張鈺玲，徐璐，蔣嘉炳，褚志強(qiáng)，李蓓，季倩

肝臟熱缺血再灌注損傷(warm ischemia reperfusion injury,WIRI)是指肝臟的血液供應(yīng)出現(xiàn)阻礙時(shí)，組織代謝供需失衡導(dǎo)致缺氧，當(dāng)血供重新建立、氧氣恢復(fù)后，反而引起嚴(yán)重炎癥反應(yīng)和繼發(fā)性損傷的現(xiàn)象[1,2]。在肝移植、肝部分切除術(shù)等外科手術(shù)中都可能會(huì)出現(xiàn)不同程度的WIRI，其不僅影響術(shù)后肝再生，還可能誘發(fā)嚴(yán)重的術(shù)后并發(fā)癥，如肝功能甚至多器官系統(tǒng)功能衰竭，與患者預(yù)后密切相關(guān)[3]。因此，早期、準(zhǔn)確判斷WIRI的存在及其程度具有重要意義。

肝臟活檢因其侵襲性、不利于持續(xù)監(jiān)測(cè)等原因不能成為常規(guī)檢查方法,而影像學(xué)技術(shù)在無(wú)創(chuàng)評(píng)估肝缺血再灌注損傷方面的優(yōu)勢(shì)顯著。CT灌注成像(CT perfusion imaging，CTPI)已被證明能夠無(wú)創(chuàng)定性定量評(píng)估肝臟血流灌注情況[4]，并且可以區(qū)分梗死區(qū)與非梗死區(qū)[5]；但CTPI存在輻射暴露，且外源性對(duì)比劑存在腎毒性，其應(yīng)用受到限制。MRI無(wú)輻射，具有良好的應(yīng)用前景，其中體素內(nèi)不相干運(yùn)動(dòng)(intravoxel incoherent motion,IVIM)通過(guò)分析多b值反映信號(hào)衰減，將微循環(huán)灌注與純水分子擴(kuò)散區(qū)分開(kāi)，從而反映組織中單純水分子的擴(kuò)散或灌注狀態(tài)[6]。褚志強(qiáng)等[7]證實(shí)了IVIM評(píng)估不同程度WIRI的可行性及診斷價(jià)值。血氧水平依賴(lài)((blood oxygen level dependent，BOLD)技術(shù)利用自身脫氧血紅蛋白作為內(nèi)源性對(duì)比來(lái)反映血氧、血流量和血容量的變化[8]。Jiang等[9]發(fā)現(xiàn)表觀自旋-自旋弛豫率(R2*)有助于表征兔肝WIRI的早期變化和確定其嚴(yán)重程度。但目前關(guān)于IVIM、BOLD和CTPI的對(duì)照研究未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過(guò)應(yīng)用IVIM和BOLD評(píng)估肝WIRI的微循環(huán)和血流動(dòng)力學(xué)改變情況，并與CTPI進(jìn)行比較，以評(píng)價(jià)其診斷價(jià)值。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)對(duì)象及動(dòng)物模型的建立

本研究經(jīng)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并按照機(jī)構(gòu)指南進(jìn)行。選取成年雄性新西蘭大白兔30只，體重2.5～3.0 kg，實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，禁水4 h。據(jù)熱缺血時(shí)間(40 min、60 min)不同，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(G1組、G2組)和對(duì)照組(G0組)，每組10只。稱(chēng)重后以5%水合氯醛(2 mL/kg)靜脈注射及腹腔浸潤(rùn)聯(lián)合麻醉，麻醉后腹部脫毛、剖腹。實(shí)驗(yàn)組分別夾閉肝右葉的肝動(dòng)脈及門(mén)靜脈血流40 min、60 min后，去掉血管夾，關(guān)閉腹腔，恢復(fù)灌注，6 h后行IVIM、BOLD及CTPI檢查。對(duì)照組僅行剖腹手術(shù)和肝韌帶剝離術(shù)而不阻斷血流。

2.MR序列及參數(shù)

采用3T MR(Magnetom Trio Tim，Siemens Healthcare，Germany)掃描儀對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行掃描，實(shí)驗(yàn)前用陸眠靈(0.2 mL/kg)肌肉注射麻醉，仰臥放置于32通道體部相控陣線(xiàn)圈中心，再用腹帶及沙包輔助以減少呼吸運(yùn)動(dòng)。①常規(guī)掃描：軸面T1加權(quán)采用自旋回波(SE)序列，軸面T2加權(quán)采用快速自旋回波(FSE)序列。②IVIM采用單次激發(fā)回波平面成像(SS-EPI)序列進(jìn)行掃描，參數(shù)TR/TE 1000 ms/57.2 ms，體素1.9 mm×1.9 mm×4.0 mm，F(xiàn)OV 180 mm×180 mm，帶寬1184，層數(shù)9，層厚4 mm，矩陣128×128，NEX 3。取11個(gè)b值(0,20,40,60,80,100,150,200,400,600,800 s/mm2)，總檢查時(shí)間為2 min。③BOLD應(yīng)用梯度回波(GRE)序列，成像參數(shù)TR 75 ms，TE 2.57～24.25 ms (9個(gè)回波)，翻轉(zhuǎn)角30°，體素2.0 mm×1.6 mm×4.0 mm，F(xiàn)OV 300 mm×225 mm，矩陣192×154，層數(shù)18，層厚4 mm，總檢查時(shí)間為1 min16 s。

3.CTPI參數(shù)

MR檢查后，采用640層CT (Toshiba Aquillion One，Japan)掃描儀進(jìn)行掃描，掃描前以0.2 mL/kg的劑量肌肉注射陸眠靈行麻醉處理。仰臥位放置，并用腹帶及沙包輔助降低呼吸運(yùn)動(dòng)影響，將耳緣靜脈處放置的26G留置針與高壓注射器連接，先進(jìn)行常規(guī)平掃(管電壓80 kV，管電流50 mAs，掃描野220 mm，層厚5 mm)，再用電影模式對(duì)全肝行軸面動(dòng)態(tài)掃描(管電壓80 kV，管電流75 mAs，掃描野220 mm，層厚0.5 mm)。延遲3 s后經(jīng)高壓注射器注入碘普羅胺(碘濃度370 mg/mL，1 mL/kg，0.5 mL/s)，打藥結(jié)束后用10 mL生理鹽水沖洗，總掃描時(shí)間70 s。

4.圖像后處理

①將IVIM的多b值數(shù)據(jù)發(fā)送至Siemens Post Proc. Evaluation軟件，自動(dòng)獲取灌注相關(guān)擴(kuò)散系數(shù)(Dfast)和灌注分?jǐn)?shù)(PF)圖像。②BOLD經(jīng)Image J軟件(NIH,Bethesda,MD,USA)處理后自動(dòng)生成有效橫向弛豫(T2*)偽彩圖，記錄相應(yīng)圖像上的T2*值，取平均值，表觀自旋-自旋弛豫率(R2*)值由公式R2*=1/T2*值計(jì)算獲得。③將CTPI圖像傳至Toshiba Vitrea工作站，自動(dòng)生成肝動(dòng)脈灌注量(hepatic arterial perfusion,HAP)、肝門(mén)靜脈灌注量(hepatic portal perfusion，HPP)和肝動(dòng)脈灌注指數(shù)(perfusion index，PI)圖像，其中PI由公式PI=HAP/(HAP+HPP)計(jì)算獲得。④數(shù)據(jù)測(cè)量時(shí)肝實(shí)質(zhì)內(nèi)感興趣區(qū)(region of interest，ROI)的選取(圖1)：在肝右后葉勾畫(huà)圓形或橢圓形ROI，選取時(shí)盡量避開(kāi)靠近邊緣或有大血管的區(qū)域，盡量相同位置，且大小相近。選取肝實(shí)質(zhì)中間連續(xù)的3個(gè)層面，每個(gè)層面勾畫(huà)3個(gè)ROI，取9個(gè)ROI的平均值。

圖1 ROI放置示意圖。a)T2WI橫斷面；b)IVIM序列b=0時(shí)橫斷面。

表1 對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間各參數(shù)匯總

5.實(shí)驗(yàn)室檢查

掃描后，采集實(shí)驗(yàn)兔靜脈血。利用全自動(dòng)生化分析儀(東芝，型號(hào)TAB-40F2)檢測(cè)血清谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)及乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)含量，用于評(píng)價(jià)肝功能。隨后以空氣栓塞法處死實(shí)驗(yàn)兔，取新鮮肝組織凍存。利用分光光度儀檢測(cè)凍存肝組織丙二醛(malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)水平。將新鮮肝組織去除包膜后切成1 cm3小塊，用10%甲醛固定，石蠟包埋，制成切片，用蘇木素-伊紅(HE)法進(jìn)行染色，置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

6.統(tǒng)計(jì)分析

結(jié) 果

1.對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間各參數(shù)的比較

多組間Dfast、PF、R2*、HAP、HPP、PI差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表1)；且隨著熱缺血時(shí)間延長(zhǎng)，Dfast和PF降低，R2*、PI升高，HAP、 HPP先升高再減低 (表2，圖2)。

表2 IVIM、BOLD、CTPI參數(shù)的相關(guān)性分析

兩兩比較顯示，Dfast、PF、HAP、PI：G0組與G1組，G0組與G2組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。R2*：G0組與G2組間的差異性顯著(P<0.05)。HPP：G0組與G1組，G1組與G2組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2)。

圖2 a～f分別為參數(shù)Dfast、PF、R2*、HAP、HPP、PI的G0、G1、G2組間比較小提琴圖。*P<0.05，** P<0.001。隨著缺血時(shí)間延長(zhǎng)，Dfast和 PF降低，R2*、PI升高，HAP、HPP先升高再減低。

2.IVIM、BOLD與CTPI各參數(shù)相關(guān)性分析

相關(guān)性分析顯示，Dfast與PI呈負(fù)相關(guān)，PF與PI、HAP呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。R2*與CTPI各參數(shù)之間均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

3.IVIM、BOLD、CTPI參數(shù)與生化指標(biāo)之間的相關(guān)性分析

Dfast、PF均與ALT、AST呈負(fù)相關(guān)，與SOD呈正相關(guān)；Dfast與LDH呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。R2*與ALT、AST呈正相關(guān)(P<0.05)。HAP、PI與ALT、AST、SOD呈正相關(guān)，HAP與LDH呈正相關(guān)，PI與MDA呈正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表3。其余各參數(shù)間均無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。

表3 各參數(shù)與生化指標(biāo)的相關(guān)性分析

4.IVIM、BOLD與CTPI診斷效能的比較

評(píng)價(jià)有無(wú)WIRI時(shí)，IVIM、BOLD、CTPI 的AUC分別為0.989、0.757、0.951，其中IVIM與CTPI間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 且IVIM的診斷效能最高。評(píng)價(jià)肝WIRI程度時(shí)，IVIM、BOLD、CTPI的AUC分別為 0.778、0.654、0.963，其中IVIM與CTPI間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且IVIM的診斷效能高于BOLD(表4、5、圖3)。

圖3 各參數(shù)ROC曲線(xiàn)分析。a) IVIM、BOLD、CTPI診斷WIRI的ROC曲線(xiàn)分析；b) IVIM、BOLD、CTPI診斷WIRI程度的ROC曲線(xiàn)分析。

表4 IVIM、BOLD、CTPI診斷有無(wú)WIRI的ROC曲線(xiàn)分析

表5 IVIM、BOLD、CTPI診斷WIRI程度的ROC曲線(xiàn)分析

討 論

肝WIRI是一個(gè)多細(xì)胞、多因子、多介質(zhì)共同參與的動(dòng)態(tài)過(guò)程，涉及一系列肝臟微環(huán)境的改變，對(duì)肝臟手術(shù)患者術(shù)后恢復(fù)意義重大。CTPI和MRI反映肝臟血流灌注各有優(yōu)缺點(diǎn)。CTPI能夠動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)肝WIRI后肝臟血流動(dòng)力學(xué)變化[5,10]，但其固有的對(duì)比劑和電離輻射問(wèn)題始終不可忽視。近年來(lái)，多參數(shù)MRI[11]逐漸用于評(píng)估WIRI。Yang等[12]發(fā)現(xiàn)MRI可以反映發(fā)生肝WIRI時(shí)的病理生理變化過(guò)程及微循環(huán)、灌注的改變。但目前關(guān)于IVIM、BOLD和CTPI的對(duì)照研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究首次對(duì)比IVIM、BOLD及CTPI評(píng)價(jià)不同程度(40 min，60 min)肝WIRI的微循環(huán)及血流動(dòng)力學(xué)變化情況，并比較其診斷效能。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是評(píng)價(jià)有無(wú)肝WIRI還是判斷其程度，IVIM診斷效能均高于BOLD，且IVIM與CTPI的診斷效能之間均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示IVIM更適合常規(guī)應(yīng)用于臨床，以無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)肝WIRI的微循環(huán)改變情況。

本研究結(jié)果顯示對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組間IVIM、BOLD及CTPI各參數(shù)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與既往研究結(jié)論[5,11]一致。組間比較顯示實(shí)驗(yàn)組的Dfast及PF值均低于對(duì)照組，且隨著熱缺血時(shí)間延長(zhǎng)均呈逐漸下降趨勢(shì)，原因可能是隨著損傷加重，肝細(xì)胞水腫、炎癥介質(zhì)浸潤(rùn)、纖維增生等變化引起肝血竇阻塞，血液輸送受阻，血流量減低，導(dǎo)致Dfast、PF值減小。有研究曾提出Dfast值與毛細(xì)血管平均血流速度有關(guān)[13]，本研究提示Dfast值在一定程度上可以反映WIRI時(shí)毛細(xì)血管血流的狀態(tài)。熱缺血會(huì)引起肝臟局部微環(huán)境閉塞、組織灌注減少，進(jìn)而導(dǎo)致局部體素的磁敏感性發(fā)生改變，去氧血紅蛋白分?jǐn)?shù)增加，R2*值隨之增加，從而很好地表征肝損傷后局部組織的含氧水平。缺氧引起Kupffer細(xì)胞釋放氧自由基、炎癥因子，動(dòng)脈緩沖效應(yīng)(HABR)[14]被激活，小動(dòng)脈及小門(mén)靜脈通透性增加；且肝竇阻塞使血管阻力增加，腺苷堆積，誘導(dǎo)血管舒張，HAP、HPP、PI增加；隨著WIRI加重，代謝產(chǎn)物堆積，HABR緩沖能力下降，加之肝內(nèi)門(mén)體分流開(kāi)放[5]，HPP減少，肝動(dòng)脈通過(guò)血流量的改變緩沖門(mén)脈血流下降，因此HAP無(wú)明顯下降，PI仍呈增加趨勢(shì)。

本研究顯示Dfast與PI相關(guān)性較低，與Guo等[13]的研究結(jié)果一致。Cohen等[15]提出使用低b值較少可能會(huì)導(dǎo)致對(duì)灌注的低估，因此為了提高PF與Dfast擬合的準(zhǔn)確性[16]，本研究采用8個(gè)200 s/mm2以下的b值。此外呼吸運(yùn)動(dòng)偽影和圖像低信噪比可能也有一定的影響。Dfast與PF均能反映灌注信息，但強(qiáng)調(diào)不同方面：Dfast與毛細(xì)血管流速相關(guān)[13]，而PF表示的是毛細(xì)血管血流占組織血流的容積分?jǐn)?shù)，代表毛細(xì)血管的豐富程度[17]。研究[18]表明PF與CTPI得到的血容量具有良好的相關(guān)性，本實(shí)驗(yàn)中PF與HAP、PI相關(guān)，證實(shí)PF能夠反映毛細(xì)血管的灌注量。血氧水平、鐵含量[19]、血流量和血容量都能影響R2*值，單純BOLD可能并不能很好地區(qū)分局部組織氧合與灌注狀態(tài)，因此導(dǎo)致本研究中R2*值與CTPI各項(xiàng)參數(shù)均無(wú)相關(guān)性。

肝臟的酶學(xué)指標(biāo) ALT、AST、LDH能夠提示肝細(xì)胞的損傷程度，尤其是ALT[20]。過(guò)氧化反應(yīng)產(chǎn)物MDA積累會(huì)加劇細(xì)胞膜的損傷，MPO在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用，SOD主要參與在機(jī)體氧化/抗氧化的平衡調(diào)節(jié)，可以清除機(jī)體多余的氧自由基。再灌注時(shí)，肝組織代謝障礙導(dǎo)致SOD合成不足，氧化/抗氧化失衡、氧自由基清除障礙，引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化物反應(yīng)，導(dǎo)致MDA積累，但由于缺氧階段自由基產(chǎn)生較少，MDA生成也不會(huì)太多。本研究結(jié)果顯示多個(gè)IVIM、BOLD及CTPI參數(shù)與生化指標(biāo)具有較好的相關(guān)性，提示IVIM、BOLD及CTPI不僅能敏感地反映肝細(xì)胞的損傷程度，還能較好地表征肝功能的變化及組織抗氧化能力，并且也可以提示不同熱缺血程度時(shí)微循環(huán)變化。

本研究存在一些局限性。①每組實(shí)驗(yàn)兔數(shù)目較少。②掃描過(guò)程中因?qū)嶒?yàn)兔無(wú)法憋氣，可能對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的測(cè)量和圖像質(zhì)量存在一定影響。③能夠反映肝血流灌注信息的MRI技術(shù)不只IVIM、BOLD，未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步探索更多MRI序列的應(yīng)用。④肝WIRI本質(zhì)上是一個(gè)動(dòng)態(tài)過(guò)程，具有時(shí)間依從性，而本研究?jī)H在特定時(shí)間框架內(nèi)進(jìn)行的，有待進(jìn)一步縱向研究以揭示其演變過(guò)程。

因此，與CTPI相比，IVIM能無(wú)創(chuàng)、較好反映肝WIRI時(shí)肝組織微循環(huán)和血流動(dòng)力學(xué)變化情況，有望臨床應(yīng)用時(shí)取代CTPI。