黃錦陽，吳凡，袁靈梅，曾志奎，戈陽華，熊偉，郭靈，潘斌

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，南昌330004；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，南昌330006）

節(jié)段性骨缺損的重建具有挑戰(zhàn)性，其治療難度大、周期長、失敗率及致殘率高，困擾著臨床骨科醫(yī)生[1-2]。傳統(tǒng)的治療方法為：骨缺損＜5 cm多采用自體骨移植，而骨缺損＞5 cm的修復(fù)方法包括帶血管自體腓骨移植和牽張成骨技術(shù)，但均存在一定的局限性[3-5]。Masquelet等[6]于2000年首次描述的誘導(dǎo)膜技術(shù)，已被臨床證明是重建節(jié)段性骨缺損的有效手段。相關(guān)基礎(chǔ)研究[7-8]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)膜組織含有豐富的血供，并可分泌大量生長因子。豐富的血供對成骨至關(guān)重要，因新生血管在運(yùn)輸營養(yǎng)及排泄細(xì)胞代謝的垃圾的同時(shí)，可提供成骨所需的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 （Mesenchymal Stem Cells，MSCs）。最新研究[9]表明slit-RoBo信號通路在血管新生、干細(xì)胞調(diào)節(jié)等多個(gè)生理功能中起作用，且成骨細(xì)胞通過SHN3/SLIT3軸參與了CD31hiEmcnhi血管偶聯(lián)成骨的過程。Gruber HE等[10]研究發(fā)現(xiàn)在誘導(dǎo)膜及新生骨組織中含有大量的成骨細(xì)胞，說明在誘導(dǎo)膜技術(shù)中很可能存在著slit-RoBo信號通路調(diào)控CD31hiEmcnhi偶聯(lián)成骨機(jī)制。中藥骨碎補(bǔ)具有補(bǔ)腎壯骨功效，在促進(jìn)骨形成與骨修復(fù)方面療效確切，同時(shí)具有促進(jìn)誘導(dǎo)膜局部血管新生的作用。然而，骨碎補(bǔ)總黃酮對誘導(dǎo)膜技術(shù)骨重建的干預(yù)機(jī)制和靶點(diǎn)尚不清楚，有待進(jìn)一步探究。本研究通過建立大鼠股骨Masquelet誘導(dǎo)膜模型并采用骨碎補(bǔ)總黃酮干預(yù)，檢測局部成骨、血管新生和slit-RoBo信號通路相關(guān)關(guān)鍵細(xì)胞因子的表達(dá)，研究結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 材料 實(shí)驗(yàn)采用48只SD大鼠（雄性SPF級），鼠齡8～10周，體重約260～280 g（由江西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號SCXK[(贛)（2018-0003）]。大鼠分籠飼養(yǎng)，溫度22～24℃，4只/籠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)過程中對動(dòng)物的處置遵照中華人民共和國科學(xué)技術(shù)部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》標(biāo)準(zhǔn)，采用過量麻醉處死，動(dòng)物尸體交由江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心處理。器材與試劑：自制不銹鋼大鼠股骨6孔鋼板及截骨導(dǎo)板，直徑1.5 mm皮質(zhì)骨自攻螺釘（江蘇百舍醫(yī)療器械有限公司），總RNA提取試劑盒（上海Promega公司），PMMA骨水泥（國械注進(jìn)20143656033），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國Thermo公司）。藥物：強(qiáng)骨膠囊(北京岐黃制藥有限公司生產(chǎn)，國藥準(zhǔn)字Z20030007，0.25 g/粒，有效成分為骨碎補(bǔ)總黃酮)，青霉素（主要成分青霉素鈉，80萬U/瓶，國藥準(zhǔn)字H13020657）。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及造模前準(zhǔn)備 依據(jù)體重分層結(jié)果隨機(jī)分為空白組、模型組、中藥中劑量組、中藥高劑量組4個(gè)組，每組12只（前期實(shí)驗(yàn)已表明中藥中、高劑量組對誘導(dǎo)膜作用效果確切)。術(shù)前禁食24 h，不禁水。按體重予2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉（0.2 mL/100 g），左側(cè)大腿青霉素8萬U肌肉注射預(yù)防感染。

1.2.2 手術(shù)步驟 一期造模方法同筆者前期所發(fā)表文獻(xiàn)[11]的手術(shù)步驟，除空白組外均放置骨水泥進(jìn)行曠置。二期造模：于骨水泥曠置6周后進(jìn)行，術(shù)前準(zhǔn)備同前。75%乙醇消毒大鼠尾巴，鋪無菌單，縱行切開，取兩節(jié)段大鼠尾骨，剝離尾骨上附著組織、剪碎。沿大鼠右大腿原切口小心切開誘導(dǎo)膜，取出PMMA骨水泥塊，于骨缺損區(qū)填充剪碎的尾骨粒（見圖1），小心縫合誘導(dǎo)膜組織，防止尾骨粒散開，關(guān)閉傷口，8周后取材進(jìn)行指標(biāo)檢查。

圖1 造模及植骨過程

1.2.3 術(shù)后處理 術(shù)后禁食12 h，正常進(jìn)水。每期手術(shù)后連續(xù)5 d，肌注青霉素8萬U以預(yù)防感染。單籠飼養(yǎng)，5 d后予同組合籠。

1.2.4 藥物干預(yù) 按動(dòng)物等效服藥量按體表面積計(jì)算，為78.75 mg（mg-1·d-1）。因此干預(yù)濃度分別為：高濃度157.5 mg（mg-1·d-1）、中濃度78.75 mg（mg-1·d-1）。使用純水制成對應(yīng)濃度溶液灌胃，按預(yù)期每500 g體重灌胃2 mL，予等量純水對空白組、模型組大鼠進(jìn)行灌胃。灌胃時(shí)間為二期植骨術(shù)后第2 d至第8周取材當(dāng)天，1次/d。

1.3 指標(biāo)檢查

1.3.1 X線拍攝 二期植骨術(shù)后8周拍攝實(shí)驗(yàn)側(cè)股骨標(biāo)準(zhǔn)正、側(cè)位X片。拍片結(jié)果采用Lane-Sandhu法進(jìn)行影像學(xué)評分，見表1。

表1 La ne-Sa ndhu X射線評分表

1.3.2 PCR檢測新生骨組織中CD31、Emcn、slit3、ROBOm R NA的表達(dá) 每個(gè)樣本稱取100 mg左右冰凍新生骨組織液氮研磨成粉末狀，采用Trizol提取樣本組織總RNA，紫外分光光度計(jì)測定總RNA純度濃度。熒光定量PCR檢測新生骨組織中相關(guān)mRNA的表達(dá)情況，反應(yīng)條件如下：95℃15 min，95℃15 s，60℃60 s延伸，40個(gè)循環(huán)，溶解曲線確認(rèn)產(chǎn)物是否為特異性擴(kuò)增。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采?。ā纒），行正態(tài)性檢驗(yàn)后，滿足正態(tài)分布的組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析；不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)則采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)期間所有大鼠未出現(xiàn)死亡，4只大鼠傷口縫線在術(shù)后第1 d裂開，經(jīng)對癥處理后順利愈合，亦無螺釘松動(dòng)等并發(fā)癥。

2.1 X線檢查結(jié)果 空白組可見少量骨痂形成，不足骨缺損區(qū)域25%；模型組成骨約占骨缺損區(qū)域50%，骨折線部分消失，但重建皮質(zhì)薄弱；中藥中劑量組可見骨形成占缺損75%以上，骨折線模糊，尚見少許骨皮質(zhì)未連續(xù)；中藥高劑量組則骨形成充滿缺損區(qū)，骨折線消失及骨皮質(zhì)重建可（見圖2）。

圖2 各組大鼠股骨缺損區(qū)成骨X線比較

2.2 新生骨組織相關(guān)基因RT-PCR相對表達(dá)量模型組較空白組CD31、Emcn、slit3、ROBO m R NA的表達(dá)提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而中藥中、高劑量組相關(guān)基因的表達(dá)相比模型組明顯上調(diào)（P＜0.05），見圖3。

圖3 各組新生骨組織中CD31、Emcn、s lit3、ROBOm R NA的表達(dá)

3 討論

傳統(tǒng)“二元調(diào)控”理論認(rèn)為，成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞功能偶聯(lián)調(diào)控骨形成與重建過程。但最新研究[12-13]發(fā)現(xiàn)成骨的微環(huán)境除成骨、破骨外，還與骨內(nèi)血管新生有密切關(guān)系，其中CD31hiEmcnhi血管可調(diào)節(jié)骨內(nèi)微血管生長、產(chǎn)生獨(dú)特的新陳代謝和分子微環(huán)境，可維持血管周圍的骨組細(xì)胞和偶聯(lián)成骨，是具有調(diào)節(jié)成骨作用的新成員。

Slit-Robo細(xì)胞信號通路廣泛存在于生物體內(nèi)，與神經(jīng)發(fā)育、血管生成、組織器官發(fā)育以及干細(xì)胞的增殖調(diào)節(jié)等均有關(guān)。Slit3是成骨細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一種SHN3新型配體，最早發(fā)現(xiàn)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，可通過ROBO受體來調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突的生長，被證實(shí)為大鼠模型和人體組織工程中的促血管新生因子。既往研究[14-15]發(fā)現(xiàn)Schnurri3調(diào)節(jié)蛋白（adaptor protein Schnurri3，SHN3）可抑制成骨細(xì)胞活性，敲除SHN3基因小鼠模型可以募集大量的造血元素到骨痂處以致形成成熟的板層骨，這說明成骨細(xì)胞亦通過SHN3/SLIT3軸參與了CD31hi-Emcnhi血管偶聯(lián)成骨的過程。誘導(dǎo)膜含有豐富的血管網(wǎng)，并存在大量的成骨細(xì)胞，故我們認(rèn)為在誘導(dǎo)膜骨重建過程中很可能存在Slit-Robo信號通路調(diào)控CD31hiEmcnhi偶聯(lián)成骨機(jī)制，值得進(jìn)一步探究，查閱相關(guān)文獻(xiàn)，尚無相關(guān)報(bào)道。

骨碎補(bǔ)是補(bǔ)腎法的代表藥物，研究[16-17]表明其有效成分骨碎補(bǔ)總黃酮不僅可加速骨缺損區(qū)域骨組織重建，還可通過上調(diào)血管內(nèi)皮舒張因子及VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)血管生成。本研究采用骨碎補(bǔ)總黃酮干預(yù)大鼠股骨Masquelet誘導(dǎo)膜骨重建過程。該研究X線影像學(xué)結(jié)果提示中藥組較空白組和模型組骨缺損區(qū)骨痂形成明顯增加，提示骨碎補(bǔ)總黃酮可促進(jìn)誘導(dǎo)膜技術(shù)骨缺損區(qū)骨痂形成，加速其二期骨重建。同時(shí)研究還證實(shí)模型組新生 骨 組 織 中CD31、Emcn、slit3、ROBOm R NA的 表達(dá)較空白組提高，筆者認(rèn)為空白與模型組對照也有陽性結(jié)果是由于模型組放置骨水泥后形成誘導(dǎo)膜，誘導(dǎo)膜中生長因子促進(jìn)CD31hiEmcnhi血管新生，加速成骨。而中藥高、中劑量組相比模型組有明顯的上調(diào)，從而表明骨碎補(bǔ)總黃酮通過調(diào)控Slit-Robo信號通路介導(dǎo)血管偶聯(lián)成骨，促進(jìn)誘導(dǎo)膜技術(shù)二期骨重建。

綜上所述，該研究肯定了誘導(dǎo)膜骨組織重建過程中CD31hi Emcnhi血管偶聯(lián)成骨與Slit-Robo信號通路的相關(guān)性，初步揭示了骨碎補(bǔ)總黃酮促進(jìn)誘導(dǎo)膜技術(shù)二期骨重建的分子生物機(jī)制。預(yù)期為中藥干預(yù)誘導(dǎo)膜技術(shù)提供新靶點(diǎn)，有助于解決誘導(dǎo)膜技術(shù)二期移植骨血管化、礦化緩慢的關(guān)鍵性問題。