呂旭東，陶玉蓮，馬宇飛，顏 菲，張美玲

(天津醫(yī)科大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與技術(shù)學(xué)院，天津 300070)

細(xì)胞色素P450(CYP)同工酶是一類(lèi)含血紅素的單加氧酶家族，主要位于線粒體內(nèi)膜或真核細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜中[1]。人類(lèi)基因組中編碼有57種CYP蛋白，這些基因被分成18 個(gè)家族和43 個(gè)亞家族。CYP的精確命名由CYP(細(xì)胞色素的正式縮寫(xiě))、家族(數(shù)字)、亞家族(字母)和同工型(數(shù)字)按順序書(shū)寫(xiě)。通常，CYP家族1、2和3包含主要的異種生物代謝酶，在藥物基因組學(xué)風(fēng)險(xiǎn)中起主要作用，而CYP4酶參與脂肪酸的代謝，與遺傳疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[2]。CYP4F12是 CYP4酶中目前研究較少的藥物代謝酶，主要在肝臟、腎臟、腸道中表達(dá)[3-4]。對(duì)肝癌中CYP4表達(dá)譜的評(píng)估表明CYP4F12是肝癌預(yù)后的有利因素[5]。據(jù)相關(guān)研究表明，CYP4F12可以催化花生四烯酸(AA)發(fā)生羥基化反應(yīng)[6]。AA及其代謝物對(duì)腫瘤的進(jìn)展以及血管和腎臟的血管生成和血壓調(diào)節(jié)具有重要作用[7]。目前，并沒(méi)有相關(guān)報(bào)道解釋CYP4F12催化AA的機(jī)制。

細(xì)胞色素P450依賴(lài)性ω-羥基化是CYP4家族成員的原型代謝反應(yīng)，對(duì)治療藥物、內(nèi)源性化合物的消除和生物活化都很重要[8]。這種ω-區(qū)域選擇性不是絕對(duì)的，并且大多數(shù)CYP4酶會(huì)產(chǎn)生末端鏈羥基化產(chǎn)物的混合物。羥基化產(chǎn)物ω：ω-1，ω-2，ω-3的比率范圍可以從>20∶1到0∶1，變化范圍很大[9]。CYP4F8、CYP4F12、CYP4X1和CYP4Z1都不是嚴(yán)格ω羥化酶，這些酶的底物特異性和產(chǎn)物區(qū)域選擇性尚未恰當(dāng)定義。

為了解底物反應(yīng)性和活性位點(diǎn)殘基在CYP4酶介導(dǎo)的ω-羥基化中的作用，本文研究CYP4F12介導(dǎo)AA內(nèi)部羥基化作用。將密度泛函理論(DFT)計(jì)算與分子對(duì)接，分子動(dòng)力學(xué)(MD)模擬和結(jié)合自由能(MM/GBSA)計(jì)算一起應(yīng)用于解釋CYP4F12催化AA的代謝。這些方法的組合有助于了解復(fù)雜系統(tǒng)(如AA)的酶代謝過(guò)程，并正確解釋CYP4F12催化AA的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 DFT計(jì)算

研究建立了CYP的Compound I(Cpd I)模型，Cpd I是血紅素的最終氧化態(tài)形式，如圖1(a)所示。計(jì)算在B3LYP水平上進(jìn)行。幾何優(yōu)化中，F(xiàn)e原子使用LANL2DZ贗勢(shì)基組，其他原子使用6-311+G(d，p)基組。使用Becke-Johnson阻尼考慮色散作用。最終能量計(jì)算中使用隱式連續(xù)介質(zhì)模型(COSMO)考慮溶劑效應(yīng)。使用零點(diǎn)振動(dòng)能(ZPE)進(jìn)行能量校正，溫度設(shè)置為298.15 K。使用頻率計(jì)算驗(yàn)證得到的過(guò)渡態(tài)。所有計(jì)算使用Gaussian 16軟件包[10]進(jìn)行。

(a)反應(yīng)路徑圖；(b)底物潛在代謝位點(diǎn)。

1.2 蛋白3D模型的構(gòu)建

在PSI-BLAST(https://www.ebi.ac.uk/Tools/sss/psiblast/)上基于CYP4F12序列搜索模板。在綜合考慮下選擇得分最高的6C93、5T6Q、6MA7、3TJS蛋白用于多模板建模。使用Modeller 9軟件包[11]生成CYP4F12模型。血紅素分子從模板蛋白6C93[12]獲取并定位于建模蛋白。最終使用Verify3D[13]、ERRAT[14]、PROCHECK[15]和QMEAN[16]程序評(píng)估模型質(zhì)量。

1.3 分子對(duì)接

分子對(duì)接被廣泛用于生物分子相互作用和機(jī)理的研究[17]。本文使用AutoDock 4.2軟件[18]進(jìn)行對(duì)接。AA結(jié)構(gòu)來(lái)自Pubchem庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)經(jīng)DFT方法優(yōu)化得到。對(duì)接使用60×60×60網(wǎng)格的三維周期性對(duì)接盒子，以AA為對(duì)接中心，格點(diǎn)間距為0.0375 nm。蛋白設(shè)置為剛性，配體為柔性。生成的構(gòu)象數(shù)為20。

1.4 分子動(dòng)力學(xué)模擬

使用Gromacs 5.1.4軟件[19]來(lái)MD模擬。模擬中使用charmm 36 力場(chǎng)[20]，小分子的charmm力場(chǎng)參數(shù)在CHARMM-GUI服務(wù)器(http://www.charmm-gui.org)上生成。模擬在TIP3P水溶劑模型及十二面體盒子下進(jìn)行，蛋白到盒子邊緣的距離為1.4 nm。添加3個(gè)Na+以保持系統(tǒng)中性。能量最小化的方法為最陡下降法，當(dāng)能量小于1 000.0 kJ/mol時(shí)進(jìn)行收斂。在1 ns的NVT系綜和5 ns的NPT系綜的預(yù)平衡后模擬體系穩(wěn)定。最后體系進(jìn)行500 ns的MD模擬。時(shí)間步長(zhǎng)為2 fs，每2 ps保存一次軌跡。

2 結(jié)果與分析

2.1 DFT預(yù)測(cè)羥基化的區(qū)域選擇性

運(yùn)用DFT理論研究Cpd I模型系統(tǒng)[圖1(a)]是探究CYP酶在藥物代謝中機(jī)制的有用方法[21]。AA有幾種可能的代謝位點(diǎn)會(huì)發(fā)生羥基化：ω(ω′，ω″，ω?)，ω-1(ω-1R，ω-1S)，ω-2(ω-2R和ω-2S)，ω-3(ω-3R和ω-3S)和ω-4(ω-4R和ω-4S)見(jiàn)圖1(b)。脂族羥基化速率決定步驟是Cpd I介導(dǎo)的氫提取反應(yīng)。

表1列出各個(gè)代謝位點(diǎn)提取氫的活化勢(shì)壘，它們均在DFT計(jì)算的能量的正常范圍內(nèi)。計(jì)算預(yù)測(cè)活化勢(shì)壘最高的是ω位點(diǎn)，范圍為77.25～81.06 kJ/mol;而活化勢(shì)壘最低的位于ω-2位點(diǎn)，值為55.34 kJ/mol。先前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明[22]，CYP4F2催化的AA主要生成ω-2羥基化產(chǎn)物。因此，DFT計(jì)算結(jié)果與實(shí)驗(yàn)觀察結(jié)果一致。

表1 潛在催化位點(diǎn)的反應(yīng)能壘

2.2 人類(lèi)CYP4F12同源模型的產(chǎn)生和驗(yàn)證

CYP4F12建模蛋白(圖2)與模板序列的全同率(sequence identity)為44.89%。在TMHMM v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)服務(wù)器上對(duì)CYP4F12序列進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè)，刪除構(gòu)成膜嵌入結(jié)構(gòu)域的前37個(gè)殘基，這些殘基遠(yuǎn)離活性位點(diǎn)且不會(huì)影響模型構(gòu)建。

(a)建模蛋白正面圖；(b)建模蛋白背面圖；(c)建模單板(青)與模板(灰)疊加。

選取moddller程序輸出DOPE得分最佳的模型用于后續(xù)研究。該模型的Ramachandran結(jié)果[圖3(a)]顯示超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值90%以上的殘基具有良好的立體化學(xué)特征(92.1%)。Verify3D結(jié)果顯示超過(guò)標(biāo)準(zhǔn)值80%的殘基3D-1D平均得分≥0.2(90.3%)。QMEAN[圖3(b)]可以導(dǎo)出全局和局部絕對(duì)質(zhì)量估計(jì)值。該模型的QMEAN得分為0.72，相關(guān)的Z-score為-0.03。ERRAT結(jié)果[圖3(c)]顯示所有殘基中的76.1%的計(jì)算誤差值均低于95%排斥限度。

(a)PROCHECK；(b)QMEAN；(c)ERRAT。

2.3 AA與CYP4F12活性位點(diǎn)的對(duì)接模式

圖4(a)展示了AA的20個(gè)對(duì)接姿勢(shì)的疊加圖。所有的對(duì)接姿勢(shì)都顯示AA與Asn122和Ser399側(cè)鏈形成氫鍵，表明其在穩(wěn)定AA對(duì)接姿勢(shì)中起主要作用。除上述殘基外，通向活性位點(diǎn)的通道被大部分疏水性殘基所覆蓋，為非極性長(zhǎng)鏈AA創(chuàng)造了有利的環(huán)境。對(duì)接結(jié)果的20個(gè)姿勢(shì)中均顯示底物與以下10個(gè)殘基接觸：Phe124、Ile125、Leu137、Thr324、Phe325、Phe327、Gly328、Thr332、Ile398和Ile505。

結(jié)果還顯示，活性氧(Fe-O)原子與ω-2位碳原子具有距離優(yōu)勢(shì)，排名第一的對(duì)接姿勢(shì)[圖4(b)]Fe-O原子與ω-2位碳原子的距離為0.28 nm。這與上一步DFT預(yù)測(cè)的結(jié)果相一致，距離的優(yōu)勢(shì)更有利于在ω-2位點(diǎn)發(fā)生催化。

(a)20個(gè)對(duì)接結(jié)果疊加圖；(b)排名第一的對(duì)接姿勢(shì)(青色線為氫鍵)。

2.4 AA與CYP4F12動(dòng)態(tài)結(jié)合過(guò)程

從對(duì)接結(jié)果中手動(dòng)選擇的5種不同姿勢(shì)，進(jìn)行500 ns的MD模擬。我們專(zhuān)注于分析運(yùn)行之一(MD-1)。

在模擬過(guò)程中，蛋白質(zhì)的構(gòu)象沒(méi)有劇烈變化[圖 5(a)]。雖然在模擬中250 ns左右觀察到蛋白質(zhì)的平均RMSD值增加，但其值保持在0.4 nm范圍內(nèi)。在模擬過(guò)程中波動(dòng)程度最大的氨基酸殘基的均方根波動(dòng)(RMSF)在圖中相應(yīng)位置標(biāo)出[圖5(b)]，經(jīng)核查其映射到蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上高度靈活的柔性環(huán)，可以證實(shí)平均RMSD的增加是表面柔性環(huán)的正常波動(dòng)所造成的而不是由于蛋白質(zhì)部分的重大重組。相比之下，參與配體結(jié)合的氨基酸在模擬過(guò)程中顯得穩(wěn)定，并表現(xiàn)出很低的波動(dòng)。在整個(gè)模擬過(guò)程中，AA均保持一定的穩(wěn)定性，表明狹窄的結(jié)合位點(diǎn)僅允許受約束的構(gòu)象運(yùn)動(dòng)[圖5(a)]。

(a)CYP4F12(藍(lán)色)和底物(紅色)的時(shí)間依賴(lài)性均方根偏差(RMSD)；(b)各個(gè)殘基均方根波動(dòng)(RMSF)。

通過(guò)3次MD模擬，收集并分析了共150 000幀軌跡中潛在取代位點(diǎn)到活性氧原子距離。圖6是在每個(gè)MD體系下潛在代謝位點(diǎn)到Fe-O原子距離最小且滿(mǎn)足距離≤0.3 nm的3D圓柱狀統(tǒng)計(jì)圖。每個(gè)體系下，ω-2位點(diǎn)氫原子均比其他位置的氫原子更接近Fe-O原子，活性位點(diǎn)殘基傾向于將ω-2位點(diǎn)定向到Fe-O原子上。結(jié)果表明，當(dāng)AA與CYP4F12活性位點(diǎn)結(jié)合時(shí)，ω-2位點(diǎn)最容易與Fe-O原子接近，這與之前結(jié)果一致。

圖6 在3次MD模擬中滿(mǎn)足距離標(biāo)準(zhǔn)位點(diǎn)快照頻率分析

我們還詳細(xì)分析了CYP4F12活性位點(diǎn)中AA的結(jié)合模式。盡管AA的脂族鏈具有很高的柔性，但它在多個(gè)代表性結(jié)構(gòu)中具有相似的結(jié)合模式。在500 ns模擬的最后一幀中，AA定位在血紅素頂部的疏水通道內(nèi)具有催化競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)取向。其中，ω-2位氫原子指向Fe-O原子(圖7)。此外，在MD模擬期間，血紅素附近的活性位點(diǎn)殘基相對(duì)穩(wěn)定，RMSF值均低于0.2 nm，且AA和殘基Asn122、Ser399之間的氫鍵一直存在。

蛋白質(zhì)殘基的疏水性范圍為紅色(非常疏水)到藍(lán)色(非常親水)。

通過(guò)計(jì)算模擬AA與CYP4F12結(jié)合自由能得出靜電相互作用是結(jié)合過(guò)程中的主要弱相互相，范德華相互作用的貢獻(xiàn)較小。參與靜電相互作用的氨基酸主要有Asn122、Ser399、Ile125、Leu137、Thr324、Gly328、Thr332、Ile398和Ile505，參與貢獻(xiàn)范德華力的氨基酸主要有Phe327、Phe124和Phe325。

3 討論與結(jié)論

CYP在生物體內(nèi)的氧化代謝中發(fā)揮重要作用，它們催化大量不同的反應(yīng)，增加母體化合物的親水性，以促進(jìn)其從人體排泄。人類(lèi)對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究依賴(lài)于晶體解析，而由于技術(shù)的限制，還有眾多的晶體結(jié)構(gòu)是未知的。同源建模無(wú)疑是一種經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的方法通過(guò)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)來(lái)進(jìn)行前瞻性的研究。理論與實(shí)驗(yàn)相結(jié)合來(lái)預(yù)測(cè)化學(xué)反應(yīng)各個(gè)方面的能力正在不斷提高。量化計(jì)算、分子對(duì)接、分子動(dòng)力學(xué)模擬等計(jì)算可以在實(shí)驗(yàn)觀測(cè)不到的原子層面探究酶代謝的細(xì)節(jié)，精確研究結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系。

基于DFT、酶結(jié)構(gòu)的同源性模型、AA與CYP4F12的分子對(duì)接和從分子對(duì)接階段確定的實(shí)際姿勢(shì)開(kāi)始的500 ns MD模擬，研究AA與CYP4F12的結(jié)合。DFT計(jì)算初步氫提取反應(yīng)勢(shì)壘符合C—H鍵的提取順序且ω-2位點(diǎn)具有最低的活化勢(shì)壘。同源建模模型保留了CYP的整體折疊，具有12個(gè)α-螺旋和4個(gè)β-折疊，結(jié)構(gòu)完整。目標(biāo)蛋白與模板蛋白的幾何結(jié)構(gòu)對(duì)齊后的RMSD小于0.1 nm，相似度高。主要差異在一些靈活的loop環(huán)上。通過(guò)多種工具(Verify3D，ERRAT，PROCHECK和QMEAN)評(píng)估證明CYP4F12建模結(jié)構(gòu)是高質(zhì)量的。以上證明建模蛋白用于MD模擬是可靠的，這實(shí)際上也通過(guò)模擬的RMSD分析得到了驗(yàn)證。AA的pKa為4.82(http://www.drugbank.ca/drugs/DB04557)，這使其在正常生理pH值下幾乎沒(méi)有質(zhì)子化。在分子對(duì)接和動(dòng)力學(xué)模擬中，AA是采用未質(zhì)子化的形式。MD模擬中底物的低RMSD表明底物運(yùn)動(dòng)較少，其具有較低的動(dòng)態(tài)性，有利于降低氧化的自由能壘。模擬過(guò)程中底物能夠與Asn122、Ser399形成持續(xù)、穩(wěn)定的氫鍵結(jié)合能力。這可以使底物很好地定位于酶活性中心，是催化發(fā)生的基礎(chǔ)。而活性位點(diǎn)附近的殘基Phe124、Ile125、Leu137、Thr324、Phe325、Phe327、Gly328、Thr332、Ile398和Ile505的低RMSF值也揭示了它們?cè)诖呋^(guò)程中穩(wěn)定底物的重要作用。在結(jié)合自由能的分析中再一次證明，以上氨基酸殘基是結(jié)合過(guò)程中主要參與的氨基酸殘基。

本文提出的CYP4F12與AA的結(jié)合模式，不僅為研究CYP4F12本身的活性與功能提供理論見(jiàn)解，而且為其他CYP4酶提供了一種研究思路與方法。與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的良好匹配展現(xiàn)了理論作為實(shí)驗(yàn)伙伴的作用，以及MD模擬未來(lái)作為P450酶化學(xué)反應(yīng)的可靠預(yù)測(cè)指標(biāo)的作用。