李史儀 陸顯格 魯國東 余文英*

（1福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建福州 350002；2福建農(nóng)林大學(xué)生命學(xué)院，福建福州 350002；3福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州 350002）

紅色紅菇Russula rosea，是一種純天然的大型珍貴野生食用菌，夏秋季多群生或散生于冷杉針闊混交林地上[1]。紅色紅菇營養(yǎng)豐富，富含多種人體必需常量元素和微量元素，具有高蛋白、低脂肪的特點[2]，有較高的食用及藥用價值。紅菇內(nèi)含有蛋白質(zhì)、多肽、多糖、甾類、萜類、有機(jī)酸和酚類等多種生理活性物質(zhì)，可為農(nóng)業(yè)、林業(yè)病蟲害的生物防治提供研發(fā)資源，但目前尚不能人工栽培。國內(nèi)外有不少關(guān)于野生紅菇的報道，如我國野生紅菇的生態(tài)、資源、分類、分離純化和應(yīng)用研究，紅菇的化學(xué)成分分析、子實體多糖提取等，為進(jìn)行人工栽培研究提供了科學(xué)依據(jù)。但到目前為止，由于紅菇生長所需的條件及生理的特殊性，國內(nèi)外至今也未見其人工栽培成功的報道[3]。

當(dāng)今食用菌微生態(tài)多樣性研究已成為熱點。研究微生物群落多樣性，主要采取傳統(tǒng)微生物的分離及分類鑒定方法（主要是平板分離、形態(tài)學(xué)的觀察）與現(xiàn)代分子生物學(xué)（主要采用高通量測序技術(shù)等）相結(jié)合手段[4]。筆者采用平板分離培養(yǎng)方法和現(xiàn)代高通量測序技術(shù)相結(jié)合手段，分析紅菇生境土壤的微生物種群及特征，旨在揭示紅菇生境微生物優(yōu)勢菌群等特征，為人為大幅度提高紅菇產(chǎn)量和品質(zhì)提供技術(shù)支撐，實現(xiàn)紅菇大規(guī)模以及大范圍人工栽培。

1 材料與方法

1.1 材料采集及處理

將采集的福建省古田縣紅色紅菇新鮮子實體（去除表面泥沙雜物）及子實體根際土帶回實驗室后，分別分成兩份于4℃冷藏保存?zhèn)溆?。其中一份用于直接分離培養(yǎng)微生物，另一份用于后續(xù)宏基因組的提取。

1.2 試驗方法

1.2.1 微生物的分離

紅菇子實體微生物分離：分離部位選取菌柄中間的組織塊，并采用添加腐殖土PDA培養(yǎng)[5]。根際土微生物分離：真菌用PDA培養(yǎng)基（添加氯霉素以去除細(xì)菌的干擾），細(xì)菌用NA培養(yǎng)基。

1.2.2 總基因組DNA提取及高通量測序

子實體基因組提取參照YU等[6]方法，子實體根際土的微生物基因組提取參照余文英等[7]方法。分別以子實體基因組或根際土的基因組為模板，采用真菌特異引物對ITS1F（TCCG TAGG TGAA CCTG CGG）和ITS4（TCCTCCGC TTAT TGAT ATGC）進(jìn)行PCR擴(kuò)增真菌ITS1?ITS4區(qū)域。以宏基因組為模板，采用引物338F（ACTCCTACGGGAGGCAGCA）和806R（GGACTACHVGGGTWTCTAAT）擴(kuò) 增 細(xì) 菌16 sRNA的V3—V6高變區(qū)域。PCR條件為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，50℃退火1 min，72℃延伸1 min，共15個循環(huán)，最后72℃延伸7 min，4℃保存。真菌和細(xì)菌PCR擴(kuò)增片段分別用Illumina HiSeq高通量測序。

1.2.3 分離培養(yǎng)細(xì)菌16sRNA、真菌ITS片段的PCR擴(kuò)增，克隆測序

將所分離純化的子實體及根際土壤微生物參照余文英等[7]方法提取DNA。以提取的基因組為模板，真菌采用引物對ITS1F和ITS4 PCR擴(kuò)增ITS1—ITS4片段，細(xì)菌采用細(xì)菌的通用引物27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（TACGGYTACCTTGTTACGACTT）PCR擴(kuò)增16 sRNA片段。PCR反應(yīng)條件同1.2.2。將PCR產(chǎn)物電泳純化后克隆到大腸桿菌，將陽性克隆菌液交由上海生工生物工程有限公司測序，最后將測序的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，鑒定。

1.2.4 測序數(shù)據(jù)處理

將Illumina HiSeq高通量測序的結(jié)果在BioEdit 7.0.8中手動更正，去除singleton的物種級操作分類單元OTU（Operational Taxonomic Untis），以97%的序列相似性聚類為OTU進(jìn)行物種定界。利用NCBI，Silva，UNITE數(shù)據(jù)庫比對OTU[8?9]，當(dāng)比對結(jié)果相似度≥90%則鑒定到屬，相似度在80%~89%鑒定到科[10]。對可培養(yǎng)菌的陽性克隆測序序列的結(jié)果用BioEdit編輯，相似度≥97%且堿基差異5個以內(nèi)的歸為一個種。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

采用VENNY方法對主要微生物菌群（Core microbiome）進(jìn)行在線分析（http：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）。通過spearman檢驗方法對選取所有樣本絕對豐度前10的OTU進(jìn)行微生物之間的互作關(guān)系（NetWork）分析，對spearman計算所得結(jié)果過濾掉P值大于0.05的或相關(guān)值|R|＜0.4。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅色紅菇子實體微生物多樣性分析

通過高通量檢測，紅色紅菇子實體的真菌和細(xì)菌的OTU，分別為369.67及109.33。進(jìn)一步分析了真菌及細(xì)菌的chao1、shannon指數(shù)，結(jié)果表明子實體微生物無論是物種豐富度還是生物多樣性都比較高，而真菌的物種豐富度比細(xì)菌高，但是細(xì)菌的多樣性比真菌高（表1）。

表1 子實體中OTU及alpha多樣性指數(shù)

2.2 紅色紅菇子實體微生物組成分析

對紅菇的子實體進(jìn)行了真菌和細(xì)菌的微生物擴(kuò)增子高通量測定，從而分析真菌和細(xì)菌的組成。

2.2.1 真菌核心菌群及優(yōu)勢種群分析

子實體樣本的真菌種類，按0.5%的閾值，包括5門，15綱，54目，75科，覆蓋157屬，通過韋恩分析（Venns）核心菌群，發(fā)現(xiàn)真菌屬水平上3個子實體樣本中有83個共有屬，占全部真菌屬的22.6%。進(jìn)一步對占比前20的真菌屬進(jìn)行Venns分析，發(fā)現(xiàn)3個子實體樣本中，有16個共有屬即子實體的核心真菌（Core microbiome），分別為Russula，Chrysosporium，Mortierella，F(xiàn)usarium，Trichoderma，Aspergillus，Thielavia，Chaetomium，Stachybotrys，Saitozyma，Co?niochaeta，Tuber，Geminibasidium，Trechispora，Podos?pora，Alternaria（這些為核心菌群）。其中絕對優(yōu)勢真菌屬為紅菇屬Russula，占比83%；其次是金孢菌屬Chrysosporium，占比2.3%，是除紅菇屬外的優(yōu)勢真菌屬（圖1）。

2.2.2 細(xì)菌核心菌群及優(yōu)勢種群分析

紅色紅菇子實體細(xì)菌種類按0.5%的閾值已鑒定3門，6綱，11目，20科，104屬。Venns分析核心菌群，在細(xì)菌種水平上3個子實體樣本有11個共有種（Core microbiome），分別為Duganella，Pseudomo?nas，Luteibacter，Stenotrophomonas，Pandoraea，Burk?holderia-Paraburkholderia，Mucilaginibacter，Rhizobi?um，Variovorax，Dyella，Acidibacter。另外占比前20的細(xì)菌屬進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)3個子實體樣本有7個共有屬：Duganella，Pseudomonas，Luteibacter，Burkhold?eria-Paraburkholderia，Mucilaginibacter，Rhizobium，Dyella（這些屬為優(yōu)勢屬）。其中杜檊氏屬Duganella和假單胞菌屬Pseudomonas為絕對優(yōu)勢屬，占比分別達(dá)32%和20%（圖2）。

圖2 紅色紅菇子實體分離培養(yǎng)的前20種細(xì)菌屬組成

2.3 紅色紅菇子實體微生物菌群之間的互作分析

2.3.1 真菌菌群之間的互作分析

OTU_1，OTU_2，OTU_3是紅色紅菇。表2中紅色紅菇OUT_1與OUT_6、OTU_13（g_Chrysosporium；s_Chrysosporium_undulatum）和OUT_2、OTU_3（Rus?sula_rosea）呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，其他均為正相關(guān)，正相關(guān)最強(qiáng)是OUT_9。紅色紅菇OUT_1與OUT_6、OUT_13（金孢屬Chrysosporium）負(fù)相關(guān)外，與其他屬均呈正相關(guān)。

表2 紅色紅菇子實體豐度前10 OTU_中真菌微生物菌群之間的相互關(guān)系

2.3.2 細(xì)菌微生物菌群之間的互作分析

OTU_2和OTU_6是紅色紅菇子實體中的優(yōu)勢細(xì)菌屬，然而這兩種優(yōu)勢細(xì)菌呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)?0.96。由表3可知，OTU_2與OTU_19、OTU_9、OTU_3、OUT_6呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，但與OUT_7正相關(guān)。OUT_6與OUT_7負(fù)相關(guān)，與OTU_19、OTU_9、OTU_3正相關(guān)?？梢娫诩t色紅菇子實體中的微生物菌群中，以Duganella為優(yōu)勢的OUT_6和OTU_19、OTU_9，OTU_3處于一種功能群；而以Enterobacteriaceae為優(yōu)勢的OTU_2、OUT_7則處于另一類功能群。

表3 紅菇子實體豐度前10 OTU中細(xì)菌微生物菌群之間的相互關(guān)系分析

2.4 紅色紅菇子實體及子實體根際土壤微生物的分離

將從子實體及根際土分離純化的微生物克隆測序的序列與NCBI數(shù)據(jù)庫比對，鑒定分離培養(yǎng)菌的種類。由表4可見，紅色紅菇子實體中分離并鑒定3株真菌，其中2株為木霉屬Trichoderma，另1株為擬盤多毛孢屬Pestalotiopsis，但是沒有分離到R.rosea。子實體根際土壤中分離并鑒定的5株真菌，其中1株只比對到目，為被孢霉目Mortierellales；另外4株鑒定到屬，分別為Aspergillusparvulus，Chaunopycnissp.，Apiotrichum porosum，被孢霉Mor?tierellalessp.。從菌根土壤中分離并鑒定出細(xì)菌2個屬，分別為Burkholderiasp.和Paraburkholderiasp.這些真菌和細(xì)菌分別為R.rosea菌根根際土壤的優(yōu)勢菌株。

表4 紅色紅菇子實體及根際土壤中分離鑒定的真菌、細(xì)菌菌株

3 小結(jié)與討論

紅菇及其共生樹紅椎CastanopsishystrixMiq.等所在生態(tài)系統(tǒng)影響著子實體與菌根，及其菌根根際土壤的微生物活動，因此，研究紅菇微生物菌群多樣性對其野生資源的保護(hù)及可持續(xù)發(fā)展具有重要現(xiàn)實意義。

首次通過高通量測序方法探討了紅色紅菇R.rosea微生物多樣性，初步了解R.rosea菌群種類組成和數(shù)量，子實體中真菌比細(xì)菌種類多。子實體真菌菌群中，絕對優(yōu)勢屬為紅菇屬Russula，優(yōu)勢種為R.rosea，其次是金孢菌屬Chrysosporium（是除紅菇屬外的另一優(yōu)勢真菌屬）；子實體細(xì)菌菌群中，Duganella和Pseudomonas為絕對優(yōu)勢屬，Burkholderia-Paraburkholderia等為優(yōu)勢屬。另外，在福建省古田縣首次發(fā)現(xiàn)了Tuber，但是在紅菇林中并沒有采集到Tuber子實體，此項工作還有待進(jìn)一步研究。在R.ro?sea菌群中，TOP10真菌OTU中，R.rosea與大部分OTU都成正相關(guān)，而與Chrysosporium_Chrysosporium呈負(fù)相關(guān)；TOP10細(xì)菌OTU中，發(fā)現(xiàn)呈拮抗作用的兩種功能群，一種以Enterobacteriaceae為代表，另一種以Duganella為代表。R.rosea微生物分析對促進(jìn)紅菇子實體形成有重要作用，也為分離這些有益微生物并施入土壤提供可能，這些都將為提高紅菇產(chǎn)量提供理論依據(jù)。

紅菇屬真菌為外生菌根真菌，分離培養(yǎng)困難，目前雖有紅菇屬分離成功的報道，但獲得真紅菇屬菌絲體的極少[5，11?12]，而且目前還無法人工栽培紅菇[13]。劉斌[11]等培養(yǎng)觀察紅菇的分離物時發(fā)現(xiàn)，紅菇菌肉的生殖菌絲是由球狀胞（孢囊狀菌絲）組成，埋在管狀聯(lián)絡(luò)菌絲中，再生能力較低，因而采用菌肉組織作為分離菌株材料成功率低。因此紅菇分離部位應(yīng)選取菌柄中間的組織塊。蔡小玲等[5]開展野生紅菇的分離培養(yǎng)試驗，采用PDA添加腐殖土培養(yǎng)基培養(yǎng)，分離培養(yǎng)正紅菇子實體組織獲得正紅菇菌絲，并用該培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)和保存。

筆者研究遺憾之處在于沒有從子實體中分離培養(yǎng)出紅菇菌株，僅培養(yǎng)出Trichoderma（木霉屬）和Pestalotiopsis（擬盤多毛孢屬）；有可能是培養(yǎng)基未添加紅菇所需的相關(guān)生長因子，即沒找到合適的培養(yǎng)基，有必要進(jìn)一步篩選合適的培養(yǎng)基。另外，從高通量測序也表明Trichoderma和Pestalotiopsis這兩種微生物是R.rosea的優(yōu)勢菌，或者它們也和白木耳的伴生菌一樣，有可能是紅菇的伴生菌，該種推測是否準(zhǔn)確還有待進(jìn)一步研究。

紅菇菌株未能成功分離，還有可能是在培養(yǎng)時紅菇菌絲生長比較慢，木霉屬和擬盤多毛孢屬這兩種真菌在現(xiàn)有的培養(yǎng)基中長勢比紅菇菌絲強(qiáng)，搶占了生長的時空生態(tài)位。因此可以考慮添加特異的抑制劑把快速生長的菌除去，生長比較慢的紅菇菌絲才有可能生長，這也有待于進(jìn)一步研究。

目前微生物菌劑備受關(guān)注，但國內(nèi)對于紅菇菌劑研究的報道很少，這可能也是國內(nèi)紅色紅菇無法仿生栽培的原因之一。黃福常等[14]發(fā)現(xiàn)紅菇可以在添加有正紅菇菌劑RL的椎苗根際土壤中繁殖；趙志鵬[15]研究21種外生菌根菌在溫濕度和寄主等不同生態(tài)條件下的耐受度以及它們之間的拮抗作用時，篩選出固體菌劑S.grevillei，從菌根土壤中培養(yǎng)出真菌Aspergillusparvulus，Chaunopycnissp.，Apiotri?chum porosum，Mortierellalessp.；菌根土壤中培養(yǎng)出細(xì)菌Burkholderiasp.，Paraburkholderiasp.，這些都是菌根土壤高通量分析出的優(yōu)勢菌。另外對菌根土壤分離并鑒定出的4個真菌和2個細(xì)菌優(yōu)勢菌株，由于培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等的限制，培養(yǎng)的菌株有限，尚待進(jìn)一步鑒定到種的水平。張彤彤等[16]報道菌根微生物影響根際土磷和鉀等礦質(zhì)元素的吸收，另外，根際土酸堿平衡發(fā)生改變，pH的變化會進(jìn)一步影響根際土微生物群落的變化，從而影響共生樹木對土壤全磷、全鉀養(yǎng)分的吸收。對這些菌應(yīng)做初步生物學(xué)測定，探索其是否促進(jìn)根系生長以及混合生長，為進(jìn)一步開發(fā)混合菌劑，測試和推廣奠定基礎(chǔ)。添加一些益生菌，可能更有利于菌根的營養(yǎng)吸收和形成，促進(jìn)紅菇產(chǎn)量，保障利用紅菇自然資源的可持續(xù)性。