王宏欣付 蘇淳雪莉張 帆?

(1.成都上錦南府醫(yī)院,四川大學華西醫(yī)院上錦醫(yī)院神經(jīng)外科,成都 510117;2.四川大學華西醫(yī)院,成都 510117)

膠質瘤是成年人最常見的原發(fā)性惡性腦腫瘤,近年來形成了以手術切除為主,配合以放化療的綜合治療體系,但膠質瘤患者的生存率并沒有顯著提高[1]。 尤其對惡性度較高的IV 級膠質瘤,也被稱為多形性膠質母細胞瘤(GBM),患者的中位生存期僅為一年[2]。 因此,迫切需要開發(fā)出新的更有效的生物標志物來及早診斷及治療腦膠質瘤。 miRNAs是一種內源性的非編碼小RNA 分子,約有18~25個核苷酸,通過與靶信使RNAs(miRNAs)3’-非翻譯區(qū)(3’-UTR)的互補序列結合,在轉錄后調節(jié)其靶基因的表達[3-4]。 越來越多的證據(jù)表明,miRNAs 在各種人類癌癥中調控失調,并參與腫瘤發(fā)生過程,包括細胞增殖、凋亡、血管生成和侵襲[5-6]。 以前的研究結果已經(jīng)在人腦膠質瘤中發(fā)現(xiàn)了幾個致癌和抑瘤的miRNAs,如miR-10b[7]、miR-30[8]、miR-203[9]等。 這些特異的miRNAs 可以潛在地作為有效的生物標志物來提高診斷和預后的準確性,或者作為針對惡性腦瘤的新的治療策略的靶點。 但關于miR-4539 在腦膠質瘤中的研究很少,因此,本研究探討了miR-4539 抑制膠質瘤細胞生長的效應及相關機制,以期為腦膠質瘤的診斷、治療提供更多潛在的靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

SPF 級雌性免疫缺陷裸鼠(BALB/C-null),4 周齡,20 只,體重20~22 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司[SCXK(京)2017-0033],飼養(yǎng)于海南醫(yī)學院動物實驗中心[SYXK (瓊)2017-0033]。實驗室內溫度約為25℃,相對濕度為50%~60%,每日12 h /12 h 明暗交替,實驗前適應性飼養(yǎng)1 周。實驗研究過程按照3R 原則,動物實驗開展前獲得本院實驗動物倫理委員會審批(IACUC-2019-324)。

1.1.2 組織樣本及細胞系

腦膠質瘤患者新鮮腫瘤組織取自我院神經(jīng)外科,新鮮膠質瘤標本離體后立即冷凍于液氮中,保存于-80℃進行核酸提取。 所有的組織病理學診斷都是由兩位經(jīng)驗豐富的神經(jīng)病理學家根據(jù)世界衛(wèi)生組織的標準獨立確定的。 瘤患者在術前均未接受過化療或放療,8 個非腫瘤性腦組織是在交通事故中死亡的個人同意的情況下通過收集捐贈獲得的,并且被證實沒有任何先前的病理損害。 本研究由中國醫(yī)科大學倫理委員會批準。 正常腦膠質細胞株HEB 及腦膠質瘤細胞U87、U251、U373、T98G、LN18、LN229 和SF295 均購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心,在添加10%胎牛血清和青霉素/鏈霉素(100 U/mL)的Eagle’s 培養(yǎng)基中培養(yǎng)。 細胞在37℃含5% CO2的孵育箱中孵育。

1.2 主要試劑與儀器

慢病毒載體(上海吉滿生物科技有限公司);MirVana miRNA 試劑盒(上海覓拓生物科技有限公司);熒光素酶報告分析系統(tǒng)試劑盒(美國Santa Cruz 公司);Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);BCA 蛋白定量試劑盒(上海晶抗生物工程有限公司);cyclinD1 蛋白、cyclinE1蛋白、Ser780 蛋白、Foxp1 蛋白多克隆抗體(艾美捷生物公司);TaKaRa RNA PCR 試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)。 實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)儀(杭州博日科技有限公司);光學顯微鏡(日本Olympus 公司);Western blot 垂直電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 RT-PCR 檢測

RT-PCR 定量分析根據(jù)MirVana miRNA 試劑盒說明書的操作步驟進行。 從冷凍的膠質瘤組織和膠質瘤細胞系中提取總RNA,測定RNA 濃度。 合成cDNA 后進行定量實時PCR,以RNU6B 作為內源性對照,用非腫瘤性腦組織進行校正。 為評價miR-4539 轉染膠質瘤細胞后Foxp1 mRNA 表達的變化,采用TaKaRa RNA PCR 試劑盒和SYBR PreMix Ex TaqII 試劑盒進行cDNA 合成和實時定量PCR,GAPDH 作為內源性對照。 所有反應均重復3 次。用2-ΔΔCt法計算相關基因mRNA 表達的相對定量。引物序列見表1。

表1 目的基因的引物序列Table 1 Primer sequence of target gene

1.3.2 慢病毒載體、質粒構建及轉導

從miRBase 數(shù)據(jù)庫獲得miR-4539 成熟序列。用限制性內切酶EcoRI 線性化GV217 載體(Ubi-EGFP-MCS)。 將含有成熟miR-4539 序列的片段導入GV217 載體的多克隆位點。 使用HEK-293T 包裝細胞,采用脂質體2000 制造病毒。 慢病毒載體在-80℃保存直至使用。 為了實現(xiàn)靶向高表達,將人Foxp1cDNA 克隆到pcDNA3.1 載體中。 將膠質瘤細胞株T98G 細胞和LN18 細胞接種于6 孔板中。 當細胞融合達到30%時,分別用1 μL 的miR-4539 慢病毒載體(滴度:3×108TU/mL)或1 μL 的慢病毒載體(滴度:3×108TU/mL)感染細胞。 感染后14 h 更換細胞培養(yǎng)液。 分別于感染后24、48、72 h 用倒置熒光顯微鏡觀察膠質瘤細胞株中綠色熒光蛋白(GFP)的表達情況,評價其感染效率,轉導后72 h熒光蛋白表達水平相對較高。 質粒轉染按脂質體3000 轉染試劑廠家說明書進行。

1.3.3 小鼠模型構建及檢測指標

小鼠被安置和維持在層流櫥柜中,自由飲食水。 將穩(wěn)定轉染的T98G 細胞(miR-4539 和miRNC)按每0.2 毫升5×106個的密度注射到裸鼠腋下。 每周用游標卡尺測量腫瘤大小1 次,用公式V=(D×d2)/2 計算腫瘤體積,其中D 為最長直徑(mm),d 為最短直徑(mm)。 6 周后處死小鼠,稱量腫瘤重量并拍照。

1.3.4 雙熒光素酶報告實驗

HEK-293T 細胞以每孔1×104細胞密度接種于96 孔板。 將3’-UTR 質粒共轉染HEK-293T 細胞。轉染48 h 后收集細胞裂解產物,用雙熒光素酶報告分析系統(tǒng)測定熒光素酶活性。 將相對的Renilla 熒光素酶活性進行歸一化,作為轉染效率的內對照。

1.3.5 CCK-8 檢測及流式細胞檢測

CCK-8 檢測:培養(yǎng)24 h 后收集轉染細胞,懸浮于DMEM 中,以3×103個/孔的密度接種于96 孔板中。 于接種后不同時間點(0、24、48、72 h)檢測細胞增殖情況。 在這些特定的時間,每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液進行檢測。 在37℃孵育2 h 后,在450 nm 處測定光密度(OD)值。 流式細胞檢測:應用Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡。 轉染后48 h 胰蛋白酶消化細胞,冰PBS 洗滌。 將這些細胞重新懸浮在100 μL 的結合緩沖液中,并用5 μL 的Annexin V-FITC 和5 μL 的碘化丙啶處理。 在室溫黑暗中孵育20 min 后,用流式細胞儀對細胞進行分析。

1.3.6 Western blot 檢測

收集各組細胞后提取總蛋白,BCA 法測定蛋白濃度。 混合上樣緩沖液,煮沸變性,電泳、轉膜、封閉、一 抗/二 抗 孵 育、 ECL 法 顯 影 定 影。 通 過Quantity One 軟件分析條帶強度,以GAPDH 為內參,檢測cyclinD1 蛋白、cyclinE1 蛋白、Ser780 蛋白、Foxp1 蛋白的表達。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù),計量資料均以平均數(shù)±標準差(±s)描述,多樣本計量資料比較采用方差分析,兩兩樣本比較采用SNK-q檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miR-4539 在膠質瘤組織中的表達

RT-PCR 檢測結果顯示,與正常腦組織比較膠質瘤組織中miR-4539 的表達水平明顯降低(P<0.05)。miR-4539 在7 個常用的人腦膠質瘤細胞系(U87、U251、U373、T98G、LN18、LN229 和SF295)中的表達量明顯低于人正常腦膠質細胞株HEB(P<0.05),圖1。

圖1 miR-4539 在膠質瘤組織及細胞系中的表達Figure 1 Expression of miR-4539 in glioma tissues and cell lines

2.2 miR-4539 過表達對膠質瘤細胞增殖活性的影響

與miR-NC 組相比,miR-4539 組中的miR-4539表達水平、OD450在T98G 細胞和LN18 細胞中均明顯增加(P<0.05),EDU 染色結果顯示,miR-4539 轉染的T98G 細胞和LN18 細胞的EDU 摻入率明顯低于相應的miR-NC 組細胞,圖2。

2.3 miR-4539 過表達對膠質瘤細胞周期的影響

與miR-NC 組相比,miR-4539 組G0/G1 期細胞百分率增加,S 期細胞百分率及cyclinD1、cyclinE1和Ser780 蛋白表達均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),圖3。

注:A:miR-4539 相對表達量;B:miR-4539 對T98G 細胞和LN18 細胞活性的影響;C:Edu 染色檢測miR-4539 對T98G 細胞和LN18 細胞增殖的影響。圖2 miR-4539 過表達對膠質瘤細胞增殖活性的影響Note. A, Relative expression level of miR-4539. B, Effects of miR-4539 on T98G and LN18 cell activities. C, Edu staining was used to detect the effects of miR-4539 on proliferation of T98G cells and LN18 cells.Figure 2 Effect of overexpression of miR-4539 on proliferation of glioma cells

注:A:流式細胞檢測各組細胞G0/G1 期和S 期細胞百分率;B:Western blot 檢測各組周期蛋白的表達。圖3 miR-4539 過表達對膠質瘤細胞周期的影響Note. A, Percentage of G0/G1 and S phase cells in each group was detected by flow cytometry. B, Western blot was used to detect cyclin expression in each group.Figure 3 Effect of miR-4539 overexpression on glioma cell cycle

2.4 Foxp1 作為miR-4539 的直接靶點的鑒定

與 pGL3-FOXP1 3’-UTR-mut/NC 相 比,pGL3-FOXP1 3’-UTR-mut/miR-4539 熒光素酶活性明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0. 05);pGL3-FOXP1 3 ’-UTR-wt/miR-4539 與 pGL3-FOXP1 3’-UTR-wt/NC 的熒光素酶活性無明顯差異(P>0. 05),圖4。

注:1:pGL3-FOXP1 3’-UTR-mut/NC;2:pGL3-FOXP13’-UTR-mut/miR-4539;3: pGL3-FOXP1 3’-UTR-wt/miR-4539; 4pGL3-FOXP1 3’-UTR-wt/NC。圖4 Foxp1 作為miR-4539 的直接靶點的鑒定Note. 1, pGL3-FOXP1 3’-UTR-mut/NC. 2, pGL3-FOXP1 3’-UTRmut/miR-4539. 3, pGL3-FOXP1 3’-UTR-wt/miR-4539. 4, pGL3-FOXP1 3’-UTR-wt/NC.Figure 4 Identification of Foxp1 as a direct target for miR-4539

2.5 轉染miR-4539 對小鼠腫瘤生長抑制作用

miR-4539 組裸鼠腋下移植瘤平均體積及腫瘤的平均重量明顯低于miR-NC 組,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),圖5。

圖5 轉染miR-4539 對小鼠腫瘤生長抑制作用Figure 5 Inhibitory effect of miR-4539 transfection on tumor growth in mice

2.6 miR-4539 對膠質瘤細胞中Foxp1 的調控作用

與miR-NC 組相比,miR-4539 組T98G 和LN18膠質瘤細胞中Foxp1 mRNA、蛋白表達水平均明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);免疫熒光分析發(fā)現(xiàn),miR-4539 降低了Foxp1 在T98G 細胞和LN18細胞中的表達,圖6。

注:A:Foxp1 mRNA 相對表達量;B:Western blot 檢測各組Foxp1 蛋白表達;C:免疫熒光檢測Foxp1 蛋白表達。圖6 miR-4539 對膠質瘤細胞中Foxp1 的調控作用Note. A, Relative expression level of Foxp1 mRNA. B, Foxp1 protein expression in each group was detected by Western blot. C, Foxp1 protein expression was detected by immunofluorescence.Figure 6 Regulatory effect of miR-4539 on Foxp1 in glioma cells

3 討論

研究表明,miRNAs 在各種人類癌癥中通過調節(jié)靶基因表達水平而發(fā)揮癌基因或腫瘤抑制因子的功能,如miR-141、miR-196、miR-155、miR-34a、miR-326 和miR-184 被發(fā)現(xiàn)參與了膠質瘤的細胞增殖、凋亡和侵襲等幾個關鍵過程[10]。 此外,這些失調的miRNAs 還被證明對診斷和預測預后以及對膠質瘤患者的最終治療干預具有重要價值。 然而,miR-4359 在膠質瘤中的臨床意義和生物學功能尚不清楚。 本研究中,我們發(fā)現(xiàn)miR-4359 在膠質瘤組織和細胞系中的表達明顯低于在非腫瘤性腦組織或細胞系中的表達。 這些結果提示miR-4359 可能作為一種腫瘤抑制因子負向調節(jié)膠質瘤的發(fā)生。因此,我們進一步評估了miR-4359 對膠質瘤細胞增殖的影響。結果表明,miR-4359 過表達可顯著抑制膠質瘤細胞增殖,誘導細胞周期阻滯,促進細胞凋亡。 我們還發(fā)現(xiàn)miR-4359 在體內對膠質瘤細胞的致瘤性有抑制作用。

為了確定miR-4359 調節(jié)膠質瘤生長的機制,我們使用公開可用的在線算法(TargetScan、Miranda 和PITA)預測了它的目標基因,并通過執(zhí)行微陣列分析、Western blot 和熒光素酶分析最終確定,miR-4359 負調控其靶基因Foxp1 在膠質瘤細胞中的表達。 Foxp1 是Foxp 轉錄因子基因家族的成員,包括43 個人類基因,參與轉錄調節(jié)和DNA 修復,并在免疫反應、器官發(fā)育和癌癥發(fā)病機制中發(fā)揮關鍵作用。 與其他家族成員相似,Foxp1 具有多種功能,例如調節(jié)B 細胞發(fā)育、單核細胞分化、促進心臟瓣膜和肺發(fā)育等[11]。 此外,根據(jù)細胞類型的不同,Foxp1可作為癌癥驅動因子或腫瘤抑制因子參與調節(jié)各種人類癌癥的發(fā)生。 Foxp1 的表達缺失最初報道在幾種類型的實體腫瘤中,如結腸癌[12]和乳腺癌[13]。作為癌基因,Foxp1 在B 細胞淋巴瘤中直接抑制廣泛的促凋亡基因。 最近的一項研究表明[14],在B 細胞淋巴瘤、結直腸癌和黑色素瘤等不同的人類癌癥中,Foxp1 是Wnt/β-catenin 信號通路的轉錄增強子。 然而,Foxp1 在腫瘤發(fā)生中的作用及其在膠質瘤中的臨床意義仍然知之甚少。 Gomez 等[15]人發(fā)現(xiàn),Foxp1 高表達預示膠質母細胞瘤患者生存率較低,沉默F(xiàn)oxp1 的表達則可抑制腫瘤的生長,因此,Foxp1 可能在腦膠質瘤中起到了癌基因的作用。 在本研究中,通過RT-PCR 和Western blot 檢測發(fā)現(xiàn),當T98G 細和LN18 細胞過表達miR-4539 后,Foxp1 mRNA 和蛋白表達都顯著降低,這表明在腦膠質瘤中,Foxp1 可被miR-4359 直接靶向并下調,并且Foxp1 在功能上參與了miR-4359 介導的腫瘤生長抑制。 但miR-4359/Foxp1 對具體的下游信號討論的影響仍值得進一步研究。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),miR-4359 通過直接調節(jié)轉錄因子Foxp1 的表達抑制腫瘤生長,抑制膠質瘤細胞增殖。 我們的結果證實了miR-4359 在膠質瘤中作為一種腫瘤抑制性miRNA 的作用,并提示miR-4359 可能成為治療膠質瘤的新靶點。