周 璇, 鄭云飛, 賈綺林, 張斐然

(北京大學(xué) 口腔醫(yī)院, 北京 100081)

細(xì)菌作為一種導(dǎo)致醫(yī)源性污染的重要生物因素，如何有效控制及消除細(xì)菌污染備受研究人員注意。相較于傳統(tǒng)的有機(jī)抗菌劑，無機(jī)抗菌劑具有緩釋長效性、不產(chǎn)生耐藥性、廣譜抗菌性等優(yōu)勢[1]。隨著納米技術(shù)的發(fā)展，二維層狀納米抗菌材料在醫(yī)療器械方面的應(yīng)用逐漸成為研究熱點(diǎn)[2-3]。二維層狀納米材料由于其獨(dú)特的空間結(jié)構(gòu)具有對單細(xì)胞微生物(細(xì)菌、真菌等)殺傷力強(qiáng)而對多細(xì)胞生物安全性高的特點(diǎn)[4]，因而可以作為抗菌劑的理想選擇。此類納米材料可制備成抗菌涂層應(yīng)用于醫(yī)療導(dǎo)管、手術(shù)器械及傷口敷料中[4-6]。

二維層狀納米材料是指在某一維度的厚度為0.1～100 nm，而在另一維度上可以無限延伸的材料[7]，其結(jié)構(gòu)上的特殊性可以通過納米刀效應(yīng)刺穿細(xì)菌胞膜而殺死細(xì)菌[8]。此外新型二維納米材料具有高效光催化活性，在光照下可以產(chǎn)生活性氧自由基和釋放熱量，達(dá)到光動力和光熱滅菌效果[9-12]。目前用于抗菌研究的二維納米材料包括石墨烯、層狀雙氫氧化物、黑磷、過渡金屬硫化物以及Mxenes等[13]，Ti3C2屬于Mxenes中的一種。近年來有研究表明不同化學(xué)計量比的MXene抑菌能力具有較大差異，Ti3C2Tx MXene可以有效抑制細(xì)菌的生長，但是Ti2CTx MXene卻沒有抑菌能力[14]。本研究中使用Ti3C2/Co作為二維納米抗菌材料，主要基于幾方面的考慮：(1)Co元素可以與MXene表面的極性基團(tuán)(—OH，—O)螯合形成Co-MXene復(fù)合物[15]。由于鈷納米線(CoNWs)是一維幾何結(jié)構(gòu)，在光輻射下可以為光電子提供直線傳輸通道。通過高效快速的光電子傳輸，Ti3C2/Co復(fù)合納米材料具有比Ti3C2納米片更優(yōu)異的光熱性能[16]。(2)鈷納米線(CoNWs)賦予Ti3C2/Co復(fù)合納米材料可控的磁性性能[17]，為材料循環(huán)可重復(fù)利用提供可能。(3)與其他金屬納米線(如ZnNWs，CuNWs等)相比，CoNWs合成條件簡單，且不依賴于昂貴的大型儀器，簡單易得，可實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn)[18]。也有研究表明經(jīng)近紅外光照射后的Ti3C2/Co復(fù)合納米材料產(chǎn)生了更強(qiáng)的光熱效應(yīng)，顯示出比Ti3C2納米片更強(qiáng)有效的抗菌效果[19]。

由于MXenes特有的結(jié)構(gòu)及光學(xué)特性、良好的生物安全性，目前已被用于癌癥治療研究中[20]。有研究表明Ti3C2/Co納米復(fù)合物可以作為抗癌藥物載體，抑制腫瘤的生長。其原理是通過化學(xué)-光熱協(xié)同作用殺死癌細(xì)胞和消融腫瘤組織[15]。但目前為止尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)Ti3C2/Co復(fù)合納米材料同時在抗菌活性和生物安全性兩方面的研究，本文以Ti3AlC2作為母體合成Ti3C2二維納米材料，并進(jìn)一步合成Ti3C2/Co復(fù)合納米材料。以大腸桿菌作為試驗(yàn)菌種研究此材料的抗菌活性及抗菌機(jī)制，同時進(jìn)一步驗(yàn)證它的生物安全性，由此拓展此材料在抗菌領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 材料

Ti3C2/Co復(fù)合納米材料由四川大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院提供；大腸桿菌(ATCC 8739)菌株來自美國菌種保存庫(ATCC)；臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞購自武漢普諾塞生命科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Ti3C2/Co納米材料的合成及檢測

使用氫氟酸(HF)水溶液作為蝕刻劑，從Ti3AlC2MAX相中除去Al同時在MXene片層表面形成Tx端基，進(jìn)一步進(jìn)行超聲分層，從而獲得單層或很少層的Ti3C2Tx。在反應(yīng)條件為pH≈14、溫度為75 ℃，磁場強(qiáng)度為70 mT下將EDTA-2Na和CoCl2·6H2O溶解于DI H2O中；然后再將N2H4·H2O和H2PtCl6·6H2O注入混合物中以獲得CoNWs。最后將Ti3C2與CoNWs以2∶1的比例在冰浴中超聲處理0.5 h，獲得Ti3C2/CoNWs溶液。冷凍干燥成粉末后在掃描電鏡下觀察Ti3C2及Ti3C2/Co納米材料的微觀結(jié)構(gòu)。

為檢測材料的磁性性能，將其置于PBS溶劑中，分別于1、3、5和7 d將磁石置于溶液一側(cè)，觀察并拍照磁石對材料的吸附能力。

1.2.2 Ti3C2/Co納米材料的抗菌性能檢測

細(xì)菌培養(yǎng)：將凍存于-80 ℃的大腸桿菌(ATCC 8739)菌株取出后快速解凍，并在無菌條件下通過平板劃線法接種于LB培養(yǎng)基。24 h后挑取單個菌落，接種于裝有10 mL LB液體培養(yǎng)基的無菌試管中。有氧條件下37 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)增菌至對數(shù)生長期后將菌液離心(2 000 r/min，5 min)；倒去上清液后使用生理鹽水洗滌、離心3次；用1 mL PBS液將沉淀的菌株吹打懸?。蛔詈笠詿o菌LB培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)菌濃度為1×106CFU/mL備用。

標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)試驗(yàn)：取濃度為1×106CFU/mL的大腸桿菌細(xì)菌懸液與PBS液或不同濃度的Ti3C2/Co納米材料等體積混合于EP管中。試驗(yàn)分為4個大組，分別為空白對照組(PBS液)、光照組、不同濃度(50、150、250 μg/mL)的Ti3C2/Co納米材料處理組、Ti3C2/Co納米材料+光照組。其中激光參數(shù)設(shè)置成波長為808 nm，光照功率為118 mW，照射時間為10 min。各組置于37 ℃恒溫?fù)u床中孵育8 h。孵育結(jié)束后，將各組稀釋一定倍數(shù)，取100 μL均勻涂布于相應(yīng)的固體培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中孵育過夜。取出培養(yǎng)板拍照，同時進(jìn)行菌落計數(shù)。細(xì)菌存活率=1-(n-n1/n)，式中對照組活菌數(shù)為n，實(shí)驗(yàn)組活菌數(shù)為n1。

激光共聚焦顯微鏡觀察：取濃度為1×106CFU/mL的大腸桿菌細(xì)菌懸液與PBS液或一定濃度的Ti3C2/Co納米材料等體積混合于EP管中，對應(yīng)反應(yīng)條件分別為空白對照組(PBS液)、光照組、150 μg/mL的Ti3C2/Co納米材料組、Ti3C2/Co納米材料+光照組。各組置于37 ℃恒溫?fù)u床中孵育8 h。孵育結(jié)束后，離心洗滌，加入Live/Dead染色液染色。該染色液中包含SYTO9和PI兩種染料，染色后避光孵育15 min，取5 μL滴在載玻片上。然后用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察并拍照。其中紅色熒光的激發(fā)和發(fā)射波長為510、640 nm，綠色熒光的激發(fā)和發(fā)射波長為480、520 nm。

掃描電子顯微鏡表征：取濃度為1×106CFU/mL的大腸桿菌細(xì)菌懸液與PBS液或一定濃度的Ti3C2/Co納米材料等體積混合于EP管中，對應(yīng)反應(yīng)條件分別為空白對照組(PBS液)、光照組、150 μg/mL的Ti3C2/Co納米材料組、Ti3C2/Co納米材料+光照組。各組置于37 ℃恒溫?fù)u床中孵育8 h。孵育結(jié)束后，離心洗滌，去除上清液，將沉淀的細(xì)菌用戊二醛溶液充分混勻后固定，于4 ℃冰箱過夜放置。然后用50%、75%、90%、100%的乙醇溶液由低濃度到高濃度分別脫水處理15～20 min，最后將菌株重懸于無水乙醇中，滴在硅片上進(jìn)行干燥，使用掃描電子顯微鏡對細(xì)菌的表面形態(tài)進(jìn)行觀察。

1.2.3 Ti3C2/Co納米材料的生物相容性檢測

溶血實(shí)驗(yàn)：取正常健康人的新鮮血液用PBS溶液稀釋成4%的懸浮液，然后將其與PBS液或不同濃度的Ti3C2/Co納米材料等體積混合于EP管中，對應(yīng)反應(yīng)條件分別為陰性對照組(PBS液)、不同濃度(50、150、250、350 μg/mL)的Ti3C2/Co納米材料+光照組、陽性對照組(triton-X)。各組置于37 ℃恒溫孵箱中孵育8 h。孵育結(jié)束后離心(2 000 r/min，5 min)，收集離心后的上清液并測量其在570 nm處的吸光度。溶血率=[OD570(實(shí)驗(yàn)組)-OD570(陰性對照)]/[OD570(陽性對照)-OD570(陰性對照)]。

細(xì)胞培養(yǎng)：選用6～8代間的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞來評價材料對細(xì)胞的影響。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞選用專用血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2和95%空氣的細(xì)胞孵箱中培養(yǎng)細(xì)胞，每2 d更換一次培養(yǎng)基。

細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)：將臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種至96孔板中，每孔細(xì)胞的密度約為1×104個/mL。各組孔板對應(yīng)反應(yīng)條件分別為空白對照組(專用血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基)、光照組、含有不同濃度(50、150、250、350 μg/mL)的Ti3C2/Co納米材料培養(yǎng)基組、Ti3C2/Co納米材料+光照組。各組置于37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)24 h后用PBS液洗滌，加入含有cck8的培養(yǎng)基孵育2 h，通過酶標(biāo)儀讀取每個孔板在450 nm處的吸光度。

細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：將臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞接種至6孔板中，每孔細(xì)胞的密度約為4×105個/mL。置于37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿孔板后進(jìn)行劃痕，用PBS溶液洗細(xì)胞3次以去除劃下的細(xì)胞。并在此時在倒置顯微鏡下進(jìn)行觀察、拍照。然后再進(jìn)行分組，各組孔板對應(yīng)反應(yīng)條件分別為空白對照組(無血清培養(yǎng)基)、含有不同濃度(50、150、250、350 μg/mL)的Ti3C2/Co納米材料無血清培養(yǎng)基+光照組。各組置于37 ℃恒溫孵箱中培養(yǎng)12 h后再次于倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞遷移情況并拍照。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 Ti3C2/Co納米材料合成前后的表面形態(tài)

圖1和圖2分別為Ti3C2及Ti3C2/Co復(fù)合納米材料在掃描電鏡下觀察的微觀結(jié)構(gòu)形態(tài)?？捎^察到Ti3C2及Ti3C2/Co復(fù)合納米材料均成明顯的片層狀散在分布。材料的厚度僅為納米級別，而在其他維度上則任意延伸。圖3可以觀察到由于磁性元素鈷的加入，Ti3C2/Co復(fù)合納米材料在一周內(nèi)均展現(xiàn)出穩(wěn)定的磁吸附性能。

圖1 Ti3C2掃描電鏡圖像

圖2 Ti3C2/Co納米材料的掃描電鏡圖像

圖3 Ti3C2/Co納米材料在PBS溶液中存放7 d的磁性性能

2.2 Ti3C2/Co納米材料的抗菌性能

圖4為標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法觀察到的各組材料與細(xì)菌共孵育后瓊脂平板上的菌落形成單位。通過定性(圖4)和定量(圖5)的結(jié)果看出，Ti3C2/Co納米材料具有顯著的殺菌效果，且其殺菌性能隨著材料濃度的增加而顯著增加，在近紅外光照射下材料的殺菌性能進(jìn)一步提升。在材料濃度為50 μg/mL時，細(xì)菌的存活率與對照組相比降低了25%，兩組的細(xì)菌存活率有著顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；在材料濃度為150 μg/mL時，實(shí)驗(yàn)組與對照組的細(xì)菌存活率有著極顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.001)；在材料濃度為250 μg/mL合并近紅外光照射時，殺菌率達(dá)到100%。

* P<0.05;*** P<0.001。

在激光共聚焦顯微鏡下綠色代表活細(xì)菌，紅色代表已經(jīng)死亡的細(xì)菌(圖6)。如圖6所示，對照組呈現(xiàn)99%以上的活細(xì)菌，單純光照組也僅呈現(xiàn)了少數(shù)的紅色熒光，Ti3C2/Co納米材料處理組中紅色熒光明顯增多，而Ti3C2/Co納米材料結(jié)合光照組呈現(xiàn)最多的紅色熒光，展現(xiàn)出最強(qiáng)的殺菌活性。

(a)對照組;(b)光照組;(c)Ti3C2/Co;(d)Ti3C2/Co+光照組。標(biāo)尺：10 μm。

細(xì)菌形態(tài)分析：在掃描電子顯微鏡下可以觀察到大腸桿菌呈典型的棒狀結(jié)構(gòu)，對照組中大腸桿菌的細(xì)胞表面較為光滑，但在Ti3C2/Co納米材料組尤其是在材料結(jié)合光照組中大腸桿菌表面明顯起皺、凹陷，說明細(xì)菌的細(xì)胞壁在Ti3C2/Co納米材料與近紅外光光照的共同作用下受到了明顯的損傷(圖7)。

(a)對照組；(b)光照組；(c)Ti3C2/Co；(d)Ti3C2/Co+光照組。標(biāo)尺：1 μm。

2.3 Ti3C2/Co復(fù)合納米材料的生物安全性實(shí)驗(yàn)

溶血會阻礙抗菌材料的實(shí)際應(yīng)用，因此我們研究了Ti3C2/Co納米材料對血液中紅細(xì)胞的生物安全性。圖8表明，Ti3C2/Co納米材料對血紅細(xì)胞不會產(chǎn)生破壞作用，即使達(dá)到最高濃度350 μg/mL時，對紅細(xì)胞的破壞仍可以忽略不計，在545 nm下測量吸光度時發(fā)現(xiàn)各實(shí)驗(yàn)組與陰性對照組之間無統(tǒng)計學(xué)差異。因此可以認(rèn)為Ti3C2/Co納米材料對血液具有相對安全性。

圖8 不同濃度的Ti3C2 /Co納米材料的溶血反應(yīng)

為了驗(yàn)證Ti3C2/Co納米材料對細(xì)胞增殖活性的影響，通過cck8增殖實(shí)驗(yàn)表明，高濃度(350 μg/mL)的Ti3C2/Co顯示出對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有一定的毒性作用，且與對照組相比有著顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)，而當(dāng)材料濃度低于或等于250 μg/mL時，則表現(xiàn)出輕微的促進(jìn)增殖的效果,但無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(圖9)。

* P<0.05。

進(jìn)一步驗(yàn)證Ti3C2/Co納米材料對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移活性的影響。如圖10和圖11顯示，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞具有良好的遷移能力，12 h后各組劃痕均有顯著縮窄，Ti3C2/Co納米材料對臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的遷移未見抑制作用，且在低濃度時表現(xiàn)出輕微的促進(jìn)其遷移的效果，但無顯著的統(tǒng)計學(xué)差異。

圖10 Ti3C2/Co納米材料與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)時的遷移速度

圖11 Ti3C2/Co納米材料與臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)時各組遷移速度的定量結(jié)果

3 結(jié)論

(1)Ti3C2/Co納米材料具有良好的殺菌性能，在近紅外光照射的輔助下材料的殺菌性能進(jìn)一步提升。在250 μg/mL濃度結(jié)合近紅外光照射時其殺菌率可達(dá)到100%。其抗菌機(jī)制主要包括材料特殊的二維結(jié)構(gòu)會產(chǎn)生類似于納米刀的效果刺破細(xì)胞壁，同時材料的光動力和光熱效應(yīng)也對細(xì)菌的細(xì)胞壁產(chǎn)生損傷作用。

(2)Ti3C2/Co納米材料在一定濃度范圍內(nèi)具有良好的生物相容性，對細(xì)胞的增殖及遷移能力均未表現(xiàn)出抑制作用，且對血液亦具有良好的生物安全性，但在較高濃度下表現(xiàn)出了一定的細(xì)胞毒性。本研究認(rèn)為鈷元素的加入一方面使材料具有了高效的磁性性能，為材料循環(huán)可重復(fù)利用提供可能；另一方面相較于Ti3C2納米材料，其抗菌性能也有了明顯的提升；但是可能會使材料的細(xì)胞相容性下降。

(3)Ti3C2/Co納米材料由于具有良好的殺菌性能以及生物安全性，可以制成抗菌涂層，應(yīng)用于醫(yī)療導(dǎo)管、手術(shù)器械及防菌紗布中。