董曉婭，王旭銳，黃華杰，王雪安

(江蘇大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植保工程重點實驗室, 江蘇 鎮(zhèn)江 212013)

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)活動中，農(nóng)藥過度使用不僅污染農(nóng)業(yè)水土環(huán)境，嚴(yán)重影響糧食安全，而且可能造成環(huán)境污染，影響人類健康.因此，快速檢測環(huán)境中農(nóng)藥的殘留一直是全球密切關(guān)注的熱點[1].作為一種高效廣譜殺蟲殺螨劑，有機磷農(nóng)藥馬拉硫磷(Mal)被廣泛用于水稻、小麥、棉花等作物害蟲的防治.但由于Mal具有抑制神經(jīng)遞質(zhì)的毒性，可通過皮膚或黏膜接觸、吸入或誤食而引起人體中毒[2]，所以需要開發(fā)快速靈敏的檢測方法，以更好地保障人民群眾身體健康.

目前對馬拉硫磷檢測的方法主要有色譜法[3]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[4]、熒光方法[5]等.這些方法需要大型的專用儀器、熟練的技術(shù)人員，檢測成本較高.電化學(xué)檢測方法具有靈敏度高、速度快、儀器價格低廉、操作簡單等特點，被廣泛應(yīng)用于環(huán)境、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域[6].目前電化學(xué)方法檢測Mal的報道中，多使用制備過程復(fù)雜的納米復(fù)合物對傳感界面進(jìn)行修飾[7]，不便于Mal的快速檢測.因此，納米通道從快速簡便、低成本進(jìn)行檢測的角度考慮，需要開發(fā)一種新的檢測方法.

納米通道由于其結(jié)構(gòu)的尺寸效應(yīng)、比表面積效應(yīng)和納米管內(nèi)外的特殊物理化學(xué)性質(zhì)，以及尺寸可控、易制備等特點，被廣泛應(yīng)用于納米電化學(xué)[8]和生物傳感[9]等領(lǐng)域.整流現(xiàn)象是納米通道的一個重要特征，其表現(xiàn)為在對稱的輸入電勢作用下，輸出不對稱的電流，即在工作電極、參比電極/對電極所施加的外加電場的作用下，緩沖液中的K+和Cl-等離子產(chǎn)生定向運動.當(dāng)工作電極施加負(fù)電壓，正離子(K+)通過納米通道向工作電極移動時，受到納米通道內(nèi)靜電場的吸引而快速通過，形成較大的離子電流；當(dāng)工作電極施加正電壓，負(fù)離子(Cl-)通過納米通道向工作電極移動時，受到靜電場的排斥而緩慢通過，形成較小的離子電流.當(dāng)溶液中的帶電離子通過納米通道時，與納米通道表面所修飾的基團(tuán)發(fā)生相互作用，引起納米通道中的電信號顯著變化，從而產(chǎn)生離子電流整流現(xiàn)象(ionic current rectification, ICR)[10].基于納米通道的整流現(xiàn)象，SA等[11]使用硅烷將二氫咪唑修飾到石英納米管的納米通道中檢測環(huán)境中的Co2+離子.

文中通過在納米通道中引入可以特異性結(jié)合目標(biāo)物Mal的適配體，利用適配體與Mal結(jié)合后引起的納米通道離子電流整理現(xiàn)象，構(gòu)建可用于檢測Mal的納米通道適配體傳感器，以實現(xiàn)對Mal的檢測.

1 試驗設(shè)計

利用納米管的整流現(xiàn)象和適配體特異結(jié)合目標(biāo)物的特點，設(shè)計了納米管適配體傳感器，如圖1所示.首先將適配體1(Apt-1)修飾到鍍有金膜的納米管上，當(dāng)適配體2(Apt-2)與Apt-1通過堿基互補配對相結(jié)合后，玻璃管納米通道表面由于堿基數(shù)量增加而攜帶有更多的負(fù)電荷，從而場強發(fā)生改變.由于Mal的存在，2條Mal適配體片段與Mal形成穩(wěn)定的Apt-1/Mal/Apt-2復(fù)合物結(jié)構(gòu)，這使場強變化后的靜電場穩(wěn)定存在[12]，并且Apt-1/Mal/Apt-2穩(wěn)定結(jié)構(gòu)中負(fù)電荷增多，增強了適配體傳感器納米通道中的靜電場，從而影響檢測緩沖液中的K+和Cl-等離子的定向移動，發(fā)生整流現(xiàn)象；進(jìn)一步根據(jù)整流現(xiàn)象的離子電流，定量檢測Mal.

圖1 納米通道適配體傳感器工作示意圖

2 試驗部分

2.1 化學(xué)藥品和材料

Mal(1.0×10-4g/mL)購自安譜科技(中國上海).寡核苷酸鏈適配體(Apt-1，Apt-2)(ULTRA-PAGE級)由生工生物科技有限公司(中國上海)合成和純化，其堿基序列見表1.三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris/HCl)、6-巰基-1-己醇(MCH)購自安譜科技(中國上海).硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管(外徑1.0 mm，內(nèi)徑0.58 mm；長10.0 cm)購自SUTTER有限公司.

表1 適配體序列

適配體Apt-1和適配體Apt-2分別用1.0×10-2mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS)配制成濃度為1.0×10-4mol/L的溶液，在-20 ℃環(huán)境中儲存?zhèn)溆?所使用的化學(xué)試劑均為分析純.試驗使用的超純水從MILLI-Q凈水系統(tǒng)獲取(25 ℃時電阻率大于18.2 MΩ/cm).

2.2 納米管的制備

將硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管放入微電極拉制儀(P-97，SUTTER公司)的拉桿中并夾緊，設(shè)置拉制參數(shù)：HEAT=309,PULL=0,VELOCITY=40,TIME=200，將硼硅酸鹽玻璃毛細(xì)管的一端拉制成空心圓錐形，使其形成納米通道.

2.3 納米通道內(nèi)鍍膜

將拉制好的納米管固定在真空鍍膜儀(LEICA EM ACE600)的工作臺平面上，使其空心圓錐形納米通道正對熔融金屬的噴射方向，在工作參數(shù)為100 W的RF模式下鍍金120 s，使納米通道內(nèi)鍍上金膜，從而為固定適配體提供條件.

2.4 Ag/AgCl電極的制作

剪取2根長15 cm的Ag絲(Φ0.3 mm)，將Ag絲的一端浸入次氯酸HClO溶液中6 cm，室溫下靜置30 min，使銀絲表面被HClO充分氧化產(chǎn)生AgCl，從而制成Ag/AgCl電極.

2.5 納米管適配體傳感器的構(gòu)建

將-20 ℃環(huán)境下儲存的適配體Apt-1解凍，用pH為7.4的PBS(1.0×10-2mol/L)將其稀釋至1.0×10-6mol/L，之后與1.0×10-2mol/L TCEP溶液混合，Apt-1與TCEP的體積比為10∶1.在室溫下避光反應(yīng)1 h，以斷開適配體Apt-1溶液中的二硫鍵.

使用微量移液器將鍍金納米管中注入去除二硫鍵后的Apt-1溶液，并確保溶液填充至納米管尖端部分.在4 ℃條件下放置16 h，使Apt-1 5′端修飾的巰基與納米通道內(nèi)的金膜通過金硫鍵結(jié)合，將Apt-1固定在納米通道內(nèi).洗去納米通道中的殘余溶液，向納米通道內(nèi)加入1.0×10-2mol/L的MCH溶液，室溫下靜置10 min，從而封閉納米通道上的活性位點，最后清洗殘余溶液.

2.6 離子電流信號的獲取

使用緩沖液(含有5.0×10-2mol/L NaCl，1.0×10-2mol/L KCl，1.0×10-2mol/L MgCl2，5.0×10-2mol/L Tris/HCl，pH為8.0)將Mal稀釋至不同濃度，分別將不同濃度的Mal溶液和濃度為1.0×10-6mol/L的 Apt-2溶液混合后，加入修飾有Apt-1的納米通道中，在室溫下孵育40 min，使Mal與適配體Apt-1及Apt-2結(jié)合.最后將納米管中的殘余溶液吸出，并用緩沖液沖洗納米管的納米通道.

取1根Ag/AgCl電極，將表面為AgCl的一端插入修飾有適配體Apt-1的納米通道中，并將此納米通道浸入檢測緩沖溶液中，檢測緩沖溶液為含有2.0×10-2mol/L的KCl和2.0×10-2mol/L的Tris/HCl(pH為8.0)的混合液.將Ag/AgCl電極的Ag端連接CHI電化學(xué)工作站(CHI440C，上海辰華儀器有限公司)的工作電極.取另1根Ag/AgCl電極，將表面為AgCl的一端浸入檢測緩沖液中，另一端連接CHI電化學(xué)工作站的參比電極和對電極的接線上，構(gòu)成檢測回路.使用CHI440C電化學(xué)工作站對檢測緩沖液中的離子電流信號進(jìn)行檢測.檢測方法為線性掃描伏安法(linear sweep voltammetry)，設(shè)置運行參數(shù)：掃描電勢從-1.0 V到+1.0 V，掃描速率為100 mV/s，采樣頻率為60 kHz.使用CHI-440C軟件記錄電流-電壓曲線(I-E曲線)，并使用Origin軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理.

2.7 實際樣品的準(zhǔn)備

取0.9 mL自來水，向其中分別加入0.1 mL濃度為1.0×10-6，2.0×10-6和5.0×10-6mol/L的Mal溶液，配制成Mal濃度分別為1.0×10-7，2.0×10-7和5.0×10-7mol/L的1 mL自來水樣.采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對樣品進(jìn)行檢測.

2.8 實際樣品的檢測

分別使用本傳感器和氣相色譜儀對水樣進(jìn)行檢測.使用本傳感器檢測步驟參照上文第2.6節(jié).使用氣相色譜儀(Shimadzu 7AG，日本)定量測定自來水樣中的Mal時，設(shè)置柱頭壓力為103.4 kPa，進(jìn)樣器溫度為250 ℃，進(jìn)樣器在不分流模式下運行 2 min(采樣時間)，使用氦氣作為流動相.

3 結(jié)果與討論

3.1 材料表征

納米管納米通道的幾何尺寸影響離子電流的大小.采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscopy，SEM)表征拉制好的納米管尖端納米孔的幾何尺寸，表征圖如圖2所示.從圖中可以看出，所拉制好的納米管尖端內(nèi)徑為230 nm，這表明所拉制的納米管是納米通道.

圖2 納米管的SEM圖

圖3為材料的圓二色光譜(circular dichroism，CD)圖，用于表征適配體Apt-1，Apt-2和目標(biāo)物Mal孵育前后的結(jié)構(gòu)變化.圖中θ，λ分別為摩爾橢圓度、波長；曲線②是只有Apt-1和Apt-2片段的情況下的CD譜，曲線②在247 nm處出現(xiàn)波谷，在278 nm處出現(xiàn)波峰；曲線①為加入目標(biāo)Mal后的CD譜，從圖中可以看出，當(dāng)適配體溶液體系中加入目標(biāo)物Mal后，CD譜曲線中波谷發(fā)生了紅移，波谷強度增強，而波峰發(fā)生了藍(lán)移，波峰強度增強，這表明Mal與適配體結(jié)合，適配體寡核苷酸鏈的雙螺旋體發(fā)生了結(jié)構(gòu)變化.

圖3 材料CD譜

3.2 可行性驗證

為考察傳感器對Mal檢測的可行性，研究了傳感器在不同情況下的離子電流響應(yīng).圖4為不同結(jié)合體系下的離子電流曲線，圖中i，E分別為電流、電勢；曲線①為鍍金膜后的納米通道的離子電流曲線，可見相對于0 V時，-1.0和+1.0 V處的電流分別增加了4.2×10-8和3.3×10-8A，這一電流不對稱性表現(xiàn)出了微弱的整流現(xiàn)象，這是由于納米通道內(nèi)壁靜電場強比較弱.曲線②，③和④分別為在納米通道的金膜上修飾Apt-1后、修飾Apt-1和Mal以及修飾Apt-1和Apt-2后的離子電流曲線，可以發(fā)現(xiàn)-1.0和+1.0 V處相比在0 V處的電流差值增大，即產(chǎn)生電流整流現(xiàn)象比較明顯.產(chǎn)生這一現(xiàn)象是由于納米通道內(nèi)修飾適配體后，適配體所帶的電荷可以形成有效的靜電場，當(dāng)施加對稱電壓時，在外加電場下，溶液中K+和Cl-離子產(chǎn)生定向運動.當(dāng)施加負(fù)電壓時，K+定向向工作電極移動，由于修飾在納米通道上的適配體帶負(fù)電荷，有助于K+通過納米通道，形成較大的電流；當(dāng)施加正電壓時，Cl-定向向工作電極移動，由于修飾在納米通道上的適配體帶負(fù)電荷，阻礙Cl-的定向通過，產(chǎn)生較低的電流，從而產(chǎn)生了比較明顯的整流現(xiàn)象.曲線②，③和④在-1.0 V處的電流值相差不大，這是由于修飾Apt-1后，即使加入Mal，由于只有Apt-1時，Apt-1不能與Mal結(jié)合形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)；當(dāng)在金膜上修飾Apt-1后，加入Apt-2，沒有目標(biāo)物Mal的存在，Apt-1與Apt-2同樣不能形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，因此三者的整流現(xiàn)象比較接近.

圖4 不同結(jié)合體系下的離子電流曲線

當(dāng)在修飾有Apt-1的納米通道中加入目標(biāo)物Mal和 Apt-2后，Apt-1與Mal和 Apt-2結(jié)合，形成Apt-1/Mal/Apt-2穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，負(fù)電荷增多，增強了納米管傳感器內(nèi)壁的靜電場，進(jìn)而產(chǎn)生更強的整流現(xiàn)象，如圖4中曲線⑤所示.

3.3 傳感器工作條件的優(yōu)化

Apt-1的使用濃度影響其在納米管通道內(nèi)的修飾量，當(dāng)Apt-1在納米通道內(nèi)的固定量不足，則不能提供足夠與目標(biāo)結(jié)合的位點，從而影響傳感器的性能.圖5為納米通道內(nèi)修飾不同濃度Apt-1(1.0×10-7，2.0×10-7，5.0×10-7，1.0×10-6，2.0×10-6，5.0×10-6mol/L)后，在濃度為1.0×10-6mol/L的Mal和1.0×10-6mol/L的Apt-2的混合溶液中孵育后，根據(jù)獲得的-1.0 V處的離子電流值所繪制的曲線，圖中i-1.0 V，CA-1分別為-1.0 V處的電流值、Apt-1溶液濃度.從圖中可以看出，隨著Apt-1的濃度增加，離子電流不斷增大，當(dāng)Apt-1濃度增到1.0×10-6mol/L時，曲線趨于穩(wěn)定，電流不再有明顯增加.這是因為Apt-1的濃度達(dá)到1.0×10-6mol/L時，可以提供足夠的位點與目標(biāo)結(jié)合.

圖5 不同濃度Apt-1對應(yīng)的-1.0 V處的電流值

Apt-2的濃度影響Apt-1和Apt-2對目標(biāo)Mal的識別.使用濃度為1.0×10-6mol/L的Apt-1修飾納米通道，考察Apt-2的濃度對傳感器離子電流的影響.試驗獲得-1.0 V處的離子電流值后繪制曲線如圖6所示，圖中CA-2為Apt-2溶液濃度.從圖中可以看出，隨著Apt-2濃度增大，離子電流增大，當(dāng)Apt-2的濃度為1.0×10-6mol/L時，離子電流幾乎沒有增加.因此，在檢測Mal時，Apt-2的濃度采用1.0×10-6mol/L.

圖6 不同濃度Apt-2對應(yīng)的-1.0 V處的電流值

孵育溶液的pH影響適配體與Mal之間氫鍵的形成，進(jìn)而影響Apt-1/Mal/Apt-2復(fù)合物的形成.因此需要對孵育溶液的pH值進(jìn)行考察.圖7為不同孵育條件下的離子電流曲線i-1.0 V，圖中t為孵育時間.

圖7a為采用不同pH的孵育溶液所對應(yīng)的離子電流.從圖中可以看到，孵育溶液的pH為8.0時，獲得了最大的離子電流i-1.0 V.因此，使用pH為8.0的孵育溶液.

圖7 不同孵育條件下的離子電流曲線的i-1.0 V值

孵育時間影響Apt-1/Mal/Apt-2復(fù)合物的形成，因此對孵育時間進(jìn)行試驗.如圖7b所示，隨著孵育時間增大，i-1.0 V增大，但在孵育時間超過40 min后，獲得的i-1.0 V并沒有明顯的變化.因此，設(shè)置傳感器的孵育時間為40 min.

3.4 線性范圍和檢測限

為了考察傳感器對Mal定量檢測的能力，對不同濃度Mal進(jìn)行檢測，如圖8所示.

圖8 檢測不同濃度Mal的i-E曲線(插圖：i-1.0 V-lg CMal擬合曲線)

在馬拉硫磷溶液濃度CMal為1.0×10-8～1.0×10-6mol/L時，可獲得Mal濃度對數(shù)和i-1.0 V之間的函數(shù)關(guān)系為

i-1.0 V=8.81lgCMal-681.87，R2=0.972 0.

(1)

傳感器對Mal的檢測限LOD為3.33×10-9mol/L.

表2為不同電化學(xué)適配體傳感器對Mal檢測方法的對比，表中LDR為線性檢測范圍.研究中的納米通道適配體傳感器的檢測限低于基于Au納米顆粒[13]、修飾精胺的Ag納米顆粒[14]和液晶材料[15]的適配體傳感器，同時具有更寬的線性檢測范圍.與基于由帶負(fù)電荷的上轉(zhuǎn)換熒光納米粒子和陽離子聚合物封裝的金納米粒子制作的復(fù)合材料的傳感器[5]相比，文中傳感器的基體材料的制備過程更加簡單.

表2 檢測Mal的方法比較

3.5 傳感器的選擇性和穩(wěn)定性

圖9為傳感器的選擇性和穩(wěn)定性，圖中|i-i0|和n分別為電流差值、試驗組別.

圖9 傳感器的選擇性和穩(wěn)定性

傳感器的選擇性是考察傳感器性能的重要指標(biāo).使用該傳感器分別檢測二嗪磷(Dia)、三唑磷(Trz)、氯吡硫磷(Chl)和Mal，所有農(nóng)藥濃度均為1.0×10-6mol/L.檢測結(jié)果如圖9a所示，傳感器檢測Mal時獲得的-1.0 V處電流差值|i-i0|遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他3種農(nóng)藥，其中i0表示檢測體系中只有Apt-1和Apt-2而沒有農(nóng)藥時-1.0 V處的電流值.這表示所設(shè)計的納米管適配體傳感器對于檢測Mal具有較高的選擇性.

穩(wěn)定性是傳感器性能的重要指標(biāo).設(shè)置5組重復(fù)試驗，每組試驗測定3次.試驗結(jié)果如圖9b所示，組內(nèi)最大變異系數(shù)為2.05%，組間變異系數(shù)為0.33%.這表明所設(shè)計的納米通道適配體傳感器用于檢測Mal時具有較高的穩(wěn)定性.

3.6 實樣檢測

為了考察納米管適配體傳感器在實際樣品檢測中的可用性，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法對實際樣品進(jìn)行測定.表3為自來水中的Mal分析(試驗次數(shù)n=3)，表中C+為添加Mal的濃度，GC為使用氣相色譜法對水樣中Mal濃度的檢測結(jié)果，Ct為該傳感器對Mal濃度檢測結(jié)果，r為回收率，RSD為相對標(biāo)準(zhǔn)偏差.如表所示，水樣中加入Mal的回收率為96.60%～101.00%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.39%～6.02%.使用氣相色譜法檢測制備的水樣，所得結(jié)果與使用納米管適配體傳感器所得檢測結(jié)果相比較，兩者基本一致，這表明所構(gòu)建的傳感器可應(yīng)用于檢測實際樣品中的Mal.

表3 自來水中的Mal分析(n=3)

4 結(jié) 論

1)根據(jù)納米通道信號轉(zhuǎn)導(dǎo)所產(chǎn)生的離子電流整流現(xiàn)象，使用玻璃管作為基體，通過在玻璃管的納米通道表面修飾適配體，成功地構(gòu)建了可用于檢測Mal的納米通道適配體傳感器.

2)該傳感器檢測Mal的線性范圍為1.0×10-8～1.0×10-6mol/L，靈敏度高，選擇性好，并成功用于水樣中Mal的檢測，有望替代檢測成本高昂、需要使用大型專用儀器的傳統(tǒng)檢測方法，為靈敏檢測有機磷農(nóng)藥的發(fā)展開辟了新的途徑.