劉宏飛 何國濃王 杰 余偉方 史國軍

浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬寧波中醫(yī)院 浙江 寧波 315010

我國胃癌發(fā)病率在惡性腫瘤中排第二位[1]。目前對胃癌機制研究和治療方法不斷深入，但治療效果提高卻不明顯[2]。中醫(yī)藥治療本病已經(jīng)有深入研究[3]，藤梨根被證明有抗腫瘤等作用，在臨床治療消化道腫瘤有一定療效[4,5]。本研究通過觀察不同濃度的藤梨根提取物熊果酸（XGS）、齊墩果酸（QDGS）對人胃癌細胞SGC-7901增殖以及對血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、缺氧誘導(dǎo)因子（HIF）-1α表達的影響，為開發(fā)藤梨根及其制劑用于防治胃癌提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗藥品：熊果酸（批號：19062710）、齊墩果酸（批號：20032706）購于成都曼思特生物科技公司。

1.2 實驗細胞：人胃癌細胞SGC-7901，由浙江省中醫(yī)藥研究院提供，來源于中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.3 主要試劑儀器：LV-HIF-1α、LV-NC由吉瑪制藥技術(shù)公司（上海）合成；HIF-1α、VEGF、EF-1α引物購于生物工程（上海）公司；xCELLigence RTCA DP多功能實時無標記細胞分析儀，艾森生物（杭州）公司；Nanodrop2000核酸蛋白質(zhì)定量儀，Thermo公司；WES全自動蛋白表達分析系統(tǒng)，Protein Simple公司。

1.4 方法：分述如下。

1.4.1 細胞培養(yǎng)及慢病毒感染：SGC-7901細胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞用于實驗。構(gòu)建HIF-1α過表達慢病毒載體LV-HIF-1α（3×108TU/ml）及陰性對照LV-NC（3×108TU/ml），SGC-7901細胞按5×104個/ml，每孔500μl接種于24孔板中，培養(yǎng)24h后以最佳病毒感染復(fù)數(shù)（MOI=20）加入過表達慢病毒及陰性對照病毒感染SGC-7901細胞，并加入5μg/ml的Polybrene以增加感染效率，24h后更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h，倒置熒光顯微鏡觀察熒光強度。

1.4.2 實驗分組：空白對照組（CON組），慢病毒陰性對照組（LV-NC組），模型組（LV-HIF-1α組），熊果酸高濃度6.25μg/ml組（LV-HIF-1α+XGS6.25組）、中濃度3.125μg/ml組（LV-HIF-1α+XGS3.125組）、低濃度1.5625μg/ml組（LV-HIF-1α+XGS1.5625組），齊墩果酸高濃度25μg/ml組（LV-HIF-1α+QDGS25組）、中濃度12.5μg/ml組（LV-HIF-1α+QDGS12.5組）、低濃度6.25μg/ml組（LV-HIF-1α+QDGS6.25組）。共9組。

1.4.3 RTCA DP實時細胞分析系統(tǒng)檢測藤梨根提取物對細胞增殖的影響：取對數(shù)生長期的細胞分組培養(yǎng)96h，記錄CI值。

1.4.4 Real-time PCR檢測各組細胞VEGF、HIF-1α mRNA表達：取對數(shù)生長期的細胞分組給藥干預(yù)，培養(yǎng)48h，收集細胞并用Trizol法提取總RNA，按照試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)和Real-time PCR檢測。引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃ 15min，85℃ 5s，4℃保存。PCR反應(yīng)條件：95℃，30s；95℃，5s，60℃，30s，40個循環(huán)；熔解曲線：95℃，15s，60℃，60s，95℃，15s。采用相對定量分析方法（2-??Ct法）進行分析。

表1 引物序列

1.4.5 Western blot檢測各組細胞VEGF、HIF-1α蛋白表達：取對數(shù)生長期的細胞分組給藥干預(yù)，培養(yǎng)48h，收集細胞并用全蛋白提取試劑盒提取總蛋白，測定蛋白濃度，按照WES全自動蛋白定量分析試劑盒的操作說明操作，用Compass軟件進行峰面積的分析，蛋白相對表達水平用PA目標蛋白/PA內(nèi)參蛋白比值表示。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的建立：加入過表達慢病毒LVHIF-1α及陰性對照病毒LV-NC感染的SGC-7901細胞，用1μg/ml嘌呤霉素連續(xù)篩選10d，置于倒置熒光顯微鏡下拍照（見圖1），可見穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株構(gòu)建成功。

圖1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞株的建立

2.2 實時細胞分析系統(tǒng)檢測XGS、QDGS對細胞增殖的影響：由表2可見，與CON組比較，XGS6.25組、XGS3.125組、XGS1.5625組、QDGS25組的48h CI值均顯著降低（P＜0.01）；與LV-NC組比較，6個給藥組的CI值均顯著降低（P＜0.01）；與LV-HIF-1α組比較，6個給藥組的CI值均降低（P＜0.05，P＜0.01）。與CON組比較，XGS6.25組、XGS3.125組、XGS1.5625組、QDGS25組、QDGS6.25組的72hCI值均顯著降低（P＜0.01）；與LV-NC組比較，6個給藥組的CI值均降低（P＜0.05，P＜0.01）；與LV-HIF-1α組比較，XGS6.25組、XGS3.125組、XGS1.5625組、QDGS25組、QDGS6.25組的72h CI值均顯著降低（P＜0.01）。

表2 XGS、QDGS對CI值的影響(±s,n=3)

表2 XGS、QDGS對CI值的影響(±s,n=3)

注：與CON組比較，**P＜0.01；與LV-NC組比較，#P＜0.05，##P＜0.01；與LV-HIF1α組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

組別CON LV-NC LV-HIF1α XGS6.25 XGS3.125 XGS1.5625 QDGS25 QDGS12.5 QDGS6.25 48hCI 2.145±0.088 2.214±0.074 2.181±0.095 0.719±0.072**##▲▲1.585±0.063**##▲▲1.825±0.062**##▲▲1.649±0.086**##▲▲2.019±0.076##▲2.030±0.068##▲72hCI 3.724±0.041 3.995±0.031 3.807±0.014 0.490±0.015**##▲▲2.006±0.020**##▲▲2.733±0.103**##▲2.294±0.069**##▲▲3.227±0.136#3.301±0.042**##▲▲96hCI 5.624±0.105 5.554±0.117 5.186±0.025 0.254±0.019**##▲▲2.189±0.031**##▲▲3.573±0.063**##▲▲2.806±0.127**##▲▲4.064±0.056**##▲▲4.850±0.056

2.3 XGS、QDGS對細胞HIF-1α、VEGF mRNA表達的影響：與CON組和LV-NC組比較，LV-HIF-1α組、XGS1.5625組、QDGS6.25組的HIF-1α mRNA表達升高（P＜0.05，P＜0.01）；與LV-HIF-1α組比較，XGS6.25組、XGS3.125組、XGS1.5625組、QDGS25組、QDGS12.5組的HIF-1αmRNA表達顯著降低（P＜0.01）。與CON組和LVNC組比較，LV-HIF-1α組的VEGF mRNA表達顯著升高（P＜0.01），6個給藥組的VEGF mRNA表達均顯著降低（P＜0.01）；與LV-HIF-1α組比較，6個給藥組的VEGF mRNA表達均顯著降低（P＜0.01）。具體見圖2。

圖2 XGS、QDGS對細胞VEGF、HIF-1αmRNA表達的影響

2.4 XGS、QDGS對細胞HIF-1α、VEGF蛋白表達的影響：與CON組和LV-NC組比較，XGS6.25組、XGS3.125組、QDGS25組的HIF-1α蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；LVHIF-1α組、XGS1.5625組、QDGS12.5組、QDGS6.25組的HIF-1α蛋白表達顯著升高（P＜0.01）。與LV-HIF-1α組比較，XGS6.25組、XGS3.125組、XGS1.5625組、QDGS25組、QDGS12.5組的HIF-1α蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。與CON組和LV-NC組比較，XGS6.25組、QDGS25組的VEGF蛋白表達顯著降低（P＜0.01）；LV-HIF-1α組、XGS3.125組、XGS1.5625組、QDGS6.25組的VEGF蛋白表達升高（P＜0.05，P＜0.01）；與LV-HIF-1α組比較，XGS6.25組、QDGS25組、QDGS12.5組的VEGF蛋白表達顯著降低（P＜0.01）。具體見圖3。

圖3 XGS、QDGS對細胞VEGF、HIF-1α蛋白表達的影響

3 討論

胃癌發(fā)病主要是通過轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控眾多靶基因表達或活性而實現(xiàn)的，其中一些關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子如HIF-lα等在慢性炎癥、細胞微環(huán)境缺氧的情況下出現(xiàn)活性失調(diào)，在本病的進展中起到促進作用。HIF-1α過表達與胃癌組織病理學(xué)特征、細胞轉(zhuǎn)移潛力顯著相關(guān)，并可能預(yù)示著浸潤和轉(zhuǎn)移，也可能是胃癌患者預(yù)后不良的風(fēng)險因素。VEGF是目前已知重要的血管生成促進因子，對與維持腫瘤生長、侵襲轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。由于胃癌等腫瘤組織常處于缺氧狀態(tài)，HIF-lα在基因水平上直接調(diào)控VEGF的表達?；罨说腍IF-lα與VEGF基因的調(diào)控序列相結(jié)合，從而啟動VEGF轉(zhuǎn)錄，因此腫瘤組織中HIF-lα、VEGF常常存在高表達狀態(tài)，因此研究出能夠抑制HIF-1α/VEGF表達的藥物在胃癌的治療中應(yīng)該具有良好的前景。

本次研究發(fā)現(xiàn)，在空白對照組人胃癌細胞SGC-7901中HIF-1α、VEGF出現(xiàn)高表達，而不同濃度的藤梨根活性成分對HIF-1α、VEGF的表達呈抑制作用。藤梨根為獼猴桃科植物中華獼猴桃的根,是我國特有種屬，近幾年有學(xué)者對藤梨根抗腫瘤作用進行研究，發(fā)現(xiàn)對實驗性大鼠胃癌的生長轉(zhuǎn)移具有抑制作用[6-9]。本課題組在前期研究中已初步篩選出熊果酸、齊墩果酸這兩種活性物質(zhì)是藤梨根抗腫瘤作用的主要活性成分[10,11]，同時本次研究發(fā)現(xiàn)，不同濃度的熊果酸、齊墩果酸對細胞增殖、HIF-1αmRNA/VEGF和蛋白表達均有抑制作用，且似乎呈時效關(guān)系，并呈現(xiàn)出濃度遞增效果，提示其內(nèi)在的抗腫瘤可能機制是通過下調(diào)VEGF、HIF-1α表達而發(fā)揮作用的，而抗腫瘤的效果有可能取決于長時間、高濃度應(yīng)用，需要在今后進一步研究。