對(duì)豐度。戴雅婷等（2017）研究也表明，在植被修復(fù)和長(zhǎng)期施肥過(guò)程中α-變形菌綱的豐度不斷上升。

本研究發(fā)現(xiàn)不同施肥處理的土壤固碳細(xì)菌群落差異顯著，A1、A2、A3、A4和A5處理土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與對(duì)照A0發(fā)生了顯著變化，說(shuō)明連續(xù) 10年施肥改變土壤固碳細(xì)菌生境條件，從而引起微生物群落結(jié)構(gòu)的變化。常量化肥配施有機(jī)肥、氮肥增量配施有機(jī)肥和單施化肥處理的與不施肥對(duì)照、單施有機(jī)肥和氮肥減量配施有機(jī)肥之間差異顯著。RDA分析可直接清楚的反應(yīng)土壤環(huán)境因子對(duì)研究區(qū)土壤固碳細(xì)菌群落特征的影響。從 RDA結(jié)果判斷驅(qū)動(dòng)土壤固碳細(xì)菌變化的因子發(fā)現(xiàn)，土壤固碳微生物群落結(jié)構(gòu)受pH、全氮、全磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、微生物量碳和微生物量氮含量的顯著影響。pH可以通過(guò) H+濃度改變土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的形態(tài)從而影響自養(yǎng)微生物類(lèi)群（Stockdale et al.，2002；劉瓊等，2017）。本研究發(fā)現(xiàn)，土壤有機(jī)碳對(duì)土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)無(wú)顯著影響，這與Xiao et al.（2014）和劉瓊等（2017）對(duì)水稻田的研究結(jié)果不一致。碳同化微生物對(duì)土壤特性和環(huán)境因子變化敏感，不同研究者研究結(jié)論不一致，推測(cè)可能是由于作物類(lèi)型、土壤質(zhì)地和施肥量不同造成的（Yuan et al.，2012；劉瓊等，2017）?？梢?jiàn)，有機(jī)碳對(duì)土壤固碳微生物的調(diào)控機(jī)制并不具有普遍性。本研究表明，有機(jī)肥和無(wú)機(jī)肥連續(xù)施用引起土壤 pH和養(yǎng)分變化是土壤固碳微生物群落和多樣性變化的重要原因。不同施肥措施使得土壤環(huán)境養(yǎng)分發(fā)生了改變影響了對(duì)環(huán)境變化敏感的自養(yǎng)微生物的生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)，從而導(dǎo)致了碳同化功能微生物種群結(jié)構(gòu)的變化。

4 結(jié)論

（1）連續(xù) 10年過(guò)量施用氮肥配施有機(jī)肥和單施化肥處理降低了土壤固碳細(xì)菌Shannon多樣性指數(shù)。土壤pH和硝態(tài)氮含量是影響土壤固碳細(xì)菌群落α多樣性重要因素。

（2）連續(xù) 10年不同施肥措施下，華北平原農(nóng)田土壤固碳細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度發(fā)生改變，這種改變?cè)陂T(mén)、綱和屬分類(lèi)水平上均有體現(xiàn)。單施有機(jī)肥、氮肥減量配施有機(jī)肥未顯著改變土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，常量化肥配施有機(jī)肥、氮肥增量化肥配施有機(jī)肥和單施化肥顯著改變土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。

（3）連續(xù) 10年不同施肥措施下，顯著改變了土壤理化因子，這些土壤環(huán)境因子的變化進(jìn)一步影響了土壤固碳細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，其中 pH、全氮、全磷、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、微生物量碳和微生物量氮含量的差異是影響固碳微生物群落特征形成的主要影響因子。