李虹竹，許能貴，易 瑋，趙家瑩*

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種進展性、退行性神經(jīng)疾病，易發(fā)于65歲以上老年人，以細胞間淀粉樣斑塊及神經(jīng)纖維纏結(jié)為主要特征，起病隱匿，進展緩慢，最終導致癡呆[1]。AD是21世紀公共衛(wèi)生保健的巨大挑戰(zhàn)之一，截至2015年，全球大約有4 700萬患者，僅中國就有600萬人[2]，而這個數(shù)字將每20年翻一倍，目前沒有一種有效藥物能治愈或者逆轉(zhuǎn)阿爾茨海默病。越來越多的天然產(chǎn)物通過美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)認證上市，中藥作為天然產(chǎn)物的重要組成部分，以其在治療AD中的獨特優(yōu)勢，發(fā)揮了非常重要的作用，所以探究中藥治療阿爾茨海默病的機制有一定的價值。

山藥是薯蕷科多年生纏繞性藤本薯蕷的根莖[3]，性平味甘，屬脾、肺、腎經(jīng)，《神農(nóng)本草經(jīng)》記載“主傷中，補虛贏，除寒熱邪氣，補中益氣力”。腎虛髓空是AD發(fā)生的根本原因，腎主水，腎虛勢必影響水液代謝，水液停聚則痰飲水濕內(nèi)生，從而損傷脾胃，運化失司，反過來影響腎精生成，惡性循環(huán)，導致癡呆。補腎健脾是治療阿爾茨海默病的基本治則之一，而山藥是治療AD常用方劑的重要藥物組成部分，有報道，山藥的組方使用頻率位列第5[4]。研究表明，山藥中的活性成分具有抗炎、抗氧化、增強腦組織內(nèi)ATP酶活性以及改善精神狀況的作用[5-7]。鑒于目前對于山藥治療阿爾茨海默病的作用機制仍不明確，因此對山藥的有效成分、分子機制進行探尋，有利于山藥的開發(fā)利用，也為從補腎健脾角度治療阿爾茨海默病提供理論依據(jù)。

“網(wǎng)絡(luò)藥理學”的概念在2007年被首次提出[8]，認為藥物療效是多靶點、多成分、多途徑作用的結(jié)果，這與中藥的作用特點不謀而合。本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學分析藥物-疾病-靶點相互作用關(guān)系，從生物網(wǎng)絡(luò)穩(wěn)態(tài)的角度探討山藥與阿爾茨海默病的療效規(guī)律及現(xiàn)代藥理學機制。

1 材料與方法

1.1 山藥活性成分及潛在靶點 通過中藥藥理學系統(tǒng)數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)搜索山藥已知的化學成分，根據(jù)口服利用度(OB)≥30%、類藥性(DL)≥0.18進行篩選，并對山藥的有效成分在TCMSP數(shù)據(jù)庫進行作用蛋白靶點預(yù)測提取。

1.2 靶點名稱標準化 將TCMSP數(shù)據(jù)庫篩選出的蛋白靶點名導入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(UniProt Database)，物種設(shè)置為人類(Human)，將作用人類蛋白名稱轉(zhuǎn)換成標準的基因名。

1.3 AD疾病相關(guān)靶點獲取 通過人類基因卡片數(shù)據(jù)庫(GeneCards)及人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM)，在線檢索輸入“Alzheimer′ disease”，搜索與阿爾茨海默病相關(guān)的基因，將得到的疾病基因靶點進行篩選，剔除重復的靶點，設(shè)置關(guān)聯(lián)分數(shù)(Relevance score)≥10，結(jié)果導出為Excel文件。

1.4 治療AD活性成分篩選 將人類靶點的基因名與疾病相關(guān)基因名進行對比匹配處理，共同靶標結(jié)果就是山藥治療AD的關(guān)鍵靶點基因，反向篩選出治療AD的潛在活性成分，并使用R軟件(Version R x64 3.6.2)繪制維恩圖。

1.5 AD-山藥活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將山藥活性成分、基因靶點導入Cytoscope3.6.1，構(gòu)建疾病-藥物-活性成分-靶點基因可視化網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(node)代表疾病、藥物、靶點基因、活性成分；邊(edge)用來連接疾病與基因、基因與活性成分、活性成分與藥物的關(guān)系。

1.6 蛋白靶點互作(Protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)建立 將山藥治療AD的關(guān)鍵靶點基因輸入蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(STRING數(shù)據(jù)庫)，設(shè)置物種為人類(Homo sapiens)進行構(gòu)建，設(shè)置可信度為中等可信(Medium confidence)，隱藏未連接的節(jié)點，其他參數(shù)數(shù)據(jù)庫保持系統(tǒng)推薦設(shè)置，進行蛋白互作分析，獲取蛋白互作關(guān)系網(wǎng)絡(luò)。

1.7 靶點通路分析 在GO生物過程與KEGG數(shù)據(jù)庫富集分析及通路建立，將關(guān)鍵靶點基因輸入到用于注釋、可視化和集成發(fā)現(xiàn)的數(shù)據(jù)庫(The Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery，DAVID)，選擇物種為人類(Homo sapiens)進行GO生物過程分析和KEGG信號通路富集，以P<0.05進行靶基因篩選，分析山藥發(fā)揮藥理作用的生物過程及主要信號通路；在R軟件(Version R x64 3.6.2)中使用Bioconductor-pathview建立通路圖。

1.8 Autodock vina分子對接驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學 我們從Pubchem數(shù)據(jù)庫下載化合物結(jié)構(gòu)，并在OpenBabel 2.4.1的MMFF94力場下對化合物的結(jié)構(gòu)進行優(yōu)化。AD相關(guān)靶點蛋白的三維結(jié)構(gòu)從PDB(Protein Data Bank)獲得。使用AutodockTools1.5.6 對化合物進行可旋轉(zhuǎn)鍵的搜尋與定義，對蛋白結(jié)構(gòu)進行除去水分子、添加氫原子、添加電荷，并保存為PDBQT格式。采用Autodock vina 1.1.2進行分子對接研究來驗證網(wǎng)絡(luò)藥理學的篩選結(jié)果。根據(jù)配體的位置，確定了活性位點的坐標，為了增加計算的準確度，將參數(shù)exhaustiveness設(shè)置為20，其他參數(shù)均采用默認值。選取對接結(jié)合能量最低的構(gòu)象用于對接結(jié)合模式分析，并使用Discovery Studio Visualizer進行作圖。

2 結(jié)果

2.1 山藥的活性成分及靶點 依據(jù)OB≥30%、DL≥0.18的標準，篩選出山藥的主要化學成分有16種，其中4種活性成分denudatin B、hancinol、doradexanthin、methylcimicifugoside_qt未找到靶標蛋白，見表1。去除重復，共預(yù)測到潛在靶點144個，通過Uniprot數(shù)據(jù)庫標準基因名轉(zhuǎn)換后，共得到109個作用人類的基因靶點。通過Genecards、OMIM數(shù)據(jù)庫共檢索到與AD相關(guān)基因8 730個，將AD相關(guān)的靶點按相關(guān)性分數(shù)取前802個，后面分數(shù)較小無參考意義，將2種方法得到的靶點取交集即得到AD相關(guān)靶點，與山藥有效成分靶點相匹配映射得到山藥治療AD靶點共24個，見圖1。

圖1 山藥靶點與AD靶點匹配Venn圖

2.2 AD-山藥活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將山藥活性成分、靶點基因、疾病導入Cytoscape軟件，構(gòu)建AD-山藥活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)可視化網(wǎng)絡(luò)，見圖2，包含12個化學成分，53個靶點。節(jié)點(node)表示山藥活性成分、靶蛋白或 AD。邊(edge)代表這些分子之間的互作關(guān)系，即某個成分與靶點存在聯(lián)系。其中stigmasterol與20個靶點相連接，可能是山藥治療AD最重要成分，piperlonguminine、kadsurenone、hancinone C、isofucosterol、diosgenin和AIDS180907均與7個及以上靶點連接，見表2和表3。

2.3 PPI及Hub蛋白確定 將AD相關(guān)靶點基因?qū)雜tring在線數(shù)據(jù)庫，設(shè)置隱藏未連接的靶點，得到蛋白互作PPI網(wǎng)絡(luò)，見圖3。包含節(jié)點53個，邊233條，連接度值平均為8.79。利用Cytoscape插件中Degree算法確定度值前6為Hub蛋白，其中AKT1、PTGS2、VEGFA等25個蛋白度值均大于平均值，見表4。

圖2 “山藥-活性成分-靶點基因-AD”網(wǎng)絡(luò)

表2 山藥治療AD的活性成分及潛在作用靶點

表3 重要化合物名稱及化學結(jié)構(gòu)式

圖3 蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)

表4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)分析結(jié)果

2.4 GO-BP分析 如圖4所示，山藥治療阿爾茨海默病核心基因的GO功能主要集中在G protein-coupled amine receptor activity(G蛋白偶聯(lián)氨受體活性，9個基因)、steroid hormone(甾類激素，8個基因)、nuclear receptor activity(核受體的活性，7個基因)、transcription factor activity，direct ligand regulated sequence-specific DNA binding(轉(zhuǎn)錄因子的活性，直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合，7個基因)、neurotransmitter receptor activity(神經(jīng)遞質(zhì)受體活性，7個基因)、G protein-coupled neurotransmitter receptor activity(G蛋白偶聯(lián)神經(jīng)遞質(zhì)受體活性，6個基因)、steroid binding(甾類激素結(jié)合，6個基因)。

2.5 KEGG通路建立及分析 利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG分析，共獲得71條富集結(jié)果，限定P<0.05，前20條 KEGG 代謝通路及其相關(guān)信息見圖5。包括神經(jīng)活性配體受體交互通路(Neuroactive ligand-receptor interaction)、鈣信號通路(Calcium signaling pathway)、卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路(Kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection pathway)、乳腺癌通路(Breast cancer pathway)、前列腺癌(Prostate cancer pathway)、低氧誘導因子1信號通路(HIF-1 signaling pathway)。其中AKT1、MTOR、GSK3β參與卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路、乳腺癌信號通路的調(diào)節(jié)。

2.6 分子對接驗證 山藥的有效化學成分配體與阿爾茨海默病蛋白受體的對接結(jié)果見表5，分子對接過程及結(jié)合位點見圖6、圖7，親和力(Affinity score)代表分子對接吻合度，絕對值的分數(shù)越高代表配體與受體蛋白結(jié)合性越好。分子對接結(jié)果表明，山藥的活性成分與AKT1、MTOR、GSK3β蛋白分子對接吻合度較好，富集分析中卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路及乳腺癌通路也顯示山藥作用的靶點在AKT1、MTOR、GSK3β因子，該結(jié)果說明分子對接結(jié)果與網(wǎng)絡(luò)藥理學篩選結(jié)果一致，用分子對接的方式驗證了網(wǎng)絡(luò)藥理學的可靠性。

表5 配體-受體分子對接結(jié)果

圖4 GO分析山藥治療AD生物過程圖

圖5 山藥治療AD的作用通路圖

圖6 分子對接結(jié)果

圖7 分子對接位點示意圖

3 討論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學分析發(fā)現(xiàn)，AKT1、MTOR、GSK3β可能是山藥有效成分治療AD的核心靶點，AKT又稱蛋白激酶B，是PI3K信號通路調(diào)節(jié)細胞生長、遷移功能的主要下游信號分子，AKT1的基因多態(tài)性可能與AD相關(guān)[9]，AKT基因位點rs2498786突變可能增加阿爾茨海默病的發(fā)病率，治療上采用促進Akt1/mTOR信號通路的方式可能是治療AD新的靶點[10]。GSK3β與PI3K/Akt信號通路有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，sAPPα刺激 PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，但是β淀粉樣蛋白低聚體會阻斷這個信號轉(zhuǎn)導通路，從而導致特殊部位神經(jīng)元的易損傷性增加，說明PI3K/Akt信號通路可能參與淀粉樣蛋白的代謝過程[11]。Yao等[12]發(fā)現(xiàn)，蛇床子素通過激活 PI3K/Akt/GSK-3β信號通路，降低AD模型小鼠腦內(nèi)磷酸化的Tau蛋白，發(fā)揮抗AD的療效。本研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇能與20個靶點相連接，是山藥治療AD的主要有效成分，可通過減少氧化應(yīng)激和自噬失活，對缺血再灌注損傷發(fā)揮神經(jīng)保護作用[13]。結(jié)合分子對接結(jié)果，預(yù)測豆甾醇可能是通過PI3K/Akt/GSK-3β信號通路抑制Tau蛋白的過度磷酸化來治療AD。其次，蓽茇寧酰胺也是山藥的主要活性成分，Gu等[14]發(fā)現(xiàn)，蓽茇寧酰胺通過抑制NF-κB信號通路減少由于脂多糖誘導產(chǎn)生的淀粉樣沉積和神經(jīng)炎癥，而PTGS2可以激活NF-κB信號通路[15]，與AD的發(fā)病密切相關(guān)[16-17]。PTGS2還參與環(huán)氧化酶(COX-2)的編碼，AD患者尸檢發(fā)現(xiàn)多個腦區(qū)環(huán)氧化酶的過表達[18]，通過干預(yù)PTGS2基因能降低環(huán)氧化酶的含量，從而改善神經(jīng)炎癥。蓽茇寧酰胺與PTGS2對接，預(yù)測其可能通過PTGS2抑制NF-κB信號通路來治療AD。

GO及KEGG分析結(jié)果顯示，山藥治療AD的機制主要是通過神經(jīng)活性配體受體交互通路，降低乙酰膽堿酯酶活性或作用于CHRM1、CHRM2、CHRM3、CHRM5膽堿能受體?！澳憠A能學說”認為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膽堿能系統(tǒng)神經(jīng)元功能損害會導致AD患者認知功能障礙[19]，CHRM是膽堿能毒蕈堿受體，這類受體與海馬的學習、記憶功能密切相關(guān)[20]，而Aβ的沉積可損害M受體與G蛋白的偶聯(lián)，阻斷M受體激動后的信號傳導[21]，結(jié)合GO-BP的結(jié)果，山藥有效成分的功能與G蛋白偶聯(lián)受體活性密切相關(guān)，因此，山藥的活性成分治療AD可能是通過恢復M受體與G蛋白的偶聯(lián)及信號傳導，影響中樞膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能來發(fā)揮療效。除了興奮性神經(jīng)元，動物實驗及臨床試驗均發(fā)現(xiàn)AD的發(fā)病與γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)神經(jīng)元有關(guān)[22-23]，Yadav 等[24]研究發(fā)現(xiàn)，豆甾醇能增加GABA水平，減少多巴胺、丙二醛、TNF-α水平，降低乙酰膽堿酯酶活性，所以在神經(jīng)活性配體受體交互通路中山藥還可能是作用在GABA神經(jīng)遞質(zhì)上來發(fā)揮治療的作用。鈣穩(wěn)態(tài)的失衡會導致AD的發(fā)生，鈣離子可調(diào)控細胞的增殖、分化、轉(zhuǎn)錄和凋亡，鈣信號通路與記憶的形成、能量的產(chǎn)生及許多蛋白的結(jié)合密切相關(guān)[25]。在鈣離子通路中，山藥的有效成分作用于G-蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)，GPCR產(chǎn)生第二信使，從而調(diào)節(jié)鈣穩(wěn)態(tài)，減少Aβ的產(chǎn)生。在卡波西肉瘤相關(guān)皰疹病毒感染通路及乳腺癌通路中，山藥作用于Akt、mTOR、NF-κB、HIF1α、GSK-3因子。mTOR是自噬主要的負性調(diào)節(jié)因子，自噬能降解和清除機體異常沉積的蛋白包括Aβ蛋白[26]。山藥可能通過抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路的激活，降低mTOR的活性，恢復細胞的自噬水平，促進對Aβ沉積的清除來發(fā)揮治療作用，同時PI3K/Akt信號通路、NF-κB通路、Wnt-GSK3β通路還與消化系統(tǒng)相關(guān)[27]，可以調(diào)節(jié)胃黏膜細胞增殖與分化，這可能是山藥健脾通過補氣作用治療阿爾茨海默病的重要依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學對山藥治療阿爾茨海默病的活性成分及作用機制進行了分析，并且通過Autodock vina分子對接軟件驗證了山藥的有效成分與重要靶點有較好的吻合度，驗證了預(yù)測靶點的可靠性。建立疾病-藥物-成分-靶點網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)，山藥中的有效成分stigmasterol、diosgenin、piperlonguminine可能通過降低乙酰膽堿酯酶活性，抑制PI3K-Akt-mTOR信號通路降低淀粉樣沉積治療AD，具有多成分、多靶點、多通路的特點，為山藥治療AD的潛在機制提供了新的角度，也為進一步驗證其藥理作用機制提供了理論基礎(chǔ)。