楊艷紅，劉 旸，張浩鉑，姚心怡，賀 禧

(1.重慶理工大學(xué) 藥學(xué)與生物工程學(xué)院， 重慶 400054； 2.重慶市育才中學(xué), 重慶 400050)

0 引言

纖維素生物質(zhì)是地球上分布最廣泛、含量最豐富的碳水化合物，約占全球總可用生物量的50%，主要由纖維素(30%～50%)、半纖維素 (20%～30%)、木質(zhì)素(15%～30%)組成[1-3]。但纖維素、半纖維素和木質(zhì)素是緊密結(jié)合的、通過(guò)氫與共價(jià)鍵的復(fù)接，使其成為頑固性的生物質(zhì)結(jié)構(gòu)，所以纖維素生物質(zhì)也是應(yīng)用效率最低的一種自然物質(zhì)[4-5]，在實(shí)際應(yīng)用中，僅開(kāi)發(fā)了不到2%的纖維素資源[6]。隨著人類(lèi)世界迅猛發(fā)展，能源需求量急劇上升，為實(shí)現(xiàn)可持續(xù)發(fā)展，世界各國(guó)均在努力尋求新的替代能源，如風(fēng)能、核能、太陽(yáng)能、生物質(zhì)能等。在各種新型的替代能源中，纖維素燃料乙醇是公認(rèn)的最具有發(fā)展前景的可再生能源。利用現(xiàn)代生物技術(shù)將纖維素轉(zhuǎn)化為乙醇等液體燃料，產(chǎn)量穩(wěn)定、可再生、無(wú)污染，有希望解決能源危機(jī)、環(huán)境污染和糧食危機(jī)等問(wèn)題[7]。雖然科學(xué)家們現(xiàn)在已經(jīng)做了大量的木質(zhì)纖維素的轉(zhuǎn)化研究，但是由于半纖維素酶和纖維素酶的成本問(wèn)題，把纖維素生物質(zhì)轉(zhuǎn)化成生物乙醇仍面臨巨大挑戰(zhàn)[8]。目前，生物燃料乙醇生產(chǎn)高度依賴(lài)于商業(yè)生產(chǎn)的酶，成本非常高[9-10]。因此，開(kāi)發(fā)新型、高效、低成本的纖維素酶迫在眉睫，選育纖維素酶高產(chǎn)菌株尤其重要[11-12]。本課題組從重慶市周邊堆肥中篩選出一株纖維素酶高產(chǎn)細(xì)菌菌株，對(duì)其進(jìn)行鑒定和發(fā)酵條件研究，可為纖維素酶制劑研究提供菌株來(lái)源和為遺傳改良、基因工程菌株的構(gòu)建等工作提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株

B4 ，重慶理工大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室分離。

1.1.2試劑

葡萄糖、3，5-二硝基水楊酸等常規(guī)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；溶菌酶、細(xì)菌基因組總DNA 提取試劑盒、細(xì)菌鑒定試劑盒、PCR 產(chǎn)物回收試劑盒均購(gòu)于北京擎科生物科技有限公司成都分公司。

1.1.3培養(yǎng)基

肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏0.3 g，蛋白胨1.0 g，NaCl 0.5 g，水100 mL，pH 7.0。

菌種鑒定培養(yǎng)基：參見(jiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[7]。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：(NH4)2SO40.5 g，蛋白胨0.5 g，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.075 g，糖蜜0.5 g，CaCl20.5 g，NaCl 0.5 g，纖維素粉20 g，麩皮30 g，水125 mL。

1.2 方法

1.2.1菌株形態(tài)及菌落形態(tài)觀察

將B4菌株劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，30 ℃下培養(yǎng)1～2 d，觀察菌落形態(tài)。挑取菌落抹片，然后分別進(jìn)行革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色和鞭毛染色，鏡檢，觀察分離菌株菌體形態(tài)與其他特征。

1.2.2生理生化特征和生理耐受特性

參照文獻(xiàn)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[13]和《現(xiàn)代微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》[14]進(jìn)行。

1.2.316S rDNA序列測(cè)定

把B4菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，嚴(yán)格按照植物 DNA 提取試劑盒(通用型)操作說(shuō)明進(jìn)行操作，獲得基因組DNA，提取的 DNA 樣品適量稀釋后作為 PCR 模板，以擎科 1×TSE101 金牌 mix 進(jìn)行PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物用擎科DNA 凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收純化。純化產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司成都分公司測(cè)序部進(jìn)行全序列測(cè)序。將序列通過(guò)NCBI網(wǎng)站中的BLAST程序與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比分析。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，從數(shù)據(jù)庫(kù)中選取與所分析的細(xì)菌基因序列同源性較高的已知相關(guān)序列，采用MEGA 11.0軟件進(jìn)行多重序列比對(duì)分析，用鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Bootstrap檢驗(yàn)，Bootstrap值為1 000。

1.2.4發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

1) 酶活力定義：以濾紙為底物，在一定反應(yīng)條件(pH 5.6，50 ℃，恒溫30 min)下，以水解反應(yīng)中，1 g發(fā)酵固體產(chǎn)生的纖維素酶1 min催化纖維素生成1 μg葡萄糖為1個(gè)濾紙酶活單位，以U表示。

2) 濾紙酶活力測(cè)定方法：采用DNS法[14]。

3) 先采用單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳纖維素粉為玉米芯粉，最佳遲效氮源蛋白胨和麩皮。在初篩的基礎(chǔ)上對(duì)培養(yǎng)基的主要成分進(jìn)行13因素3水平的正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)選，固體發(fā)酵培養(yǎng)從第1 d開(kāi)始取樣，直到測(cè)定濾紙酶活下降為止，以最高濾紙酶活為指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，因素水平排布見(jiàn)表1。

表1 培養(yǎng)基成分正交設(shè)計(jì)因素水平排布

1.2.5理化因素發(fā)酵條件篩選

先經(jīng)單因素預(yù)實(shí)驗(yàn)分別確定初步的發(fā)酵條件為pH 6.5，溫度35 ℃。然后以pH、溫度和接種量為考察因素進(jìn)一步正交優(yōu)化，固體發(fā)酵培養(yǎng)從第1 d開(kāi)始取樣，直到測(cè)定濾紙酶活下降為止，以最高濾紙酶活為指標(biāo)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，正交實(shí)驗(yàn)因素水平排布見(jiàn)表2。

表2 理化條件篩選因素水平排布

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落形態(tài)及個(gè)體形態(tài)

B4菌株菌落均呈圓形，乳白色，表面干燥，中心隆起，邊緣不規(guī)則，呈鋸齒狀。菌體革蘭氏染色為陽(yáng)性，長(zhǎng)桿狀，芽孢橢圓中生，形態(tài)特征見(jiàn)圖1。

圖1 B4菌株形態(tài)特征示意圖

2.2 生理生化特征和生理耐受特性

B4菌的生理生化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3：除了運(yùn)動(dòng)性、V-P、吲哚試驗(yàn)呈陰性外，其余的甲基紅、纖維素水解、淀粉水解、硝酸鹽還原、尿素分解、過(guò)氧化氫酶、明膠液化試驗(yàn)均呈陽(yáng)性；糖類(lèi)利用試驗(yàn)結(jié)果表明B4菌對(duì)測(cè)試9種糖均可利用，對(duì)于五碳糖阿拉伯糖的利用效果最好，其次是葡萄糖、蔗糖和麥芽糖的利用效果好。生理耐受特性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4， B4菌能在25～45 ℃生長(zhǎng)，25～37 ℃生長(zhǎng)較旺盛，最適的生長(zhǎng)溫度為25 ℃；B4菌耐受NaCl最大濃度為8%；能在pH為5.0～8.0生長(zhǎng)，最適pH值為8.0。綜合供試菌株B4的形態(tài)特征及生理生化特性及生理耐受特性，《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》中相應(yīng)屬、種的有關(guān)性狀，可將B4菌歸入芽孢桿菌屬(Bacillus)。

表3 菌株B4生理生化特征

表4 B4菌的生理耐受性特性

續(xù)表(表4)

2.3 16S rDNA 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

B4的16S rDNA的基因全序列長(zhǎng)度為1 449 bp，在GenBank中的登錄號(hào)為：OM755768。將獲得的基因序列在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)分析，結(jié)果表明，B4的16S rDNA序列與許多Bacillusamyloliquefaciens相似性均為99.5%以上。從中選取部分同源性較高的菌種，用MEGA11.0構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，如圖2所示，發(fā)現(xiàn)B4與BacillusamyloliquefaciensstrainW9和SXAU001聚在一個(gè)進(jìn)化分支上。

綜合上述B4菌株的形態(tài)、生理生化特征，以及16S rDNA的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的分析，確定B4菌株為芽孢桿菌屬的解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

注：步長(zhǎng)值為1 000 ，節(jié)點(diǎn)上的頻率大于50的保留，括號(hào)中的數(shù)字表示序列在GenBank中的登錄號(hào)， 0.5%為遺傳標(biāo)尺

2.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

培養(yǎng)基篩選的正交試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。由極差值R可以得出各因素對(duì)菌株B4產(chǎn)酶活力的影響程度由大到小依次為：玉米芯粉> MgSO4·7H2O>CaCl2>土溫20>麩皮>蛋白胨>(NH4)2SO4>NaCl>水>土溫80。由正交分析可得出B4菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳配比為：通過(guò)直觀分析得出綜合的優(yōu)方案為：玉米芯粉 25 g、七水硫酸鎂 0.075 g、氯化鈣 0.2 g、土溫20 0.4 g、麩皮 8 g、蛋白胨 0.5 g、硫酸銨 0.2 g、氯化鈉 0.2 g、水 120 mL、土溫80 0.2 g、磷酸二氫鉀 0.5 g、糖蜜 0.5 g。

表5 發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

續(xù)表(表5)

根據(jù)表6方差分析進(jìn)行因素顯著性判斷，可見(jiàn)玉米芯粉和七水硫酸鎂對(duì)濾紙酶活有非常顯著的影響，氯化鈣和土溫20對(duì)濾紙酶活有顯著影響。而七水硫酸鎂的優(yōu)化結(jié)果正好處于中間水平值，不需再篩選。又因玉米芯粉、氯化鈣及土溫20在正交優(yōu)化結(jié)果中處于邊緣水平值，因此，在保持其他成分按正交優(yōu)化的結(jié)果外，玉米芯粉、氯化鈣及土溫20這3個(gè)因素需要另設(shè)水平進(jìn)行4因素3水平正交優(yōu)化，正交排布表和結(jié)果分別見(jiàn)表7、8。

表6 發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交實(shí)驗(yàn)方差分析

續(xù)表(表6)

表7 培養(yǎng)基成分復(fù)篩正交排布

通過(guò)復(fù)篩結(jié)果表8可以得出綜合的優(yōu)方案為：玉米芯粉 25 g、七水硫酸鎂 0.075 g、氯化鈣 0.1 g。綜合第1次正交優(yōu)化結(jié)果，最終確定B4發(fā)酵纖維素酶的最佳固體發(fā)酵培養(yǎng)基為：玉米芯粉 25 g、七水硫酸鎂 0.1 g、氯化鈣 0.1 g、土溫20 0.6 g、麩皮 8 g、蛋白胨 0.5 g、硫酸銨 0.2 g、氯化鈉 0.6 g、土溫80 0.2 g、磷酸二氫鉀 0.5 g、糖蜜0.5 g、水 125 mL。

表8 培養(yǎng)基成分復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果

2.5 理化因素發(fā)酵篩選

發(fā)酵理化條件篩選采用正交試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表9，由極差值R可以得出各因素對(duì)產(chǎn)酶活力影響由大到小依次為：溫度>pH>接種量。同時(shí)，正交分析得出B4菌的固體發(fā)酵條件為：溫度34 °C，pH 6.0，接種量1.5%(OD600=1.0)。

表9 理化條件篩選結(jié)果

B4菌在上述確定的最佳培養(yǎng)基和最佳理化條件下進(jìn)行發(fā)酵，取不同發(fā)酵時(shí)間的樣品進(jìn)行濾紙酶活測(cè)定，做出發(fā)酵時(shí)間和酶活的變化曲線，確定最佳發(fā)酵時(shí)間，結(jié)果如圖3所示，在前12 h內(nèi)濾紙酶活隨著發(fā)酵時(shí)間呈直線上升，12～24 h，濾紙酶活增加緩慢，直到24 h到達(dá)18.74 U/g，24 h以后，濾紙酶活迅速下降。

圖3 酶活隨發(fā)酵時(shí)間的變化曲線

3 討論

纖維素酶(cellulose)是降解纖維素生成單糖或多糖的一組酶的總稱(chēng)。纖維素酶由多組復(fù)合酶系組成，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1、4葡萄糖苷酶， 3種酶相互協(xié)同降解纖維素物質(zhì)[15]。濾紙是聚合度和結(jié)晶度都居“中等”的纖維性材料，以其為底物經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖的量來(lái)表征纖維素酶系總的糖化能力的方法得到廣泛應(yīng)用，它反映了三類(lèi)酶組分的協(xié)同作用，統(tǒng)稱(chēng)濾紙酶活，濾紙酶活力可代表纖維素酶的總體酶活力，即纖維素內(nèi)切酶水解纖維素聚合鏈，將其還原性和非還原性末端暴露在外；外切葡聚糖酶則作用于這些末端，釋放纖維二糖或纖維寡糖；β-葡聚糖苷酶的作用則是水解纖維二糖，3個(gè)酶組分相互協(xié)同作用，釋放最終的水解產(chǎn)物葡萄糖[16-17]。本文在篩選B4菌株固體發(fā)酵條件時(shí)以濾紙酶活為測(cè)定指標(biāo)，該指標(biāo)是菌株B4整個(gè)纖維素酶系的酶活力水平的綜合體現(xiàn)，代表了纖維素酶的3種酶組分協(xié)同作用后的總酶活。以該指標(biāo)篩選出來(lái)的發(fā)酵條件對(duì)菌株的實(shí)際開(kāi)發(fā)應(yīng)用更有參考價(jià)值。

目前對(duì)纖維素酶產(chǎn)生菌的研究主要集中在真菌，如木霉屬、青霉屬和曲霉屬等，而其纖維素酶多數(shù)結(jié)合在細(xì)胞膜上，菌體細(xì)胞需吸附在纖維素上才能起作用，使用很不方便，且酶的分離提取成本太高[18]，并且這些真菌生產(chǎn)纖維素酶不僅生產(chǎn)周期長(zhǎng)，產(chǎn)生的纖維素酶大多需要在較高溫度條件下才能發(fā)揮較好的效能，在室溫或較低溫度下，它們的酶活力都非常低。而細(xì)菌產(chǎn)生的纖維素酶以多酶復(fù)合體的形式存在，能夠更加徹底、更加有效地降解纖維素[19]。近 20 年來(lái)，隨著中性纖維素酶和堿性纖維素酶在棉紡織品的水洗工藝和洗滌劑中的成功應(yīng)用，細(xì)菌纖維素酶的酶制劑也顯示出良好的應(yīng)用前景[20]。

4 結(jié)論

本文篩選的B4菌株是一種解淀粉芽孢桿菌，是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細(xì)菌，在自然界分布廣泛，易分離培養(yǎng)，對(duì)人畜無(wú)毒無(wú)害，不污染環(huán)境，具有很好的應(yīng)用前景。另外，該菌株最適生長(zhǎng)溫度為25 ℃，在篩選的最適培養(yǎng)基和最適條件下，固體發(fā)酵24 h就能獲得較高濾紙酶活力，相對(duì)于普通真菌產(chǎn)酶周期一般幾天至一個(gè)月來(lái)說(shuō)，發(fā)酵周期大大縮短，并且酶系組分較全，具有很好的開(kāi)發(fā)潛力。