袁光蔚， 莫紫梅， 周嵩煜， 戴向東， 葉 金，吳 宇， 伍先紹， 胡 蓉， 王海波

(廣西-東盟食品檢驗(yàn)檢測(cè)中心1, 南寧 530029) (國家糧食和物資儲(chǔ)備局科學(xué)研究院2,北京 100037) (廣西壯族自治區(qū)糧油質(zhì)量檢驗(yàn)中心3,南寧 530031)

真菌毒素為真菌生長(zhǎng)繁殖過程中產(chǎn)生的毒性次級(jí)代謝產(chǎn)物[1]。目前，已確認(rèn)化學(xué)結(jié)構(gòu)的真菌毒素有400多種[2]。研究表明，部分真菌毒素具有致畸、致癌、致突變、肝腎毒性、免疫毒性和神經(jīng)毒性等危害[3]。近年來，受全球氣候變暖等因素的影響，世界各國的真菌毒素侵染事件屢見報(bào)端，特別是農(nóng)產(chǎn)品中多種真菌毒素協(xié)同污染現(xiàn)象頻頻發(fā)生，多種真菌毒素的檢測(cè)越來越受重視[4，5]。廣西為高溫高濕環(huán)境，非常適宜黃曲霉毒素等真菌毒素的繁殖，因此，對(duì)廣西地區(qū)主產(chǎn)糧油及其制品進(jìn)行真菌毒素污染風(fēng)險(xiǎn)的監(jiān)測(cè)、評(píng)估及治理迫在眉睫。

真菌毒素的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫法、膠體金快速檢測(cè)法、薄層層析法、熒光光度法、液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法等。其中酶聯(lián)免疫法、膠體金快速檢測(cè)技術(shù)屬于快速檢測(cè)方法，具有簡(jiǎn)單、快速、便捷的優(yōu)勢(shì)，但也存在著假陽性、假陰性的風(fēng)險(xiǎn)[6]；薄層層析法操作過程復(fù)雜，重復(fù)性較差，在檢測(cè)上的使用受到限制，一般只做定性或者粗略的定量實(shí)驗(yàn)[7]；而熒光光度法、液相色譜法雖為當(dāng)前的主流檢測(cè)方法，但其前處理較為復(fù)雜，對(duì)檢驗(yàn)人員的操作技術(shù)要求較高，且免疫親和柱成本高，對(duì)多種毒素同時(shí)檢測(cè)的能力有限[8]；高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法兼具通用性和選擇性，靈敏度高，適合多組分毒素的同時(shí)檢測(cè)，但由于其為低分辨率質(zhì)譜，不能提供精準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)碎片信息，在分析復(fù)雜基質(zhì)樣品時(shí)常常存在假陽性等問題，具有一定的局限性。

四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜將四極桿的高離子選擇性和靜電場(chǎng)軌道阱高分辨掃描技術(shù)有機(jī)結(jié)合，分辨率、靈敏度、抗干擾能力更強(qiáng)，卓越的定性能力基本避免了假陽性情況的發(fā)生，在真菌毒素分析領(lǐng)域中得到快速發(fā)展和應(yīng)用：如Alfonso等[9，10]結(jié)合QuEChERS技術(shù)，檢測(cè)了梨汁中14種鐮刀菌屬真菌毒素及植物藥中16中霉菌毒素；胡巧茹等[11]通過含2%甲酸的乙腈萃取，Captive EMR-Lipid柱純化，對(duì)谷物產(chǎn)品中20種霉菌毒素進(jìn)行了篩選和確認(rèn)；Ellen等[12]開發(fā)了昆蟲中23種真菌毒素的檢測(cè)方法；Yelko等[13]建立用于同時(shí)測(cè)定大豆?jié)h堡中21種霉菌毒素和12種異黃酮的UHPLC-Q-Orbitrap HRMS方法等。但面對(duì)日益增長(zhǎng)的真菌毒素監(jiān)測(cè)數(shù)量及日常監(jiān)管任務(wù)重、急、快的需求，仍然面臨著毒素檢測(cè)種類少，前處理耗時(shí)長(zhǎng)等壓力。

本研究采用混合溶劑對(duì)樣品進(jìn)行直接提取，然后稀釋、過濾，最后通過高分辨率質(zhì)譜進(jìn)行快速篩查、定量，以期滿足糧油產(chǎn)品中真菌毒素的日常監(jiān)管防控工作需要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

甲醇(色譜純)；甲酸(色譜純)；乙酸銨(色譜純)；77種真菌毒素混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液(質(zhì)量濃度為40～8 000 ng/mL)；15種真菌毒素同位素內(nèi)標(biāo)混合溶液(質(zhì)量濃度為1～265 ng/mL)；植物油樣品(廣西各地市植物油抽檢樣品)。

Milli-Q 超純水系統(tǒng)，KS260振蕩儀，ROTANTA460/460R離心機(jī)，A-14C離心機(jī)，超高效液相-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜配H-ESIⅡ源、Ultimate 3000 液相色譜系統(tǒng)及TraceFinder4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 樣品的前處理

固體樣品經(jīng)粉碎，過40目篩后，混勻備用；液體樣品直接取樣使用。取5 g混勻的樣品，置于50 mL離心管中，加入20 mL乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)混合提取溶液，振蕩提取15 min，4 600 r/min離心10 min，精密轉(zhuǎn)移0.70 mL上清液于2 mL離心管中，然后加入0.70 mL水稀釋，渦旋混勻1 min，在4 ℃、10 000 r/min下離心10 min，上清液經(jīng)0.22 μm的PTFE濾膜過濾，取180 μL濾液和20 μL同位素內(nèi)標(biāo)混合儲(chǔ)備液于具有內(nèi)插管的進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)，混勻待測(cè)。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

按樣品的前處理方法處理3種不同基質(zhì)的空白樣品，得空白基質(zhì)濾液；取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用空白基質(zhì)濾液將其逐級(jí)稀釋，配置成濃度比例為1∶2∶4∶10∶20的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，然后分別取180 μL系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和20 μL同位素內(nèi)標(biāo)混合儲(chǔ)備液置于具有內(nèi)插管的進(jìn)樣小瓶?jī)?nèi)，混勻，即得系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，濃度范圍見表1。

1.2.3 色譜條件

1.2.3.1 液相色譜條件

Waters CORTECSTM ? UPLC ? C18柱(1.6 μm，100 mm × 2.1 mm)；流動(dòng)相A為含0.1%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸和1 mmol/L乙酸銨的水溶液，B為甲醇。梯度洗脫條件：0～2 min，90% A；2～3 min，90% A～80% A；3～4 min，80% A～79% A；4～5 min，79% A～74% A；5～7 min，74% A；7～10.5 min，74% A～40% A；10.5～13.5 min，40% A；13.5～14.5 min，40% A～5% A；14.5～17 min，5% A；17～18 min，5% A～90% A；18～21 min，90% A；流速：0.3 mL/min，柱溫40 ℃；進(jìn)樣量2 μL。

1.2.3.2 質(zhì)譜條件

掃描模式：正離子；噴霧電壓：3.20 kV；鞘氣流速：35 L/min；輔助氣流速：10 L/min，溫度：300 ℃；離子傳輸管溫度：320 ℃；采集模式：Full MS/dd MS2；一級(jí)質(zhì)譜分辨率：70 000；掃描范圍：70～900m/z；二級(jí)質(zhì)譜分辨率：17 500；觸發(fā)閾值：2.0e4；歸一化碰撞能：20、40、60。

1.3 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用儀器自帶的TraceFinder 4.1數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)及Mass Frontier 7.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 前處理方法的選擇

當(dāng)前，食品中真菌毒素的提取一般選擇甲醇、乙腈等與水的混合溶液作為提取溶劑。乙腈溶解性能優(yōu)良，對(duì)極性和非極性的真菌毒素均有較高的提取率，并能促使樣品中蛋白質(zhì)變性沉淀，進(jìn)一步提高提取效率[14]。部分真菌毒素對(duì)pH比較敏感，在提取溶劑中加入輔助試劑可提高聯(lián)合提取效果[11,14]。研究發(fā)現(xiàn)[15，16]，甲酸、乙酸等可提高諸如伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、赭曲霉素A、桔霉素、夫馬潔林等的提取回收率，如夫馬潔林為酸性化合物，當(dāng)pH降低到一定程度，使其處于非解離狀態(tài)時(shí)，在玉米樣品中的回收率可高達(dá)80%。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，選擇了以乙腈-水-乙酸(70∶29∶1)為提取溶劑。

提取溶液一般選擇QuEChERS技術(shù)或多功能柱進(jìn)行凈化。盡管凈化步驟確實(shí)純化了上機(jī)溶液，減少了雜質(zhì)的影響，但也增加了實(shí)驗(yàn)步驟，降低了整體效率。胡巧茹等[11]實(shí)驗(yàn)表明，QuEChERS技術(shù)使用的乙二胺-N-丙基硅烷、石墨化炭黑等凈化劑，會(huì)吸附部分真菌毒素，導(dǎo)致回收率不夠理想；鄭翠梅等[17]在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，使用Mycosep226凈化柱時(shí)，對(duì)伏馬毒素B1、伏馬毒素B2、赭曲霉素A有較嚴(yán)重的吸附作用。本研究中，檢測(cè)的真菌毒素多達(dá)77種，它們結(jié)構(gòu)各異，理化性質(zhì)也不盡相同，為兼顧化合物的整體回收率，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合儀器本身抗污染、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)，最終采取了直接提取，然后用純水進(jìn)行稀釋的前處理方法。既簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)步驟，提高了檢驗(yàn)效率，獲得了較滿意的回收率，又降低了溶劑效應(yīng)的影響，利于獲得峰形良好的色譜峰。

2.2 液相條件的優(yōu)化

77種真菌毒素，極性各異，本實(shí)驗(yàn)采用了Waters CORTECS ? UPLC ? UPLC C18(1.6 μm，2.1 mm×100 mm)色譜柱，其通用性較強(qiáng)，極小的粒徑使色譜柱具有極高的柱效，對(duì)多種化合物的分離具有較大的優(yōu)勢(shì)，較小的內(nèi)徑和適中的長(zhǎng)度既保證了柱容量，又兼顧了流動(dòng)相的消耗。

常用的流動(dòng)相中，甲醇的極性較乙腈強(qiáng)，洗脫能力相對(duì)較弱，可兼顧多化合物檢測(cè)的整體分離效果。

圖1 流動(dòng)相中加甲酸前、后桔霉素的提取離子流圖

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相同的情況下，在流動(dòng)相水相中加入了有機(jī)酸時(shí)，部分化合物的響應(yīng)明顯增強(qiáng)了，應(yīng)該是有機(jī)酸的存在促進(jìn)了化合物的離子化效率，使響應(yīng)增大，通過優(yōu)化有機(jī)酸的種類和濃度，選擇了在水相中加入0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸。圖1為桔霉素在流動(dòng)相中加入甲酸前、后的響應(yīng)對(duì)比。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，在流動(dòng)相中加入一定濃度的乙酸銨時(shí)，可以提高部分化合物的響應(yīng)和改善色譜峰形，應(yīng)該是乙酸銨的加入為化合物的加合提供了NH4+的來源，也影響了其色譜行為，如圖2所示，水相中未加乙酸銨時(shí)，雙氫麥角汀的保留時(shí)間延后，且峰形明顯的分叉。

圖2 流動(dòng)相中加乙酸銨前、后雙氫麥角汀的提取離子流圖

本次實(shí)驗(yàn)選擇了含0.1%(體積分?jǐn)?shù))的甲酸、1 mmol/L乙酸銨的水溶液和甲醇溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，并考慮到降低溶劑效應(yīng)及防止水相中的乙酸銨在高比例有機(jī)相中析出導(dǎo)致色譜柱堵，流動(dòng)相初始梯度使用了較高比例的水相。

2.3 質(zhì)譜條件的確定

通過對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行全掃描模式采集，確定了各個(gè)化合物的最佳電離模式以及加合形式，詳見表1。優(yōu)化過程中發(fā)現(xiàn)，除脫氧雪腐鐮刀菌烯醇及其乙?；苌锏葹閿?shù)不多的幾個(gè)化合物最佳電離模式為負(fù)離子模式外，其余皆為正離子模式，由于儀器的采集速度有限，為保證定量所需采集點(diǎn)數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中所有化合物皆采用正離子模式，以避免采集過程中正負(fù)模式切換導(dǎo)致采集點(diǎn)數(shù)不足的問題。采用Full MS/dd MS2采集模式對(duì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行數(shù)據(jù)采集，獲得了化合物的保留時(shí)間、母離子質(zhì)荷比及二級(jí)質(zhì)譜圖。利用Mass Frontier 7.0軟件推測(cè)各化合物可能的質(zhì)譜轉(zhuǎn)換裂解途徑，結(jié)合實(shí)際采集的二級(jí)質(zhì)譜圖，確認(rèn)了其二級(jí)特征碎片離子，詳見表1。圖3為以黃曲霉毒素B1為例的質(zhì)譜轉(zhuǎn)換裂解途徑。以分子式、子離子、保留時(shí)間等信息為基礎(chǔ)，建立了數(shù)據(jù)庫。由于本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的化合物組分較多，通過數(shù)據(jù)庫的匹配篩查，再根據(jù)最終篩查結(jié)果有目的的進(jìn)行定量，可有效降低工作量，提高數(shù)據(jù)處理效率。

圖3 黃曲霉毒素B1質(zhì)譜轉(zhuǎn)換裂解途徑

表1 77種目標(biāo)化合物的分子式、儲(chǔ)備液濃度和質(zhì)譜參數(shù)

續(xù)表1

續(xù)表1

2.4 基質(zhì)效應(yīng)

ESI源中基質(zhì)效應(yīng)的產(chǎn)生是由于受共流出物質(zhì)的干擾，產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性電離，導(dǎo)致目標(biāo)物響應(yīng)增強(qiáng)或者降低的現(xiàn)象[18]。由于本實(shí)驗(yàn)提取方法不經(jīng)過凈化，樣品中會(huì)存在著一定的基質(zhì)干擾，因此，本實(shí)驗(yàn)分別對(duì)大米、小麥、植物油三類樣品的基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行了考察，以目標(biāo)物在空白基質(zhì)液中的峰面積與在純?nèi)軇┲蟹迕娣e的百分比來評(píng)估基質(zhì)效應(yīng)，高于100%說明有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，低于100%則說明有基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果顯示，77種真菌毒素的基質(zhì)效應(yīng)為70.0%～206.0%，其中，90%～110%占71.86%，<80%及>120%的為總數(shù)的8.23%，說明化合物在這三種基質(zhì)中存在一定的基質(zhì)增強(qiáng)或抑制效應(yīng)。如細(xì)交鏈孢菌酮酸在植物油基質(zhì)中基質(zhì)增強(qiáng)作用嚴(yán)重，達(dá)206.0%，而T-2四醇在大米基質(zhì)中則存在較明顯的基質(zhì)抑制效應(yīng)，為70.0%，這可能是由于樣品提取液中的油脂以及磷脂類物質(zhì)等影響了某些化合物的離子化效率導(dǎo)致的結(jié)果。

穩(wěn)定同位素稀釋法和基質(zhì)加標(biāo)曲線法是常見的降低基質(zhì)效應(yīng)的方法，其中穩(wěn)定同位素稀釋法是最有效的方法之一，但由于穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)的價(jià)格較為昂貴，且難以獲得，故本實(shí)驗(yàn)僅對(duì)國家日常監(jiān)督中常見的15種真菌毒素采用了穩(wěn)定同位素稀釋法定量，但為了更好的降低基質(zhì)效應(yīng)的影響，確保結(jié)果的準(zhǔn)確可靠，其余均采用基質(zhì)加標(biāo)曲線法。

2.5 方法的線性及范圍

系列濃度混合標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液經(jīng)高分辨率質(zhì)譜檢測(cè)，以待測(cè)化合物的母離子峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x)進(jìn)行線性擬合，獲得各待測(cè)化合物的線性方程。77種化合物在各自濃度區(qū)間范圍內(nèi)線性良好，變異系數(shù)R2均大于0.99。

2.6 檢出限、準(zhǔn)確度和精密度

采用逐級(jí)稀釋加標(biāo)樣品至儀器能檢出的最低含量為各化合物的儀器檢出限，經(jīng)過換算得到其方法檢出限，并以方法檢出限的3倍量為方法定量限，為0.6～48.0 μg/kg。取大米、小麥、植物油空白樣品，進(jìn)行了曲線最低點(diǎn)(低水平)、曲線第二低點(diǎn)(中水平)、曲線中間點(diǎn)(高水平)濃度水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度水平測(cè)定6個(gè)平行樣品，對(duì)回收率進(jìn)行了匯總統(tǒng)計(jì)，回收率在70.0%～120.0%的占95%以上；但桔霉素、細(xì)胞松馳素A在大米中的回收率僅為25%左右，嗜熱菌殺酵母素、桔霉素、細(xì)胞松馳素A在小麥中的回收率為45%左右，可能是由于這兩種基質(zhì)所含淀粉、蛋白質(zhì)較多，影響了它們的理化性質(zhì)，從而導(dǎo)致其提取效果低下。對(duì)回收率精密度進(jìn)行考察，RSD為0.1%～8.7%，說明方法具有良好的重復(fù)性。

2.7 實(shí)際樣品檢測(cè)

采用本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)來自廣西區(qū)內(nèi)各地市的236批食用植物油樣品進(jìn)行檢測(cè)，共檢出5種真菌毒素，均為小油坊花生油樣品，結(jié)果見表2。其中黃曲霉毒素B1和柄曲霉素的二級(jí)碎片離子見圖4、圖5。

圖4 黃曲霉毒素B1在實(shí)際樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液中的二級(jí)質(zhì)譜圖

圖5 柄曲霉素在實(shí)際樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液中的二級(jí)質(zhì)譜圖

黃曲霉毒素B1是植物油中常見的真菌毒素污染物，為自然界中理化性質(zhì)最為穩(wěn)定的一類霉菌毒素，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)確定為一級(jí)人類致癌物[19]。國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定[20]，花生油中黃曲霉毒素B1限量為20 μg/kg，此次檢出量為0.62～1 861.15 μg/kg，表明部分樣品含量甚至達(dá)到了最大限值的90倍。這種情況的出現(xiàn)主要體現(xiàn)了生產(chǎn)者對(duì)真菌毒素危害性認(rèn)知的缺失，以及小油坊儀器設(shè)備的局限?？梢姡瑢?duì)小油坊的日常監(jiān)管工作有待加強(qiáng)，需進(jìn)一步引導(dǎo)生產(chǎn)者從源頭尋找、分析并避免引起真菌毒素超標(biāo)的原因，特別是對(duì)原料進(jìn)行嚴(yán)格的分揀、保證原料儲(chǔ)藏的溫濕度，并對(duì)生產(chǎn)設(shè)備進(jìn)行日常的清潔、消毒；另一方面，也可以推廣各種經(jīng)驗(yàn)證有效、可行的降毒技術(shù)。

柄曲霉素最初分離于雜色曲霉培養(yǎng)物中，是黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素G1的合成前體，具有致癌性，被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)劃分為2B類致癌物[21]。我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)中食品中雜色曲霉素的測(cè)定，僅適用于大米、玉米、小麥、黃豆及花生樣品[22]，此次植物油中柄曲霉素的檢出率為4.66%，含量為1.52～12.51 μg/kg，說明植物油中存在柄曲霉素的污染風(fēng)險(xiǎn)，有關(guān)部門需引起重視，必要時(shí)可對(duì)陽性樣品進(jìn)行溯源研究，同時(shí)進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估甚至制訂標(biāo)準(zhǔn)以填補(bǔ)監(jiān)管空白。這也充分說明了本實(shí)驗(yàn)方法有利于發(fā)現(xiàn)糧油中真菌毒素污染情況的監(jiān)管漏洞，可為糧油中真菌毒素污染防控提供技術(shù)支持。

經(jīng)考察，儀器連續(xù)進(jìn)樣7 d，加標(biāo)回收質(zhì)控樣品保留時(shí)間無偏差，峰面積穩(wěn)定，且儀器污染程度較低，說明實(shí)驗(yàn)方法穩(wěn)定性好，不會(huì)增加儀器的維護(hù)成本，可滿足大批量、長(zhǎng)時(shí)間的進(jìn)樣檢測(cè)。

表2 236批植物油的檢測(cè)結(jié)果匯總

3 結(jié)論

利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜(UPLC-Q-Exactive Orbitrap)技術(shù)建立了一種直接提取、稀釋進(jìn)樣，測(cè)定大米、小麥、植物油中77種真菌毒素的方法。本方法檢測(cè)數(shù)量多，前處理簡(jiǎn)便高效。經(jīng)方法學(xué)考察及實(shí)際樣品檢測(cè)證明，本方法實(shí)用性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，效率高，可滿足國內(nèi)外糧油中真菌毒素的高通量快速篩查和定量的要求。