張 瑩 ，楊志堅(jiān) ，王一好 ，張文鵬 ，白江平 ，畢真真 *

（1.甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070）

近年來(lái)，非生物脅迫是制約馬鈴薯生產(chǎn)的因子之一，其中干旱脅迫造成的馬鈴薯產(chǎn)量損失位居第一[1]。干旱脅迫通常發(fā)生在土壤水分不充足，難以維持植物正常生活和蒸發(fā)過(guò)度充足的地區(qū)[2]。水分缺乏是限制植物伸長(zhǎng)和擴(kuò)張生長(zhǎng)的限制因素，也是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要因素[3-4]，并且加速土壤營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng)的失衡，從根本上導(dǎo)致了作物生育周期中每一個(gè)環(huán)節(jié)受到影響[5]。

馬鈴薯是第四大糧食作物，也是一種典型的對(duì)水敏感的溫帶性作物，干旱生理脅迫嚴(yán)重阻礙了馬鈴薯的生長(zhǎng)發(fā)育[6]。馬鈴薯生長(zhǎng)在低溫冷涼的環(huán)境下，對(duì)缺水比較敏感，缺乏有效的耐旱性機(jī)制[7]。由于全球氣候的變化，馬鈴薯培育基地旱情日益嚴(yán)重，水分短缺極度限制馬鈴薯生長(zhǎng)，造成減產(chǎn)。干旱加劇使葉片出現(xiàn)發(fā)黃、逐漸萎蔫、脫落等現(xiàn)象，對(duì)馬鈴薯植株造成不可逆?zhèn)?，進(jìn)而影響馬鈴薯品種和產(chǎn)量，研究馬鈴薯抗旱基因的抗旱機(jī)理對(duì)選育馬鈴薯耐旱品種的選育和擴(kuò)大推廣具有指導(dǎo)意義。

CDPKs 最初在豌豆中被發(fā)現(xiàn)[8]，是一類存在于某些植物中專有的與逆境信號(hào)傳遞關(guān)系最密切的蛋白激酶[9]，在調(diào)節(jié)作物生長(zhǎng)發(fā)育、生物和非生物脅迫的耐受性以及激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[10]。崔喜艷等[11]和牛娟等[12]的研究證實(shí)了在干旱脅迫條件下CDPK 基因在擬南芥、羊草和大豆中的表達(dá)各有所不同，在植物遭受干旱脅迫反應(yīng)時(shí)起到使CDPK 基因的表達(dá)增強(qiáng)的重要的作用[13]。馬鈴薯StCDPKs 基因家族基因結(jié)構(gòu)是相似的，EF-hand 在區(qū)域內(nèi)高度保守[14]。StCDPKs在不同組織中遭受逆境脅迫有不同的表達(dá)模式。模式植物擬南芥AtCDPK1 基因在抗非生物脅迫反應(yīng)過(guò)程中發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用并可以誘導(dǎo)表達(dá)，通過(guò)NCBI 網(wǎng)站BLAST 比對(duì)找到AtCDPK1 基因在馬鈴薯中的同源基因是StCDPK8。本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)分析推測(cè)馬鈴薯StCDPK8 基因的功能，同時(shí)分析抗旱性不同的2 種馬鈴薯品種中StCDPK8 基因的瞬時(shí)表達(dá)量，以期為馬鈴薯抗逆種質(zhì)資源基于植物基因工程上的改良提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為馬鈴薯CDPK 蛋白生物學(xué)功能和抗旱育種的全面研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

馬鈴薯干旱敏感型品種大西洋（Atl）和耐旱型品種青薯9 號(hào)（QS9）2 種試驗(yàn)材料均由甘肅省干旱生境作物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室以及甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

MS 液體培養(yǎng)基，200 mm 甘露醇，植物總RNA 提取試劑盒，1%的瓊脂糖凝膠電泳，成像分析系統(tǒng)，TOYOBO 牌反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR 儀，熒光定量?jī)x，超微核酸蛋白分析儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 生物信息學(xué)分析 通過(guò)在線網(wǎng)站對(duì)StCDPK8基因進(jìn)行信息學(xué)在線分析解析StCDPK8 基因功能（表 1）。

表1 生物信息學(xué)分析網(wǎng)站及功能

1.2.2 干旱脅迫瞬時(shí)處理 在配制好的MS 液體培養(yǎng)基中將種抗旱性不同的馬鈴薯試管苗進(jìn)行干旱短期處理：干旱敏感型品種大西洋（Atl）和耐旱型品種青薯9 號(hào)（QS9）培養(yǎng)25 d，然后將馬鈴薯試管苗放置在濃度為200 mM PEG 的MS 液體培養(yǎng)基中做瞬時(shí)處理，分別于 0 h（CK）、1 h、3 h、6 h、12 h 進(jìn)行取樣。

1.2.3 RNA 提取與檢測(cè) 提取干旱脅迫瞬時(shí)處理后的馬鈴薯樣品的RNA，并利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量[15]、純度[16]。

1.2.4 qPCR 檢測(cè) 使用TOYOBO 反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行合成 cDNA，根據(jù) SYBR qPCR MIX（Takala）操作規(guī)程說(shuō)明書建立20 μl 的熒光定量PCR 反應(yīng)體系，在實(shí)時(shí)定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增。最后應(yīng)用2-ΔΔCT相對(duì)定量法[17]計(jì)算StCDPK8 基因的相對(duì)表達(dá)量。

所用基因引物序列：

StCDPK8-F:5’-GCTAATGGGTATAGGGCAGGAA-3’

StCDPK8-R:5’-ACAGTAACAGGAACAGGGTGGG-3’

內(nèi)參基因引物序列：

actin-F:5’-AGGAGCATCCTGTCCTCCTAA-3’

actin-R:5’-CACCATCACCAGAGTCCAACA-3’

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動(dòng)子順式調(diào)控元件

利用Lantcare 分析StCDPK8 基因上游1 500 bp中含有的相關(guān)順式作用元件（表2），結(jié)果表明：StCDPK8 基因啟動(dòng)子區(qū)含有啟動(dòng)子核心元件、瞬時(shí)順式作用調(diào)控元件、啟動(dòng)子，增強(qiáng)子常見(jiàn)順式作用元件和脫落酸反應(yīng)元件等其他與脅迫調(diào)控有關(guān)的順式作用調(diào)控元件。因此，StCDPK8 可能在馬鈴薯植株遭受干旱等逆境脅迫時(shí)發(fā)揮調(diào)控作用。

表2 StCDPK8 基因啟動(dòng)子順式調(diào)控元件分析

2.2 蛋白結(jié)構(gòu)域分析

通過(guò)InterPro 對(duì)馬鈴薯StCDPK8 的蛋白序列進(jìn)行分析。由表3 可知，馬鈴薯StCDPK8 蛋白序列包含2 個(gè)結(jié)構(gòu)域、1 個(gè)活性位點(diǎn)、2 個(gè)超同源家族以及3 個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

表3 StCDPK8 蛋白序列分析

2.3 蛋白理化特性分析

ExPASy 網(wǎng)站分析結(jié)果表明（表 4）：StCDPK8 基因編碼581 個(gè)氨基酸，且氨基酸組分中數(shù)目最多，含量最高的是甘氨酸（Gly），含量達(dá)8.4%；色氨酸（Trp）含量最低，達(dá)0.9%。該蛋白的理論等電點(diǎn)（pl）為5.54，相對(duì)分子量為64.5 kD。同時(shí)，氨基酸親水性分析顯示，StCDPK8 蛋白序列的N 末端是甲硫氨酸（Met），其不穩(wěn)定系數(shù)（II）是 36.41，為穩(wěn)定性蛋白；理論半衰期30 h；脂肪酸指數(shù)為77.33；蛋白質(zhì)的親水性平均值GRAVY 為-0.420，為親水性蛋白質(zhì)：StCDPK8 氨基酸親疏水性分析結(jié)果圖中峰值“＞0”部分是疏水區(qū)域，“＜0”部分則為親水區(qū)域，該序列在 305 至 315 處存在最高峰（圖 1），StCDPK8 氨基酸疏水性達(dá)到最大。

圖1 StCDPK8 氨基酸親疏水性分析

表4 StCDPK8 蛋白氨基酸序列分析

2.4 蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

根據(jù)Plantcare 分析結(jié)果預(yù)測(cè)到：α 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是StCDPK8 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的主要成分，還包括β 折疊和延伸鏈以及其他已知的結(jié)構(gòu)域（圖2、圖3）。通過(guò)SOPMA-蛋白質(zhì)二級(jí)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，α螺旋占比42.51%，無(wú)規(guī)則卷曲占比39.24%，β 折疊占比8.61%，延伸鏈占比9.64%。通過(guò)分析馬鈴薯StCDPK8 蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖 4），結(jié)果表明：α- 螺旋和無(wú)規(guī)則卷曲是該三級(jí)結(jié)構(gòu)的主要組成部分。因此，馬鈴薯StCDPK8 蛋白的大部分氨基酸序列都為螺旋形狀。同時(shí)，基于同源建模三維結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明：StCDPK8 蛋白可能含有較大的疏水結(jié)構(gòu)，與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)形式吻合。

圖2 StCDPK8 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)圖

圖3 StCDPK8 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)峰圖

圖4 StCDPK8 蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型

2.5 StCDPK8 基因表達(dá)量分析

對(duì)甘露醇模擬干旱脅迫處理后的幼苗進(jìn)行qPCR 分析，由圖5 可看出：干旱處理后，2 個(gè)馬鈴薯品種中StCDPK8 表達(dá)量均迅速升高，并在1 h 時(shí)達(dá)到最高；且耐旱型品種QS9 的表達(dá)量整體高于干旱敏感型品種Atl。干旱處理使StCDPK8 基因的表達(dá)量在抗旱性不同的馬鈴薯中表現(xiàn)出品種特異性，根據(jù)該基因表達(dá)量的品種差異性推測(cè)馬鈴薯StCDPK8基因與馬鈴薯干旱脅迫響應(yīng)有關(guān)。

圖5 干旱脅迫處理下2 種馬鈴薯中StCDPK8基因表達(dá)量變化

3 討論

植物中的CDPKs（鈣依賴蛋白激酶）作為一個(gè)正向調(diào)節(jié)因子調(diào)控干旱等逆境反應(yīng)，能快速適應(yīng)非生物脅迫，與植物的脅迫響應(yīng)有著密切關(guān)系。CDPKs 是一類參與植物天然免疫反應(yīng)的鈣離子感受器，它還是一種通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子來(lái)調(diào)控基因表達(dá)情況的抗性基因[18]。已有研究證實(shí)[19]，在干旱等非生物逆境脅迫下擬南芥AtCDPK1（AT5G04870）基因被誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而激活其過(guò)量表達(dá)以顯著提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受能力。馬鈴薯抗旱性是一種需要從與抗旱脅迫響應(yīng)相關(guān)基因進(jìn)行發(fā)掘的研究，它作為一種由復(fù)合的多基因控制的數(shù)量遺傳特征為馬鈴薯抗旱品種在干旱脅迫下的培育提供一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，減少干旱造成的損失。

本試驗(yàn)通過(guò)NCBI BLAST 比對(duì)找到馬鈴薯中的擬南芥AtCDPK1 同源基因StCDPK8，初步推測(cè)StCDPK8 基因與AtCDPK1 基因功能在受干旱、高鹽等逆境脅迫誘導(dǎo)時(shí)表達(dá)相似，并且在激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中與馬鈴薯的生長(zhǎng)發(fā)育響應(yīng)。目前對(duì)馬鈴薯干旱相關(guān)鈣依賴蛋白激酶的研究較少，本試驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)手段和基因表達(dá)分析對(duì)StCDPK8 進(jìn)行初步功能預(yù)測(cè)，以期為馬鈴薯干旱相關(guān)CDPKs 進(jìn)行進(jìn)一步功能解析提供參考。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，StCDPK8 蛋白作為穩(wěn)定性蛋白，其啟動(dòng)子上游序列主要參與植物逆境反應(yīng)，包括與免疫應(yīng)答和激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)的順式作用元件，表明StCDPK8 可能參與植物逆境應(yīng)激反應(yīng)[9]。模擬干旱脅迫下抗旱性不同的馬鈴薯品種中StCDPK8 基因的表達(dá)水平有顯著差異，推測(cè)StCDPK8 基因可能在馬鈴薯干旱響應(yīng)過(guò)程發(fā)揮重要的作用。本研究結(jié)果為進(jìn)一步解析馬鈴薯StCDPK8 基因響應(yīng)干旱脅迫的信號(hào)通路和調(diào)控機(jī)理提供了理論依據(jù)，為馬鈴薯CDPKs蛋白生物學(xué)功能的深入研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究根據(jù)對(duì)馬鈴薯StCDPK8 基因的生物信息學(xué)在線分析結(jié)果顯示，StCDPK8 基因啟動(dòng)子上游序列中含有與激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫應(yīng)答等相關(guān)的順式作用元件，表明馬鈴薯StCDPK8 基因可能參與植物脅迫逆境響應(yīng)。干旱脅迫瞬時(shí)處理后，抗旱性不同馬鈴薯品種中StCDPK8 基因表達(dá)量差異顯著，推測(cè)該基因與馬鈴薯干旱逆境脅迫響應(yīng)有關(guān)。本研究結(jié)果可為基于植物基因工程上的改良提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，同時(shí)為馬鈴薯CDPKs 蛋白生物學(xué)功能和抗旱育種的全面研究提供參考。