文小龍

摘要：擬莖點霉屬（Phomopsis）是腔孢綱球殼孢科真菌中的一個屬，是一類重要的植物致病菌，可寄生多種不同科屬的植物。該屬病原菌分布廣種類多，可引起多種植物病害，如植物的枝枯、葉枯、爛莖、潰瘍及果腐等嚴重病害。本研究主要對從茶樹上分離出來的擬莖點霉屬病原菌進行形態(tài)學(xué)結(jié)合DNA序列分析的方法來進行鑒定，生物防治方面的研究在本文中也進行了探討，為后續(xù)茶葉病害生物防治的應(yīng)用提供一定的參考依據(jù)。

關(guān)鍵詞：擬莖點霉屬;茶樹病害;生物防治

1 前言

擬莖點霉屬（Phomopsis）屬于腔孢綱球殼孢科真菌中的一個屬，是一種重要的植物致病菌，據(jù)調(diào)查顯示近年來該病原菌在全世界范圍內(nèi)的很多植物上都常有發(fā)生，且發(fā)現(xiàn)的種類也很多，擬莖點霉引起的病害主要表現(xiàn)在葉片枯黃、枝干部位枯萎腐爛、果實潰瘍腐爛等嚴重病害，對于植物來說擬莖點霉的危害是致命的。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

2.1.1 試劑

無菌水、酒精、DNA試劑盒、無水乙醇、100 mg·ml-1 硫酸鏈霉素等。

2.1.2 材料

生防菌、封口膜、茶葉病害標本、超凈操作臺、解剖針、接種針、酒精燈、手術(shù)刀、剪刀、打孔器、標簽、體式鏡、生物顯微鏡、Bio-Rad梯度PCR儀等。以上材料試劑均由貴州大學(xué)植物病理實驗室提供;其中茶葉病害標本采摘于松桃苗族自治縣普覺現(xiàn)代循環(huán)農(nóng)業(yè)示范園區(qū)。

2.2 病原菌的分離及純化

2.2.1 標本采集及處理

（1）標本采集：2019年8月在松桃苗族自治縣普覺現(xiàn)代循環(huán)農(nóng)業(yè)示范園區(qū)采集病害茶葉標本。

（2）標本處理：用70%酒精浸泡20s，然后用棉花輕輕擦拭標本葉表面，在用無菌水清洗擦干備用。

2.2.2 PDA固體培養(yǎng)基的制作

（1）取200g去皮馬鈴薯切塊水煮沸至軟化。

（2）過濾取濾液，加20g葡萄糖、15～20g瓊脂混合均勻，溶解加水定容至1L。

（3）冷卻轉(zhuǎn)移至500ml錐形瓶中，120℃滅菌20～30min，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.3 單孢分離

在無菌操作臺中把將PDA培養(yǎng)基轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿中加適量100 mg·ml-1 硫酸鏈霉素。然后通過體式顯微鏡觀察已清潔過的標本，找到病斑部位，挑取病斑孢子，置于培養(yǎng)基中用封口膜密封，28℃培養(yǎng)一周。

2.2.4 病原菌的純化

培養(yǎng)基中長出可見菌落后觀察記錄菌絲形態(tài)特征，用菌絲頂端純化法挑取菌絲純化培養(yǎng)，重復(fù)該步驟直至所培養(yǎng)出來的病原菌只有一種為止。

2.3 病原菌DNA的提取

（1）準備工作：準備無菌凍存管、無菌離心管、無菌移液槍，DNA試劑盒。

（2）保存菌絲：取凍存管加2ml左右滅菌水，將長滿菌絲的培養(yǎng)基切成合適小塊放入凍存管。每種菌保存三管，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

（3）提取菌絲：取培養(yǎng)皿中的菌絲置于離心管，加600μl BufferFG1和少量石英砂研磨至研磨棒上不沾菌絲為止。

（4）65℃水浴加熱30～40min，7min搖晃一次。

（5）加140μl Buffer FG2，冰水浴5min，以10000rpm/min離心6min。

（6）取400μl上清液于新離心管中，加400μl無水乙醇和200μl Buffer FG3混合搖勻。

（7）轉(zhuǎn)移到2ml的柱子離心管中，以12000rpm/min離心2min，靜置取上清液。

（8）取上清液加650μlDNA washing buffer，以10000rpm/min離心2min。

（9）轉(zhuǎn)柱子濾管于新的1.5ml離心管中加入Elution Buffer 5μl以12000rpm/min離心2min，取下清液，取下清液于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 PCR擴增及DNA-ITS序列測定

本試驗采用引物為ITS1（5'–TCCTCCGC?TTATTGATATGC-3'）和ITS4（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）。將9.5μLddH2O，12.5μL 2×Tap Master Mix，正反引物各1μl，加入1μl目的DNA中。反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，53℃退火30s，72℃延伸90s，35次循環(huán);最后72℃充分延伸7min，4℃保存。

2.5 凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量

（1）20ml五倍的TBE緩沖液定容到200ml，制作成0.5倍緩沖液。加0.4g瓊脂糖，放入錐形瓶中并加入50ml 0.5倍的緩沖液加熱至瓊脂糖完全溶解。

（2）加入5μl goldview搖勻倒入電泳膠槽，待其完全凝固后加入緩沖液至電泳槽水平面。

（3）用移液槍逐個點樣，每點一個樣換一個膠頭。

（4）接通電源，電壓控制在60～80V，當彩帶跑過膠板1/2后停止電泳。

（5）采用Bio–Rad凝膠成像系統(tǒng)觀察，觀察條帶的長度及亮度，確定DNA質(zhì)量。

2.6 序列同源性比較及鑒定

得到的DNA產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，序列經(jīng)Blast并與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比較得出結(jié)果。

2.7 回接確定其在茶樹上的致病性

（1）供試菌株：于貴州大學(xué)教學(xué)茶園采摘新鮮健康的茶葉若干編號，用于回接試驗。

（2）用無菌水清洗茶葉標本滅菌。

（3）病原菌接種體的制備：將已確定為擬莖點霉真菌屬所對應(yīng)的保存菌重新放入PDA固體培養(yǎng)基活化培養(yǎng)，28℃條件培養(yǎng)7d。0C4DB567-1758-4DB7-AE07-51627FF0E814

（4）接種病原菌：用解剖針破壞茶葉的皮外組織，直徑5mm無菌打孔器取菌餅置于茶葉表面?zhèn)谔帯?/p>

（5）用濕潤棉花包裹茶葉標本葉柄，加少許無菌水保濕，28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待茶葉上長出病斑后觀察記錄病斑形態(tài)。

（6）再次從標本提存病原菌，與原病原菌比較。

2.8 生物防治

本試驗采用平板對峙法進行試驗，生防菌來自于實驗室，編號Hg1、Hg6、Hg7。

（1）生防菌的活化：將三種生防菌接入PDA培養(yǎng)基中培養(yǎng)備用。

（2）5mm直徑打孔器截取病原菌菌餅置于PDA培養(yǎng)基中央。

（3）5mm直徑打孔器截取兩塊生防菌菌塊分別置于病原菌兩側(cè)，病原菌與生防菌間隔35mm。

（4）空白對照：以直接病原菌的處理作為對照組，每個處理重復(fù)三次記做處理A、處理B、處理C，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)一周。

（5）待對照組病原菌長滿整個培養(yǎng)基以后開始測量實驗組病原菌菌落的直徑。

（6）計算：

3 試驗結(jié)果分析

3.1 病原菌的分離純化分析

病害標本經(jīng)純化處理以后從中分離出擬莖點霉病原菌。見下圖（圖1）

茶葉病斑為黃褐色，水漬狀，圓形或不規(guī)則形病斑。在PDA培養(yǎng)基中菌落初為白色，漸變?yōu)辄S白色，菌落整體平整，中間濃密邊緣較為稀疏，生長速度極其快，培養(yǎng)一周左右長滿整個培養(yǎng)基。

3.2 凝膠電泳結(jié)果分析

經(jīng)過采用Bio–Rad凝膠成像系統(tǒng)對凝膠電泳觀察到主帶清晰，拖尾現(xiàn)象不明顯質(zhì)量較好的DNA。見下圖（圖2）

3.3 序列同源性比較結(jié)果分析

以ITS1（5-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3）和ITS4ITS4（5-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3）（由上海捷瑞生物工程有限公司合成）引物進行PCR擴增，得到的DNA產(chǎn)物送至北京諾賽基因組研究中心有限公司進行測序，得到以下ITS序列：

ACCCTTTGTGAACTTATACCTTACTGTTGCCTCGGCGCATGCCGGCCCCCCTGGGGGCCCCTCCTTCTGGAGGAGCAGGCACGCCGGCGGCCAACCTAACTCTTGTTTTTACACTGAAACTCTGAGAATAAAACATAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGCCTGGCTTGGTGATGGGGCACTGCCTGTAAAAGGGCAGGCCCTGAAATTCAGTGGCGAGCTCGCCAGGACCCCGAGCGCAGTAGTTAAACCCTCGCTCTGGAAGGCCCTGGCGGTGCCCTGCCGTTAAACCCCCAACTTCTGAAAATTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAAT

上述序列經(jīng)Blast并與NCBI數(shù)據(jù)庫中的已知序列進行同源性比較，鑒定結(jié)果為Phomopsis sp.同源性為100%的登錄號為KJ463526.1。

3.4 回接試驗分析

將所得病原菌進行回接試驗，試驗結(jié)果表明茶葉表現(xiàn)出了病斑，出現(xiàn)病斑與分離出病原菌的標本上的病斑基本吻合，且發(fā)病后再次從葉片上分離所得的病原菌與初次鑒定所得病原菌為同一種病原菌，進一步確定該病原菌能使茶樹發(fā)病，通過試驗可以看出（圖3），在相同環(huán)境下經(jīng)過病原菌侵染后的茶葉標本產(chǎn)生了病斑，而空白對照組則無此癥狀。

3.5 生防菌拮抗試驗結(jié)果分析

由下表（表1）試驗所用三種生防菌對擬莖點霉菌的生長都有一定的抑制效果，表明了這三種生防菌本身，或者是他們的代謝產(chǎn)物對擬莖點霉菌的生長具有抑制作用。其中接種了Hg1的病原菌平均直徑為60.57mm，接種了Hg6的病原菌平均直徑為38.14mm，接種了Hg7的病原菌平均直徑為44.15mm，平均抑菌率分別為31.9%，57.2%，50.75%，抑制效果越好平均直徑就越小，反之抑制效果越差平均直徑就越大，平均直徑跟平均抑制率成負相關(guān)。

4 結(jié)論

（1）致病性分析：通過試驗證明，從所采摘的茶葉標本上分離出了擬莖點霉病原菌，通過回接試驗發(fā)現(xiàn)接種了擬莖點霉病原菌的茶葉標本表現(xiàn)出病態(tài)，而在相同環(huán)境下，空白對照組則無此現(xiàn)象，說明了擬莖點霉確實能夠浸染茶樹并使茶樹致病。

（2）本試驗采用了平板對峙法進行試驗，試驗結(jié)果表明了在一定的生長環(huán)境下，所選取實驗室的三種生防菌對擬莖點霉的生長都產(chǎn)生了一定的抑制作用。但這僅僅只是在實驗室里得到的結(jié)果，本研究并不能確定其在復(fù)雜的自然環(huán)境下，試驗所用生物生防菌是否對擬莖點霉屬具有相同的抑制效果，有待做進一步的研究。

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