邢安琪，武子辰，徐曉寒，孫怡，王艮梅，王玉花*

茶樹富集氟的特點(diǎn)及其機(jī)制的研究進(jìn)展

邢安琪1，武子辰1，徐曉寒1，孫怡1，王艮梅2，王玉花1*

1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，江蘇 南京 210095；2. 南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037

茶樹是一種超累積氟的植物，其體內(nèi)的氟含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他植物，卻不表現(xiàn)氟中毒癥狀。氟不是茶樹生長的必需元素，但在高氟脅迫下，氟可通過破壞茶樹的細(xì)胞結(jié)構(gòu)、抑制酶活性等影響其正常生長。通過闡述茶樹吸收、富集氟及其累積/解毒機(jī)制等方面的研究進(jìn)展，以期為未來研究茶樹氟累積和降氟技術(shù)提供理論依據(jù)。

茶樹；氟；富集機(jī)制

氟是植物生長過程中的非必需元素，根據(jù)植物對氟污染反應(yīng)的不同可以分為敏感、中等敏感和抗性3種類型[1]。其中，茶樹屬于氟抗性植物，且葉片是茶樹氟富集的主要器官[2]。閩南茶樹的一芽三葉中氟含量大致范圍在69～299?mg·kg-1[3]，四川茶園茶樹葉片的氟含量可高達(dá)2?965?mg·kg-1[4]，安徽茶園茶樹的成熟葉片氟含量也高達(dá)1?155.2?mg·kg-1[5]。針對閩南采集的55份茶樹樣本，通過組間平均聯(lián)結(jié)法對茶葉氟含量的差異進(jìn)行聚類分析得出3個(gè)類群，分別為低累積、中度累積和高累積氟元素的茶樹類型[3]?？梢娺@些茶樹葉片氟含量的差異與品種緊密相關(guān)，并且這些茶樹在存在一定濃度氟的生長環(huán)境中并未呈現(xiàn)受傷害的狀況。但當(dāng)植物氟含量超過耐受范圍時(shí)，植物損傷最先出現(xiàn)在葉片上，即葉緣和葉尖壞死，隨后出現(xiàn)葉片萎黃甚至壞死等一系列癥狀[6]。

茶樹作為葉用植物，其葉片的氟含量過高，會對茶葉的兒茶素、氨基酸、香氣等品質(zhì)成分產(chǎn)生不利影響[7-8]。此外，茶葉在沖泡過程中約有42%～86%的氟溶于茶湯，進(jìn)而被人體吸收，長期積累，會增加人體患“飲茶型氟中毒”的風(fēng)險(xiǎn)[9]。因此，了解茶樹吸收、累積氟的特點(diǎn)，可以針對性地提出有效降低茶樹累積氟的措施，減少茶葉的氟含量，對提高茶葉品質(zhì)和質(zhì)量安全具有重要意義。

1 茶樹吸收、富集氟的特性

1.1 茶樹對氟的吸收

在氟污染的大氣環(huán)境中，茶樹主要通過葉片氣孔或表皮角質(zhì)層吸收大氣中的氟，并且可沿導(dǎo)管向葉片尖端和邊緣轉(zhuǎn)移（圖1）。

茶樹主要通過根系吸收土壤和水環(huán)境中的氟，并通過蒸騰作用、質(zhì)外體和共質(zhì)體途徑等進(jìn)行氟轉(zhuǎn)運(yùn)[10]。王玉梅等[11]通過研究茶樹根系對氟的吸收發(fā)現(xiàn)，在0～5.0?mmol·L-1的氟處理?xiàng)l件下茶樹對氟的吸收符合Michalis-Menten動力學(xué)模型。張磊等[12]也發(fā)現(xiàn)，茶苗在0～2.0?mg·L-1的氟處理下其吸收動力學(xué)曲線符合Michalis-Menten動力學(xué)模型；在氟濃度為0～0.8?mg·L-1時(shí)，茶苗吸收速率隨外界氟濃度增加而迅速增加；而在氟質(zhì)量濃度為0.8～2.0?mg·L-1時(shí)，其吸收速率趨于穩(wěn)定。張磊[13]認(rèn)為，茶樹對氟的吸收，在氟濃度較低時(shí)為主動吸收過程，而在氟濃度較高時(shí)以被動吸收為主導(dǎo)。彭傳燚等[14]對茶樹吸收氟的濃度動力學(xué)特性研究表明，在0.1～10?mg·L-1的氟質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，茶樹根系對氟離子的吸收是主動吸收，并符合Michaelis-Menten動力學(xué)模型，而在高氟條件（50～100?mg·L-1）下則表現(xiàn)出被動吸收氟的過程。此外，茶樹主要吸收土壤中的水溶性氟。諸多研究表明黔西北高氟病區(qū)[15]、安徽[5]、粵東鳳凰山茶區(qū)[16]、四川、重慶、云南、湖北、湖南茶園[17]等不同產(chǎn)茶區(qū)土壤的水溶性氟含量均低于10?mg·kg-1。因此，我國大多數(shù)茶園茶樹的氟吸收主要依賴于根系的主動吸收。

注：茶樹吸收來自空氣、土壤、大氣（a1、a2、a3）中的氟（F）；茶樹根部吸收的F可向地上部轉(zhuǎn)移并貯存（b1）；沿導(dǎo)管向葉片尖端和邊緣轉(zhuǎn)移并積累（b2和b3）；老葉中的F可向新梢和地下部轉(zhuǎn)移（b4）

主動吸收需要的能量主要通過H+-ATPase產(chǎn)生，王玉梅[18]研究發(fā)現(xiàn)，外源施加NaF可以激發(fā)H+-ATPase的活性，刺激質(zhì)子驅(qū)動力的形成，促進(jìn)茶樹根系對F的吸收。但H+-ATPase介導(dǎo)的茶樹根系跨膜主動吸收氟的分子機(jī)制仍有待研究。Ca2+-ATPase介導(dǎo)的茶樹根系跨膜主動吸收氟主要是通過激活類受體蛋白激酶（RLK）識別氟，激活Ca2+-ATPase活性促進(jìn)茶樹吸收氟[19]（圖2）。而目前關(guān)于茶樹吸收氟分子機(jī)制的研究較多針對離子通道蛋白，尤其是近來發(fā)現(xiàn)的特定吸收轉(zhuǎn)運(yùn)氟的離子通道[20]，CLC超家族陰離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的一個(gè)亞類——CLCF型F-/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以及在原核生物中稱作“crcB（Fluc）”，但在真核生物中稱為FEX（Fluorie exporter）的小膜蛋白家族。茶樹的CLC基因?qū)-的響應(yīng)更敏感[21]；茶樹氟化物輸出基因FEX具有組織特異性，并在茶樹的氟吸收轉(zhuǎn)運(yùn)中起重要作用[22]。王玉梅[18]研究表明，ABC（ATP-binding cassette）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主要是ABC中A—G亞家族在茶樹F/C1跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)中發(fā)揮載體作用。廣敏[23]研究發(fā)現(xiàn)，CsCL667蛋白含有典型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域，并且和茶樹CsFEX屬于同一基因家族的不同分支；氟不僅誘導(dǎo)該基因的表達(dá)量，同時(shí)也顯著增加了ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量，而且ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對氟的轉(zhuǎn)運(yùn)能力增強(qiáng)，大量的氟吸收進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)累積。研究茶樹氟富集首先需探明茶樹如何吸收氟，雖然目前已有研究對相關(guān)基因進(jìn)行了克隆及異源表達(dá)驗(yàn)證，但有關(guān)茶樹吸收氟的分子機(jī)制仍需探索。

1.2 影響茶樹吸收及轉(zhuǎn)運(yùn)氟的因素

茶樹根系對氟的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)受氟的存在形態(tài)、pH、其他元素（如Al3+、Ca2+、Cl-等）離子通道、離子通道抑制劑及溫度等因素的影響。

氟在土壤中主要以難溶態(tài)、可交換態(tài)和水溶態(tài)等形式存在[17]，其中難溶態(tài)和可交換態(tài)氟難以被茶樹吸收，水溶態(tài)則是茶樹吸收氟的主要形式，而水溶性氟濃度受pH的影響顯著。茶樹適宜生長在pH為4.0～6.5的酸性環(huán)境中，當(dāng)培養(yǎng)液pH在4.0～6.0時(shí)，茶樹根系的氟吸收量隨pH的增加呈現(xiàn)先增加后減少的變化，并且在pH為5.5時(shí)達(dá)到最大吸收量[24]。在酸性條件下F-優(yōu)先與Al3+形成絡(luò)合物，并以該絡(luò)合物為主要形式被茶樹吸收[25]。有學(xué)者針對茶樹在木質(zhì)部的轉(zhuǎn)運(yùn)提出兩種不同的氟轉(zhuǎn)運(yùn)形式，一種認(rèn)為茶樹分別轉(zhuǎn)運(yùn)鋁和氟[26]至葉片后再進(jìn)行積累；另一種則認(rèn)為茶樹直接以氟鋁絡(luò)合物形式轉(zhuǎn)運(yùn)[27]。鋁同樣在緩解茶樹氟脅迫中起重要作用。當(dāng)Al/F摩爾濃度比小于1時(shí)，氟將導(dǎo)致茶樹葉片壞死，而Al濃度的適當(dāng)增加，茶樹會通過形成Al-F絡(luò)合物減少游離氟存在的形式緩解茶葉的氟損害[25]，以此增強(qiáng)茶樹對氟的抗性，這可能是茶樹氟富集的生理機(jī)制之一。此外，Ca2+與F-會形成CaF2沉淀，進(jìn)而降低土壤水溶性氟的含量，影響茶樹對氟的吸收[28]。也有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，外源施加0.01～0.5?mmol·L-1Ca2+時(shí)，能夠有效降低茶葉中的氟含量[29]，這可能與Ca2+改變了茶樹根系細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和膜通透性有關(guān)[24]。另一方面，一些相同價(jià)態(tài)的陰離子也會對茶樹體內(nèi)的F-產(chǎn)生影響，例如Cl-和F-可能通過競爭同一載體的吸附位點(diǎn)，從而兩者間存在競爭性抑制作用，因此Cl-會降低茶樹對F-的吸收，同時(shí)F-也會干擾Cl-的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)[11]。Zhang等[30]發(fā)現(xiàn)，施用陰離子通道抑制劑NPPB[5-硝基-2-(3-苯丙胺)-苯甲酸]會造成茶樹的氟累積量減少，并且通過比較外施陰離子通道抑制劑、陽離子通道抑制劑、水通道抑制劑的研究發(fā)現(xiàn)[31]，外施陰離子通道抑制劑可以更顯著地減少茶樹根系對氟的吸收。因此，部分氟可通過水通道蛋白被吸收，而陰離子通道則是茶樹根系吸收氟的主要通道（圖2）。

茶樹根系對氟的主動吸收依賴于質(zhì)膜H+-ATPase水解ATP形成的電勢差和能量[32]。在低溫（4℃）條件下，茶樹根系質(zhì)膜H+-ATPase的活性被抑制，茶樹根系對氟的吸收也受到顯著的抑制[11]；高溫（35℃）處理時(shí)，則明顯提高根系對氟的吸收[33]。氟的吸收還與Ca2+-ATPase相關(guān)，受體蛋白激酶（RLK）通過活化Ca2+-ATPase并將其作為茶樹吸收氟的載體，進(jìn)而促進(jìn)氟的吸收[19]。與此同時(shí)，Al3+處理可以誘導(dǎo)茶樹根系產(chǎn)生Ca2+信號，進(jìn)而激活鈣調(diào)蛋白（CaM），促進(jìn)氟的吸收[32]。另一方面，質(zhì)膜H+-ATPase產(chǎn)生的H+梯度，也可以促進(jìn)植物體內(nèi)Ca2+信號傳導(dǎo)，以此調(diào)控離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)[34]，影響氟吸收。

注：茶樹通過水通道蛋白吸收F（a）；F刺激RLKs表達(dá)，進(jìn)一步激活Ca2+-ATPase，同時(shí)Ca2+-ATPase本身作為載體吸收F (b)；細(xì)胞壁中的果膠及其周圍的金屬離子等與F螯合（c）；液泡貯存F（d）；通過FEX、CLCF等離子通道外排F（e）

1.3 茶樹富集氟的特性

茶樹各器官對氟的積累強(qiáng)度有很大不同，其中葉片的氟含量遠(yuǎn)大于吸收器官根和運(yùn)輸器官莖。沙濟(jì)琴等[2]發(fā)現(xiàn)茶樹各器官的氟積累強(qiáng)度順序?yàn)槿~>花蕾>茶籽>茶果皮>細(xì)枝>骨干枝>細(xì)根>主軸莖>主干莖>主根>側(cè)根，唐茜等[35]的研究也證實(shí)了茶樹各組織的聚氟能力依次為葉片>新梢>枝條>莖>根。此外，不同成熟度的茶樹葉片氟含量差異顯著，一般表現(xiàn)為成熟葉>嫩葉[5]。李麗霞等[36]發(fā)現(xiàn)，處于無氟水培條件下的茶樹，其吸收根和新梢的氟含量增加，并認(rèn)為這是由于茶樹體內(nèi)的氟進(jìn)行了轉(zhuǎn)移與再分配的結(jié)果。茶樹體內(nèi)的氟具有可移動性且這種轉(zhuǎn)移特性決定了氟在新梢中的含量變化，同時(shí)發(fā)現(xiàn)氟可進(jìn)行茶樹體內(nèi)的再分配，具有向生長部位轉(zhuǎn)移的特性，即將枯萎的老葉可以將氟向新梢和根系轉(zhuǎn)移分配。不止是茶樹，蘿卜為保護(hù)其可食用部分不受損害也具有將過量的氟從根部轉(zhuǎn)移到葉片的功能[37]。菠菜在0～800?mg·kg-1土培氟處理中，發(fā)現(xiàn)同樣也具有在組織水平上再分配氟化物的獨(dú)特機(jī)制[38]，造成菠菜根部的氟含量高于地上部氟含量，這可能與根部內(nèi)胚層的滲透性較低有關(guān)[39]。總而言之，茶樹葉片是氟富集的主要組織，而且由于氟可能以相當(dāng)部分的游離態(tài)形式存在，這種形態(tài)的氟在植物體內(nèi)具有轉(zhuǎn)移與再分配的特性，使得茶樹葉齡也對氟的累積產(chǎn)生了一定的影響。

2 氟對茶樹的影響及其抗性機(jī)制

氟對植物的損害主要表現(xiàn)在對細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，如細(xì)胞膜系統(tǒng)、葉綠體和線粒體等，進(jìn)而對光合作用、呼吸作用等生理活動及一些關(guān)鍵酶活性產(chǎn)生抑制作用等。此外，氟對植物的損害程度與其濃度及接觸時(shí)間密切相關(guān)。當(dāng)環(huán)境中氟濃度較低時(shí)，植株僅會出現(xiàn)葉片變黃、萎蔫的癥狀；隨著氟濃度逐漸升高，植物葉片將會枯死，甚至整個(gè)植株也會死亡，并且氟處理濃度越高，植物出現(xiàn)傷害癥狀的時(shí)間就越早[40]。李麗霞等[36]發(fā)現(xiàn)，福鼎大白茶在低氟濃度下仍然表現(xiàn)出良好的長勢；當(dāng)氟質(zhì)量濃度達(dá)到200?mg·L-1時(shí)，14?d后的茶苗開始出現(xiàn)葉色黯淡，少量葉片脫落的現(xiàn)象；而氟質(zhì)量濃度升至250?mg·L-1以上時(shí)，茶苗在第12天開始出現(xiàn)脅迫癥狀并表現(xiàn)為葉片輕易脫落，根系逐漸轉(zhuǎn)黑。植物可通過外排機(jī)制和內(nèi)部耐受的方式增加自身對氟脅迫的抗性，同樣的，茶樹可通過外部排斥的方式防止茶樹吸收過量的氟，即利用茶樹細(xì)胞壁對氟進(jìn)行抵御，同時(shí)，茶樹體內(nèi)也產(chǎn)生一系列反應(yīng)機(jī)制增強(qiáng)自身的氟抗性，應(yīng)對氟脅迫。

2.1 細(xì)胞壁和液泡對氟的螯合與區(qū)隔化

細(xì)胞壁作為植物抵御外界不良環(huán)境的第一層屏障，其多糖、果膠、蛋白質(zhì)等組分含有的醛基、羧基、氨基和磷酸鹽等基團(tuán)結(jié)構(gòu)及其吸附在細(xì)胞壁周圍的一些金屬離子等都具有螯合氟的作用[28,41-42]。氟主要分布于茶樹葉片和根的細(xì)胞壁中，且90%以上的氟聚集在細(xì)胞壁的果膠和半纖維素，并且與-NH2、-COOH、-OH和金屬離子分別以氫鍵、離子鍵結(jié)合的形式螯合[42]。外源氟進(jìn)入細(xì)胞壁會對細(xì)胞壁離子穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生干擾，進(jìn)而通過改變細(xì)胞壁的電荷、酶活性等對細(xì)胞壁組成結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響，進(jìn)而突破細(xì)胞壁的阻滯進(jìn)入原生質(zhì)體。Gao等[43]通過離子色譜和原子吸收光譜法檢測茶樹中氟的亞細(xì)胞分布，發(fā)現(xiàn)茶葉原生質(zhì)體中98.1%的氟儲存于液泡中，表明胞質(zhì)中過多的氟被液泡吸收區(qū)隔化，液泡是氟累積的主要場所。因此，不僅是細(xì)胞壁對氟的螯合，液泡的區(qū)隔化作用同樣可以阻止過多的氟對細(xì)胞器造成傷害，這些是茶樹具有氟抗性的主要因素。

此外，添加氟可以增加果膠含量和脫甲基酯化作用，從而增加金屬陽離子的吸收以及氟在細(xì)胞壁的螯合[44]。在外源施加氟后，與果膠生物合成途徑相關(guān)的關(guān)鍵酶的基因表達(dá)、酶活性以及果膠多糖的含量增加，這表明外源施加氟促進(jìn)了茶樹體內(nèi)果膠的生物合成，進(jìn)而有助于果膠結(jié)合茶樹吸收的外源氟[45]。茶多糖本身也具有吸附結(jié)合氟的能力，這與其組成、結(jié)構(gòu)有關(guān)。茶多糖包含蛋白質(zhì)、糖醛酸、中性糖、金屬離子等多種物質(zhì)。與其他植物多糖相比，茶多糖中氟含量最高、絡(luò)合氟能力最強(qiáng)，茶葉中80%的氟與茶多糖結(jié)合[46]，這種特殊絡(luò)合形式也是增強(qiáng)植物氟抗性的因素之一。

2.2 其他離子結(jié)合

高慧敏等[41]研究表明，Mn2+、Fe3+、Al3+等離子在多糖結(jié)合氟中發(fā)揮作用。游離氟可以與Al3+、Fe3+和Ca2+等陽離子螯合形成AlFn3-n、FeFn3-n和CaF2等絡(luò)合物，從而降低氟對茶樹的毒害[43]。鋁的施加顯著增加葉片吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)氟，同時(shí)緩解氟脅迫造成的茶樹葉片光合效率下降，尤其是添加低濃度的鋁，可以顯著地提高葉片光合效率[47]。Luo等[29]發(fā)現(xiàn)，外源施加5?mmol·L-1Ca2+能夠有效降低茶樹的氟含量及丙二醛（MDA）含量，增加咖啡因、多酚和兒茶素的含量，同時(shí)還可以調(diào)節(jié)B3+、Al3+、Cu2+和Zn2+的離子穩(wěn)態(tài)等，進(jìn)而增強(qiáng)茶樹的氟抗性。由此可見，茶樹在氟處理后可通過其體內(nèi)不同離子的變化，調(diào)節(jié)離子平衡，從而維持滲透穩(wěn)態(tài)增強(qiáng)茶樹的氟耐受性。

2.3 初級代謝產(chǎn)物和次生代謝產(chǎn)物

氟處理誘導(dǎo)茶葉的次要多肽，碳水化合物和氨基酸等代謝物質(zhì)發(fā)生變化，為維持氟環(huán)境下茶樹的穩(wěn)態(tài)發(fā)揮重要的自防御機(jī)制[48]。Li等[49]研究表明，茶葉的多酚、總兒茶素和蛋白質(zhì)等成分在0～0.84?mmol·L-1的氟處理下隨氟濃度的增加而顯著下降。而盧莉等[50]發(fā)現(xiàn)，武夷水仙嫩葉及老葉中茶多酚、氨基酸、咖啡堿、水浸出物等含量在氟處理下，其變化呈現(xiàn)低濃度促進(jìn)、高濃度抑制的規(guī)律，說明氟對茶樹的生理代謝具有雙重作用。4?mg·L-1以下的氟質(zhì)量濃度會促進(jìn)一些有利于茶葉品質(zhì)的氨基酸合成，改善茶葉品質(zhì)，而6～16?mg·L-1的氟質(zhì)量濃度則會減少氨基酸的合成并降低茶葉的品質(zhì)[7]，因此推測外源施加6?mg·L-1的氟質(zhì)量濃度可能是茶苗對氟耐受性的閾值。此外，香氣作為茶葉重要的品質(zhì)特征之一，已有研究指出茶葉香氣成分的含量隨氟濃度的增加而降低，其中揮發(fā)性烷烴、烯烴、酯、芳香族化合物、醛、酮和酚類等化合物都呈現(xiàn)出先增加后減少的趨勢，只有醇類呈現(xiàn)相反的趨勢，可見高濃度氟對茶葉香氣和風(fēng)味品質(zhì)具有不利影響[8]。

植物在逆境條件下，其細(xì)胞會迅速累積脯氨酸、有機(jī)酸、糖醇類等物質(zhì)。氟脅迫下茶樹游離脯氨酸的含量增加，而脯氨酸具有提高原生質(zhì)滲透壓，防止水分散失的作用，說明氟脅迫下積累脯氨酸是茶樹應(yīng)對氟脅迫的一種保護(hù)反應(yīng)[51]。氟同樣對茶樹體內(nèi)的有機(jī)酸含量產(chǎn)生顯著影響，葉片中草酸含量隨氟濃度升高呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，而檸檬酸的含量不斷升高[52]。還有研究發(fā)現(xiàn)氟處理下茶樹葉片中蘋果酸脫氫酶和檸檬酸合成酶的活性均顯著高于根部，有利于葉片中蘋果酸和檸檬酸合成并向根系運(yùn)輸，進(jìn)而參與根系有機(jī)酸的分泌，調(diào)節(jié)茶苗對氟的適應(yīng)[53]。

茶多酚（包括兒茶素）作為茶葉的次級代謝產(chǎn)物，具有清除自由基、提高抗氧化能力、減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物等作用，在抗逆性中發(fā)揮積極作用。兒茶素通過自身的分解代謝為木質(zhì)素的合成提供基本的碳骨架，增強(qiáng)細(xì)胞壁，參與茶樹形態(tài)建成，同時(shí)促進(jìn)木質(zhì)部的運(yùn)輸，參與茶樹的抗逆性[54]。此外，還發(fā)現(xiàn)PAL（Phenylalanine ammonialyase），DFR（Dihydroflavanol 4-reductase）和LCR（Leucoanthocyani-din reductase）的活性與不同濃度氟處理下的多酚含量具有相似趨勢，這些與生物合成相關(guān)的酶調(diào)節(jié)茶樹在氟處理下茶多酚的生物合成[7]，進(jìn)而增加茶樹的抗逆性。

此外，一些植物生長調(diào)節(jié)劑（PGRs）如赤霉素（Gibberellins，GA）、ABA、生長素、乙烯、細(xì)胞分裂素、水楊酸（Salicylic acid，SA）、油菜素類固醇（Brassinosteroids）、茉莉酸酯（Jasmonates）和多胺（Polyamines）等在植物逆境條件下和信號傳導(dǎo)過程中發(fā)揮著重要作用。勾曉華等[55]發(fā)現(xiàn)在外界不良環(huán)境刺激下，乙烯含量增加將參與氣孔的調(diào)節(jié)，使通過氣孔進(jìn)入植物的大氣污染物減少，從而發(fā)揮保護(hù)植物的作用。而氟化物可通過抑制SOD的活性，導(dǎo)致產(chǎn)生過量乙烯誘導(dǎo)纖維素酶的合成，最終引起葉片過早脫落[56]。但針對激素類對茶樹富集氟方面的研究甚少，可作為今后研究的方向之一。

2.4 抗氧化系統(tǒng)

高氟脅迫下茶樹受到明顯的氧化損傷，有研究報(bào)道稱，茶樹對氟耐受極限為11.84?mg·L-1，暴露于超過此濃度的生長條件下，茶樹的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)會有一定程度的破壞[57]。因此，當(dāng)氟濃度升高至超過其防御能力時(shí)，茶樹體內(nèi)將累積過多的活性氧（ROS），導(dǎo)致葉綠體類囊體膜遭受傷害，進(jìn)而造成細(xì)胞膜裂解、葉綠體膜結(jié)構(gòu)破壞、葉綠素含量降低[57]。茶樹葉片中的ROS包括超氧陰離子（O2-）和過氧化氫（H2O2）不斷積累，丙二醛（MDA）的含量也在顯著升高（圖3），電導(dǎo)率不斷增大[58]。與此同時(shí)，一些活性氧清除劑如過氧化物酶（POD）、過氧化氫酶（CAT）和超氧化物歧化酶（SOD）的活性在低濃度氟處理下明顯增加（圖3），以消除ROS，維持細(xì)胞代謝的穩(wěn)定性[58]。然而，高濃度氟處理導(dǎo)致ROS積累量超出茶樹自身所能調(diào)節(jié)的范圍后，抗氧化酶的清除能力明顯降低[58]。另有研究發(fā)現(xiàn)4?mg·L-1和12?mg·L-1氟處理時(shí)，葉片質(zhì)膜透性和根系活力均低于對照組，而茶葉的CAT、POD和SOD活性增強(qiáng)[52]，表明茶樹可以通過增加酶的活性抵御氟帶來的氧化損傷。

在一定濃度氟閾值下，茶樹可以通過調(diào)控自身代謝清除過多的ROS，使自身免受傷害，其中抗壞血酸-谷胱甘肽（ASA-GSH）循環(huán)在茶樹響應(yīng)氟脅迫時(shí)也起到了重要作用[59]。在低濃度的氟脅迫下，茶苗可通過ASA-GSH循環(huán)及體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，在一定程度上提高抗氧化酶活性以清除氟脅迫產(chǎn)生的過量活性氧自由基，以減輕ROS對膜的傷害[60]。在ASA-GSH循環(huán)中一些主要的酶，如谷胱甘肽還原酶（GR）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）的活性，隨氟處理濃度的升高表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢（圖3）[58]。因此，這也說明了在低濃度的氟脅迫下，茶樹可以通過提高AsA-GSH循環(huán)中的酶性活增強(qiáng)對不良環(huán)境的抵抗能力。

2.5 有機(jī)物代謝

低濃度氟處理下，茶樹葉片的葉綠素含量和光合速率略微升高[61]，而過量的F-容易與葉綠素中的Mg2+結(jié)合或固定[57]，導(dǎo)致葉綠素的合成受抑制，進(jìn)而抑制植物的生長。此外，高濃度氟破壞葉片的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)[57]，削弱茶樹葉片的光合電子傳遞能力，進(jìn)而影響茶樹的光合效率（圖4）。此外，氟化物還可以通過抑制葉綠體類囊體膜上的ATP合酶活性從而阻礙光合磷酸化[62]，并通過抑制核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶（Rubisco）的活性從而阻礙碳同化過程[63]。碳水化合物的代謝包括光合作用合成有機(jī)物及有機(jī)物分解釋放能量[63]，其代謝所需能量主要依賴于糖類，而高氟茶樹品種可以補(bǔ)償在高氟環(huán)境下光能消耗而導(dǎo)致的離子不平衡，增加糖基轉(zhuǎn)移酶和水解酶的表達(dá)水平，使更多的淀粉和纖維素被重新分配給葡萄糖，為茶樹的耐受過程提供更多能量[64]。

氟化物還通過抑制谷酰胺合成酶、谷氨酸脫氫酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶的活性，導(dǎo)致植物的固氨能力下降，減少蛋白質(zhì)合成所需的氨基酸，抑制蛋白質(zhì)的合成，加速蛋白質(zhì)的分解，破壞植物的氮代謝[65]。Yu等[66]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度氟處理能明顯抑制與呼吸作用相關(guān)的酶活性，并導(dǎo)致茶樹葉片線粒體空泡化，甚至降解，嚴(yán)重時(shí)會對線粒體造成不可逆的損害，進(jìn)而導(dǎo)致酶分子附著的表面減少，減弱細(xì)胞呼吸，茶樹有氧糖代謝受阻，從而降低呼吸作用。也有研究發(fā)現(xiàn)，在氟處理初期，植物的呼吸方式由糖酵解途徑變?yōu)榱姿嵛焯峭緩?，致使呼吸作用增?qiáng)[67]。Miller等[67]觀察到，從氟處理初期植物組織中分離出的線粒體，其呼吸速率和ATPase活性明顯增強(qiáng)，而在受氟抑制的組織發(fā)現(xiàn)呼吸速率和ATPase活性減弱。但目前，有關(guān)通過呼吸作用增強(qiáng)植物氟抗性的機(jī)制研究甚少，仍有待深入探討。

2.6 氟在茶樹體內(nèi)的轉(zhuǎn)移

茶樹體內(nèi)存在著獨(dú)特的轉(zhuǎn)移模式，可以使茶樹積累大量的氟后依然保持正常的生理狀況。這種轉(zhuǎn)移模式主要表現(xiàn)為茶樹根系不斷將吸收的氟運(yùn)輸至茶樹體內(nèi)（圖1）。當(dāng)葉片的氟累積到一定程度時(shí)，氟會向其他器官轉(zhuǎn)移，但不會影響茶樹對氟的吸收[68]。此外，李麗霞等[36]發(fā)現(xiàn)老葉中的氟可以向根系和新梢轉(zhuǎn)移，但老葉中的氟含量仍高于其他部位。Niu等[69]通過正電子發(fā)射斷層成像（Positron-emitting tracer，PET）發(fā)現(xiàn)F-被根吸收后約1.5?h到達(dá)茶樹地上部，根系對F-有滯留作用，且根部吸收的F-主要通過木質(zhì)部向上運(yùn)輸，但部分通過莖中的韌皮部向上運(yùn)輸。針對茶樹葉片吸收的F-，發(fā)現(xiàn)F-首先沿莖部向下輸送，然后再向上輸送，并在頂部和同側(cè)葉片積累，但未在根部觀察到[69]?？梢?，葉片和根系吸收轉(zhuǎn)運(yùn)氟的方式各有不同。

2.7 基因表達(dá)

信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控中發(fā)揮重要作用，響應(yīng)特定的應(yīng)激信號。Li等[19]研究發(fā)現(xiàn)，氟處理誘導(dǎo)類受體蛋白激酶（Receptor-like kinases，RLK）基因的表達(dá)，進(jìn)而激活Ca2+ATPase，活化的Ca2+ATPase促進(jìn)氟化物的吸收和運(yùn)輸（圖2）。氟信號同樣激活[70]、[71]等轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)，它們在茶樹的氟累積及氟耐受性中發(fā)揮作用。氟也可以通過激活A(yù)BA、GA和多胺等相關(guān)的合成基因[72]，進(jìn)而增加植物的氟抗性。

外源施加陰離子通道抑制劑顯著抑制了茶樹對氟的吸收，可見通過陰離子通道是茶樹吸收、遷移F-的主要方式[31]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，許多單細(xì)胞生物以及綠色植物可以通過細(xì)胞膜的F-輸出蛋白保持細(xì)胞質(zhì)較低的F-濃度，從而使植物的氟脅迫降到最低。現(xiàn)在已知兩個(gè)系統(tǒng)發(fā)育獨(dú)立的F-輸出家族[20]：CLCF型F-/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，以及在原核生物中稱作“crcB（Fluc）”、在真核生物中稱為FEX（Fluoride exporter）的小膜蛋白家族。其中，電壓門控氯離子通道（Voltage-gated chloride channel，CLC）不僅以2Cl-/1H+運(yùn)輸Cl-，還可以通過NO3-、F-、Br-、I-等其他鹵族元素陰離子[73]。而F-/H+反向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CLCF在細(xì)菌中具有相比Cl-優(yōu)先轉(zhuǎn)運(yùn)F-的功能[74]，且茶樹的CLC基因?qū)-的響應(yīng)比Cl-更敏感[21]。另外一類是分布更為廣泛的氟輸出蛋白家族crcB（Fluc），目前的研究表明大腸桿菌及釀酒酵母中存在氟輸出蛋白crcB（Fluc），并且具有外排細(xì)胞F-的功能[20]。近來也發(fā)現(xiàn)crcB（Fluc）的同源基因茶樹FEX可以通過降低組織內(nèi)的氟含量增強(qiáng)對氟化物的耐受性[22]，且FEX膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮的氟轉(zhuǎn)運(yùn)作用是植物氟防御的重要機(jī)制[74]。具有典型的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)構(gòu)域的CsCL667蛋白和氟離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CsFEX屬于同一基因家族，在氟處理下表達(dá)量顯著上調(diào)，ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含量也受氟誘導(dǎo)顯著增加，使ATP水解釋放能量，促使細(xì)胞累積大量的F-[23]。進(jìn)一步通過大腸桿菌異源表達(dá)驗(yàn)證CsCL667具有一定耐氟性以及外排氟離子的功能[23]。由此可見，探索相關(guān)的氟輸出蛋白有利于茶樹氟富集特性的研究，這將是未來分子研究的新方向。

圖3 氟對茶樹抗氧化系統(tǒng)的影響

圖4 氟對茶樹光合作用的影響

3 降氟措施

茶樹雖然具有聚氟耐氟的特性，但過多的氟累積仍會危害茶樹，影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)。研究者針對茶樹品種的差異、茶園土壤氟含量的降低措施、加工技術(shù)的改良等方面，探索提出了降低茶葉氟含量的方法。

3.1 選育低氟茶樹品種

不同茶樹品種對氟的累積量具有很大的差異性，選擇合適的低氟品種是首要的降氟措施。前期對烏牛早、浙農(nóng)138等31個(gè)茶樹品種進(jìn)行氟含量的研究，發(fā)現(xiàn)不同茶樹品種成熟葉片的氟含量具有差異性[75]。石元值等[76]的研究也表明，不同品種茶樹對氟的吸收存在差異，并發(fā)現(xiàn)中茶108與中茶102、龍井43、烏牛早相比，具有穩(wěn)定的低氟吸收富集特點(diǎn)，認(rèn)為這與茶樹的基因型相關(guān)。不同茶樹品種對氟的富集能力不同由遺傳差異所決定，且有研究者根據(jù)氟富集程度的不同將55個(gè)茶樹品種分為了高、中、低3種[77]。一般來講，品種間氟含量的差異與葉片的結(jié)構(gòu)相關(guān)。云南大葉種的葉片大而薄，海綿組織發(fā)達(dá)，細(xì)胞排列疏松，細(xì)胞間隙大，有利于葉片進(jìn)行氣體交換，相比之下，鳳凰水仙這種小喬木型大葉種的葉片小且厚，柵欄組織發(fā)達(dá)，細(xì)胞排列緊密，不利于茶樹吸收空氣中的氟[77]?？梢姡嘤?、選用低氟品種的茶樹，是減少茶葉氟含量的根本舉措。

3.2 改善茶園土壤管理措施

施肥也是改變茶樹氟含量的一種措施，一般通過根部施肥或者葉面噴肥的方式進(jìn)行茶園管理。其中，對葉面噴施適當(dāng)濃度的氮肥可以降低茶樹新梢中的氟含量，例如在夏季進(jìn)行葉面噴施含量2%以下的尿素，可以顯著降低茶樹新梢中的氟含量，但當(dāng)噴施的尿素含量高于2%時(shí)，便會提高茶樹新梢中的氟含量[78]。通過根部施氮肥同樣可以降低茶葉新梢的氟含量，但僅在茶葉新梢氟含量較高的情況下施用有效[78]。

氟對茶葉的品質(zhì)有很大的影響，含氟量高的茶葉，其沒食子兒茶素含量比較低，而適量的鋁元素可以提高兒茶素的含量[79]。施加適量的鋁可以提高茶葉中氨基酸、咖啡堿、可溶性糖以及茶多酚的含量，能夠促進(jìn)茶葉品質(zhì)的提升，但鋁施用量超過2?g·m-2時(shí)，茶葉咖啡堿與茶多酚的含量增多，造成茶湯發(fā)苦發(fā)澀；所以，合理控制茶葉中的氟、鋁含量，能夠促進(jìn)茶葉品質(zhì)的提升。

鈣通過與氟形成CaF2，通過改變土壤有效性氟的含量以降低茶樹對氟的吸收。張永利等[80]研究發(fā)現(xiàn)，施用不同濃度的Ca(NO3)2、CaCl2、Ca(OH)2會影響酸性土壤pH的變化，以pH5.0為拐點(diǎn)，pH的降低或升高均會使土壤水溶態(tài)氟含量增加。可見，鈣不止是通過形成CaF2對土壤有效氟含量產(chǎn)生影響，還可以改變土壤顆粒表面電荷、離子交換能力、絡(luò)合物/配合物的穩(wěn)定性進(jìn)而調(diào)整土壤pH[81]，降低土壤交換態(tài)氟含量。因而，在酸性土壤中施用堿性的Ca(OH)2等，降低土壤中氟的有效性，可以減少茶樹對氟的吸收富集。

研究發(fā)現(xiàn)添加木炭和竹炭能顯著提高土壤中Fe/Mn氧化物結(jié)合態(tài)氟的濃度，而水溶性氟和交換性氟含量顯著降低，這有效減少了土壤氟的可利用性，影響土壤氟的有效性，進(jìn)而降低茶樹對氟的吸收與積累[82]。腐植酸鋁（HAA）吸附劑能通過與可溶性F-螯合的方式，使得土壤溶液中的F-含量顯著降低，最終降低茶葉對氟化物的吸收[83]。目前，已經(jīng)研發(fā)出茶園土壤降氟劑B，具有降低土壤氟10%～40%的效果，但鮮葉的氟含量降低不明顯，有待進(jìn)一步提升研發(fā)產(chǎn)品[78]。

3.3 改進(jìn)茶葉加工工藝

茶葉的加工工藝會對其含氟量造成一定的影響。通過水潦青、炒青、蒸青3種不同的殺青方式比較青磚茶氟含量的差異，發(fā)現(xiàn)水潦青、炒青后的茶葉氟含量顯著低于蒸青茶葉的氟含量[84]。揉捻也是影響氟含量的工藝，磚茶原料在揉捻后細(xì)胞破碎，用室溫水洗1～2?min不僅可以有效降低茶葉氟含量，而且能最大限度地保留其有效成分[85]。并且發(fā)現(xiàn)在磚茶渥堆發(fā)酵工序前，翻拌的同時(shí)噴灑微生物制劑[86]，可以有效地降低磚茶氟含量，提高磚茶品質(zhì)、香氣和滋味。李蘭英等[87]針對傳統(tǒng)磚茶的加工工藝，探索出一種低氟優(yōu)質(zhì)的磚茶生產(chǎn)工藝，即鮮葉→攤放→殺青→揉捻→復(fù)炒→復(fù)揉→曬→渥堆→蒸→渥堆→炒干→蒸/壓磚→磚茶。此外，采用拼配技術(shù)也是一種有效降低茯磚茶氟含量的加工方法，可以在選擇原料時(shí)進(jìn)行氟含量的測定，篩分不同氟含量的茶鮮葉，對高氟含量的原料、中氟含量的原料和低氟含量的原料進(jìn)行拼配[88]，最后達(dá)到控制茯磚茶氟含量的目的。

4 展望

近來，關(guān)于茶樹氟富集特性的研究頗豐，同時(shí)對茶樹的氟抗性機(jī)制也有了一定的研究進(jìn)展，為茶葉降氟措施的研究提供了一定的理論基礎(chǔ)，但相關(guān)的研究仍然存在一定的問題，有待進(jìn)一步探索。

（1）近年來，關(guān)于茶樹根系吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)氟方面的研究較多，也在茶樹中發(fā)現(xiàn)了氟離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白——CLC和FEX，并對其轉(zhuǎn)運(yùn)氟的功能進(jìn)行了初步驗(yàn)證，但其分子結(jié)構(gòu)、互作機(jī)制、調(diào)控機(jī)制等分子生物學(xué)機(jī)理仍不清楚。未來，在鑒定更多的氟離子轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白、驗(yàn)證其功能、解析其分子機(jī)制等方面的研究有待進(jìn)一步的深入和挖掘，以期解析茶樹富集氟的機(jī)制。

（2）茶樹不僅具有聚氟特性，還兼具富鋁、喜酸、偏銨吸收等特征。已有研究聯(lián)合氟與不同pH環(huán)境或外源施加鋁后茶樹的氟累積特性，綜合分析茶樹的氟富集特性，但該方面的研究僅進(jìn)行了初步的探索，深入研究可能發(fā)掘茶樹自身耐氟的獨(dú)特機(jī)制。同時(shí)，茶樹具有富含茶多酚、生物堿和茶氨酸等次生代謝物質(zhì)的特性，已有研究表明茶樹富集過量的氟能影響這些次生代謝物質(zhì)的含量，但茶中大量的次生代謝物質(zhì)在茶樹富集氟、耐受氟中的作用及作用機(jī)制還鮮有報(bào)道，值得深入研究以發(fā)掘茶樹富集氟的特有生物學(xué)機(jī)制。

（3）在茶葉降氟方面，通過對比不同茶樹品種氟含量，篩選出了氟累積相對較低的品種，但傳統(tǒng)茶樹低氟品種的選育周期長，難度大，現(xiàn)代分子育種技術(shù)在低氟品種選育方面至今仍然是空白。通過茶園土壤管理，對茶園土壤中交換態(tài)氟含量降低具有一定效果，但對茶樹葉片降氟效果相對較弱?？傊枞~降氟措施研究中，在品種選育、土壤管理、茶葉加工工藝改良等方面都取得了一定的進(jìn)展，但目前為止，仍然沒有系統(tǒng)、高效、完善的降氟管理措施。

綜述所述，在未來的研究探索中，需加快解析茶樹富集氟的分子生物學(xué)機(jī)制，加強(qiáng)建設(shè)低氟品種、低氟茶園管理模式、低氟茶葉加工工藝等相結(jié)合的完善降氟技術(shù)體系。

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Research Advances of Fluoride Accumulation Mechanisms in Tea Plants ()

XING Anqi1, WU Zichen1, XU Xiaohan1, SUN Yi1, WANG Genmei2, WANG Yuhua1*

1. College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China;2. Co-innovation Center for Sustainable Forestry in Southern China, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China

(L.) O. Kuntze is a hyper fluoride (F) accumulation plant, whose F content in tea leaves is much higher than other plants, without any toxic symptoms. However, F is not an essential element for tea plant growth, and under high F stress, F affects the normal growth of plants by destroying the cell structure and inhibiting enzyme activities. In order to provide a theoretical basis for the future study of F accumulation in tea plants, the research progresses in the absorption, enrichment and accumulation/detoxification mechanisms of F in tea plants were reviewed.

, fluoride, accumulation mechanism

S571.1

A

1000-369X(2022)03-301-15

2021-09-01

2021-11-03

國家自然科學(xué)基金（31972458）、江蘇現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（茶葉）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（JATS[2021]457）

邢安琪，博士研究生，主要從事茶樹育種與栽培研究。*通信作者：wangyuhua@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯：趙鋒）