李雙秋，吳迪，姜愛民，劉子儀，張 勇，謝光洪

(吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062)

肝臟是機(jī)體最大的消化腺，負(fù)責(zé)代謝和解毒，可以將毒物、藥物分解成小分子物質(zhì)以便進(jìn)一步吸收、排泄，從而保護(hù)動(dòng)物體免受毒物、藥物對(duì)的破壞。肝損傷誘發(fā)的肝臟硬化、纖維化等病理變化不僅嚴(yán)重威脅著人類健康，同時(shí)也嚴(yán)重制約著畜牧養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。我國畜禽業(yè)由于飼養(yǎng)環(huán)境不當(dāng)、飼料保管不當(dāng)，導(dǎo)致肝損傷情況持續(xù)增多，但目前又沒有準(zhǔn)確有效的防治措施，嚴(yán)重制約畜禽業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。引起肝損傷的主要原因包括細(xì)菌、霉菌、酒精、病毒和化學(xué)物質(zhì)。該病的防治不僅一直困擾著臨床醫(yī)生，而且也是獸醫(yī)畜禽養(yǎng)殖業(yè)面臨的重要課題[1-2]。脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(GalN)是構(gòu)建肝損傷模型最常用的藥物，在新型肝保護(hù)劑的研究和開發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用[3]。LPS作為革蘭陰性菌的主要成分，可引起肝損傷。由于GalN在肝臟組織中的選擇性代謝，GalN與LPS共注射小鼠體內(nèi)可明顯增加肝臟對(duì)LPS的敏感性。因此，我們建立LPS/GalN誘導(dǎo)的肝損傷模型評(píng)價(jià)藥物的應(yīng)用效果。中藥具有作用靶點(diǎn)多，毒副作用少，價(jià)格低廉，不易產(chǎn)生耐藥性，不存在獸藥殘留問題等優(yōu)點(diǎn)，常被作為添加劑添加在飼料中。杜鵑素是從杜鵑花中提取的2，3-二氫黃酮類化合物藥物，已被證明對(duì)乳腺炎、過敏性哮喘和TNBS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎癥具有顯著的治療效果。研究報(bào)告顯示杜鵑素具有抗氧化、抗炎和抗菌活性[4-6]。同時(shí)，杜鵑素可以通過上調(diào)Nrf2信號(hào)通路表達(dá)和自噬來改善APAP誘導(dǎo)的肝毒性[7]。體內(nèi)研究表明，杜鵑素對(duì)IL-1β刺激的人骨關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞具有抗炎作用[8]。然而，有關(guān)應(yīng)用杜鵑素治療雛雞肝損傷作用的研究尚未見報(bào)道。因此，本研究旨在建立LPS/GalN誘導(dǎo)雛雞肝損傷模型，評(píng)價(jià)杜鵑素對(duì)雛雞肝損傷的保護(hù)作用，并初步研究其作用機(jī)制，以期為杜鵑素的獸醫(yī)臨床應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑杜鵑素粗提物(60%)；LPS、D-氨基半乳糖、生理鹽水、甲醛、乙醇、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)試劑盒、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)試劑盒、總超氧化物歧化酶(T-SOD)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)試劑盒、TRIzol、氯仿、異丙醇、DEPC水、第1鏈cDNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒。

1.2 主要儀器DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)；VIS-7220可見光分光光度計(jì)；XD-811L半自動(dòng)生化分析儀；DK-8D水浴鍋；BIO-RAD iMARK酶標(biāo)儀；Invitrogen AME 3300電子顯微鏡；BIO-RAD CFX CONNECT熒光定量PCR儀。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物1日齡麻黃雌性雛雞35只，購自佛山市南海種雞場(chǎng)。

1.4 杜鵑素制備杜鵑素(純度60%)使用濃度梯度分別為20,40和80 mg/kg。精密稱取杜鵑素后，先溶于無水乙醇中，然后溶于生理鹽水到使用濃度。充分混勻，置4℃下保存、待用。

1.5 LPS和GalN溶劑配制把LPS和GalN分別與生理鹽水根據(jù)使用濃度混勻。置4℃下保存、待用。

1.6 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處理將35只1日齡健康麻黃雛雞平均分為空白組、LPS/GalN模型組、杜鵑素低、中、高劑量組(以下分別簡(jiǎn)稱空白組、模型組、低劑量組、中劑量組、高劑量組)。空白組和模型組灌喂相同劑量生理鹽水，低劑量組、中劑量組、高劑量組分別灌喂杜鵑素20，40和80 mg/kg(BW)。除空白組外，其他4組在第3次給藥杜鵑素1 h后連續(xù)3 d 腹腔注射LPS/GalN。各組進(jìn)行隔離飼養(yǎng)，試驗(yàn)期1周。最后一次腹腔注射LPS/GalN 24 h后，各組雛雞心臟采血致死，取肝臟凍存用于以下試驗(yàn)。

1.7 血清的制備雛雞心臟采血，3 000 r/min離心10 min，將血清分裝在 1.5 mL離心管中，置-20℃保存，待測(cè)。

1.8 肝臟組織勻漿的制備稱取凍存肝臟組織0.1 g 于2 mL離心管中，加0.9 mL生理鹽水，使用組織勻漿器磨成10%的組織勻漿，4 500 r/min離心10 min，上清移至1.5 mL離心管，置于-20℃保存。待測(cè)。

1.9 AST、ALT、T-SOD和GSH-Px酶學(xué)活力的測(cè)定AST和ALT使用收集的血清進(jìn)行微板法測(cè)定，T-SOD和GSH-Px使用制備的肝臟組織勻漿進(jìn)行分光光度計(jì)法測(cè)定，測(cè)定方法均根據(jù)試劑盒說明書要求進(jìn)行。

1.10 qRT-PCR檢測(cè)IL-1β、TNF-α、iNOS和COX2稱取凍存肝臟組織0.1 g，使用液氮研磨至粉末狀，移至1.5 mL滅RNA酶離心管中，用TRIzol試劑從肝臟中提取總RNA。反轉(zhuǎn)錄采用賽默飛公司提供的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit來進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)，用全式金TransStart?Tip Green qPCR SuperMix試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)。使用BIO-RAD CFX CONNECT熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。具體條件如下：設(shè)置溫度循環(huán)為94℃，30 s；94℃ 作用5 s、55℃作用15 s與72℃作用10 s，循環(huán)數(shù)40次。選取β-actin作為內(nèi)參，采用 2-ΔΔCt公式進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。所用引物為北京生工生物有限公司提供，用于qRT-PCR的引物序列如表1所示。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1 肉眼觀察杜鵑素對(duì)LPS/GalN刺激雛雞肝臟的影響應(yīng)用LPS 250 μg/kg和GalN 250 mg/kg腹腔注射3 d后雛雞精神狀況差，體征無明顯中毒癥狀，雛雞消瘦，與空白組相比，LPS/GalN處理組增重率明顯降低，杜鵑素預(yù)處理組增重率無明顯變化 (圖1)；最后1次給藥24 h后處死雛雞，剖檢雛雞肝臟，觀察肝臟組織病理學(xué)變化，眼觀可見，與空白組相比，LPS/GalN處理組肝臟明顯腫大、且呈土黃色，易碎，表面有不同程度壞死灶和出血點(diǎn)。與LPS/GalN處理組相比，杜鵑素預(yù)處理組，隨著濃度增加，相應(yīng)病理變化明顯減輕(圖2)?？沙醪脚袛嘣搶?shí)驗(yàn)造模成功，且杜鵑素對(duì)LPS/GalN誘導(dǎo)雛雞肝損傷具有保護(hù)作用。

圖1 雛雞日增重率

2.2 杜鵑素降低雛雞肝損傷模型血清中ALT/AST酶學(xué)活力由圖3可知，與空白對(duì)照組相比，模型組雛雞的血清中ALT/AST酶學(xué)活力顯著升高。而杜鵑素預(yù)處理組，低、中、高劑量組雛雞的ALT/AST酶學(xué)活力均顯著低于模型組，且高劑量組基本恢復(fù)到空白組水平。

2.3 杜鵑素改善雛雞肝損傷病理組織形態(tài)學(xué)變化由圖4可知，空白組肝臟結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞形狀均勻，呈索狀排列；模型組肝臟部分肝細(xì)胞核消失，胞漿內(nèi)有大量空泡，細(xì)胞間隙出現(xiàn)血細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)消失；與模型組相比，杜鵑素低劑量組肝細(xì)胞間隙血細(xì)胞減少，肝門靜脈管壁結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，胞漿內(nèi)空泡減少；杜鵑素中劑量組仍有少量肝細(xì)胞細(xì)胞核碎裂或溶解，但肝組織基本結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞間隙內(nèi)仍有少量血細(xì)胞；杜鵑素高劑量組未見明顯病理變化，肝組織結(jié)構(gòu)清晰，肝細(xì)胞分布均勻。

*.表示P<0.05;**.表示P<0.01;***.表示P<0.001

A.空白組；B.模型組；C.低劑量組；D.中劑量組；E.高劑量組

2.3 杜鵑素增強(qiáng)雛雞肝損傷模型中SOD和GSH-PX活性由圖5可知，與空白組相比，模型組肝組織中SOD和GSH-PX酶學(xué)活力顯著減低，杜鵑素預(yù)處理組與模型組相比，SOD和GSH-PX酶學(xué)活力顯著升高，且SOD高劑量組基本恢復(fù)正常，與空白對(duì)照組相比差異不顯著。

圖5 肝組織勻漿中SOD和 GSH-Px酶學(xué)活力

2.4 杜鵑素降低雛雞肝損傷模型中TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)量由圖6可知，與空白組相比，模型組肝組織中TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)量顯著升高，其余杜鵑素預(yù)處理組與模型組相比，TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)量呈劑量依賴性顯著降低。

圖6 IL-1β(左)和TNF-α(右) mRNA表達(dá)情況

2.5 杜鵑素降低雛雞肝損傷模型中iNOS和COX2 mRNA表達(dá)量由圖7可知，與空白組相比，模型組肝臟組織中iNOS和COX2 mRNA表達(dá)量顯著升高，其余杜鵑素預(yù)處理組與模型組相比，TNF-α和IL-1β mRNA表達(dá)量呈劑量依賴性顯著降低。

圖7 iNOS(左)和COX2(右) mRNA表達(dá)情況

3 討論

興安杜鵑科植物作為傳統(tǒng)中草藥已被應(yīng)用多年，人們主要用它的干燥葉子和根部來治療慢性氣管炎和支氣管炎。杜鵑素是從該植物葉子中提取出來的一種黃酮類中藥單體成分，現(xiàn)已明確其化學(xué)結(jié)構(gòu)并可以人工大量合成，目前臨床上僅作為鎮(zhèn)咳藥被廣泛使用[9]。研究表明，它還具有許多其他的生物學(xué)活性，如抗氧化、抗炎、免疫抑制等作用[10]。XIONG等[11]證明杜鵑素對(duì)小鼠T細(xì)胞具有免疫抑制作用。研究也表明杜鵑素對(duì)免疫性大鼠肝損傷具有保護(hù)作用。肝臟是機(jī)體物質(zhì)消化和代謝的重要器官，參與了機(jī)體各種物質(zhì)的代謝過程。它既是機(jī)體營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化的重要樞紐，同時(shí)也是細(xì)菌毒物進(jìn)入機(jī)體排泄和解毒的主要場(chǎng)所。肝臟發(fā)揮著舉足輕重的作用，所以也被各種細(xì)菌毒物最先侵害。大量或長期食入細(xì)菌污染食物往往會(huì)造成肝損傷，不僅影響畜禽經(jīng)濟(jì)價(jià)值，嚴(yán)重的則會(huì)引發(fā)全身臟器衰竭[12]。由于畜禽飼養(yǎng)環(huán)境受多重因素影響，常有細(xì)菌滋生，而LPS是大腸桿菌等革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，是大腸桿菌誘發(fā)肝損傷的主要毒力因子。LPS進(jìn)入肝臟后，激活機(jī)體天然免疫系統(tǒng)以Kuffer細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞開始清除LPS，清除過程中產(chǎn)生氧自由基等各種有毒介質(zhì)，在清除LPS時(shí)較高濃度的活性氧自由基 (ROS) 會(huì)造成肝臟損傷。據(jù)報(bào)道，GalN通過觸發(fā)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化。并且GalN在肝組織中的選擇性代謝，GalN與LPS共注射可明顯提高肝臟對(duì)LPS的敏感性。LPS和GalN是構(gòu)建肝損傷模型最常用的藥物，在新型肝保護(hù)劑的開發(fā)和開發(fā)中得到了廣泛的應(yīng)用[13]。而目前有關(guān)杜鵑素對(duì)LPS/GalN致雛雞肝損傷是否有防治作用，其劑量、效果如何未見報(bào)道。

前期研究發(fā)現(xiàn)，雛雞腹腔注射LPS后，肝臟出現(xiàn)了嚴(yán)重的脂肪變性，肝細(xì)胞間隙炎性細(xì)胞的數(shù)量顯著增多，主要表現(xiàn)為廣泛的炎性細(xì)胞浸潤。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)杜鵑素能改善LPS/GalN誘導(dǎo)的雛雞肝臟病理組織學(xué)損傷，肝細(xì)胞索附近炎性細(xì)胞浸潤減少甚至恢復(fù)正常。ALT/AST的滲漏是肝損傷的一個(gè)典型特征，提示肝細(xì)胞壞死和嚴(yán)重的線粒體功能障礙。當(dāng)肝細(xì)胞損傷后ALT/AST釋放入血，血清中活性升高。在本試驗(yàn)中，杜鵑素可以顯著降低LPS/GalN誘導(dǎo)肝損傷雛雞血清中ALT/AST活性，此實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了杜鵑素對(duì)肝功能的恢復(fù)作用。

LPS進(jìn)入肝臟時(shí)產(chǎn)生大量的ROS，導(dǎo)致肝臟產(chǎn)生脂肪代謝障礙，肝臟發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷和細(xì)胞變性[14-15]。杜鵑素拮抗LPS/GalN誘導(dǎo)肝損傷可能與抗氧化反應(yīng)有關(guān)。通過檢測(cè)肝組織中SOD和GSH-Px酶學(xué)活性驗(yàn)證了這一猜想。LPS/GalN抑制的抗氧化酶SOD和GSH-Px水平被杜鵑素預(yù)處理后上調(diào)。與杜鵑素對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的人內(nèi)皮細(xì)胞EA.hy926凋亡的保護(hù)作用機(jī)制一致[16]。

越來越多的證據(jù)表明炎癥細(xì)胞因子在肝損傷的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，如IL-1β和TNF-α。并且iNOS催化的NO過度分泌可加重肝臟炎癥，COX2上調(diào)是氧化應(yīng)激所致炎癥的特征[17-18]。通過RT-PCR檢測(cè)炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、iNOS和COX2。杜鵑素可以顯著的降低LPS/GalN處理后增加的TNF-α、IL-1β、iNOS和COX2 mRNA表達(dá)量。與杜鵑素通過抑制AKT和NF-κB信號(hào)通路的激活來保護(hù)LPS誘導(dǎo)的帕金森病大鼠模型的效果一致[19]。

綜上結(jié)果表明，杜鵑素預(yù)處理后肝臟組織結(jié)構(gòu)和肝功能指標(biāo)顯示出明顯的防治作用，其中灌胃80 mg/kg杜鵑素防治效果較好，但杜鵑素具體的保肝解毒機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。