張佳慶，楊聞翰，張 丹，侯德粉

（沈陽沈化院測試技術(shù)有限公司，沈陽 110021）

春雷霉素（Kasugamycin）是一種低毒、內(nèi)吸性殺菌劑，通過內(nèi)吸治療作用來發(fā)揮其藥效。春雷霉素的前身是一種由小金色放線菌產(chǎn)生的抗菌素[1]，最早由中國科學(xué)院微生物研究所于1964年在江西土良地區(qū)發(fā)現(xiàn)。自春雷霉素上市以來，在全世界范圍內(nèi)被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上[2]。它對稻瘟病、桃樹流膠病、穿孔病、西瓜細(xì)菌性角斑病等病害的防治具有顯著作用[3]。

春雷霉素屬于堿性物質(zhì)，其結(jié)構(gòu)特點為極性大，易溶于水，故在液相色譜行為上表現(xiàn)為色譜的保留時間短[4-5]，對于結(jié)構(gòu)相近的生產(chǎn)雜質(zhì)，很難達(dá)到理想的分離效果，從而給檢測的準(zhǔn)確度造成了影響。目前，對于春雷霉素含量測定的液相色譜分析方法，一般選擇較為復(fù)雜的流動相配制體系，通常采用一定濃度的十二烷基磺酸鈉水溶液作為基本的流動相，再配合一定比例的有機相。然而，大濃度的緩沖鹽體系對色譜柱損耗嚴(yán)重，影響色譜柱的壽命，提高了檢測成本。本研究開發(fā)了柱前衍生方法，對春雷霉素的結(jié)構(gòu)進行了衍生化，通過增加衍生基團，使春雷霉素具有良好的紫外吸收特性。通過調(diào)整春雷霉素的極性，可實現(xiàn)在乙腈-水為流動相體系下，對春雷霉素的原藥含量進行分析。此法檢測靈敏度高，重現(xiàn)性好，經(jīng)濟實用，并且可以同時實現(xiàn)對春雷霉素原藥中一般雜質(zhì)的有效分離，為春雷霉素產(chǎn)品的分析提供了一種創(chuàng)新性的思路。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Acquity-Micromass Quattro premier液質(zhì)聯(lián)用儀，美國沃特世公司；Dionex U3000高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾公司；Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），安捷倫科技（中國）有限公司；XS205DU電子天平，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；四硼酸鈉、甲醇、乙腈，以上均為色譜純，美國SIGMA ALDRICH公司；醋酸（分析純），國藥集團化學(xué)試劑有限公司；標(biāo)準(zhǔn)品春雷霉素（純度98.0%），國家農(nóng)藥質(zhì)檢中心（沈陽）；春雷霉素原藥，河北安米諾氨基酸科技股份有限公司；氯甲酸-9-芴甲酯（FMOC-Cl），北京百靈威科技有限公司。

1.2 儀器條件

色譜條件。柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：5 μL；檢測器波長：265 nm。采用梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1 流動相梯度比例

質(zhì)譜條件。離子源模式：ESI＋；電離電壓：3.5 kV；錐孔電壓40 V；氣簾氣流速：50 L/h；裂解氣流速：600 L/h；裂解氣溫度：400℃；離子源溫度：120℃；分子量采集范圍設(shè)置：100～600（m/z）。

1.3 溶液配制

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g（精確至0.000 1 g）置于燒杯中，用水溶解，稀釋并定容于50 mL容量瓶中作為標(biāo)樣母液。取1.0 mL母液置于燒杯中，再加入1 mL 125 mmol/L四硼酸鈉溶液來調(diào)節(jié)酸堿度，之后加入1.5 mL 4 g/L FMOC-Cl乙腈溶液作為衍生化試劑。將溶液放置在30℃水浴中反應(yīng)20 min，待衍生完全后，將溶液冷卻至室溫，再用甲醇-水（1∶2，V/V）稀釋并定容于10 mL容量瓶中，用0.45 μm濾膜過濾，備用。

1.3.2 試樣溶液的配制

稱取春雷霉素樣品0.05 g（精確至0.000 1 g）置于燒杯中，用水溶解，稀釋并定容于50 mL容量瓶中作為樣品母液。其余操作步驟與標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制相同。

1.4 測定

待儀器狀態(tài)穩(wěn)定后，對標(biāo)樣溶液和試樣溶液進行測定，取樣品和標(biāo)樣2針的平均峰面積進行公式的計算。

1.5 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)標(biāo)樣溶液和試樣溶液的峰面積，按式（1）計算樣品中春雷霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)w。

式中：A1、A2分別為標(biāo)樣溶液和試樣溶液中春雷霉素衍生物峰面積的平均值，mAU·min；m1、m2分別為標(biāo)樣和試樣質(zhì)量，g；P為標(biāo)樣中春雷霉素的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

對春雷霉素標(biāo)樣及其衍生物進行紫外光譜掃描（圖1）。春雷霉素未衍生化之前的最大紫外吸收峰在207 nm附近，且無其他波長的特征吸收峰，所以在對未衍生化的春雷霉素進行色譜分析時，只能選擇較低的紫外波長，此段波長的干擾較大，而經(jīng)過衍生化的春雷霉素在265 nm附近出現(xiàn)了特征的紫外吸收峰。在該波長處，樣品的靈敏度較高，無低波數(shù)的溶劑干擾，能夠滿足液相色譜紫外檢測器的分析要求，因此選擇的檢測波長為265 nm。

圖1 春雷霉素及其衍生物的紫外吸收對比圖

2.2 春雷霉素衍生物的色譜分析結(jié)果

經(jīng)過衍生反應(yīng)（圖2），向春雷霉素引入衍生化試劑氯甲酸-9-芴甲酯（FMOC-Cl）中的熒光團，從而實現(xiàn)高效液相色譜分離及測定。同時，過量的FMOC-Cl會完全水解成衍生副產(chǎn)物FMOC-OH，其與春雷霉素衍生物的結(jié)構(gòu)相似，因此具有相同的熒光激發(fā)和檢測波長。在以上色譜條件下，春雷霉素衍生物的保留時間為6.8 min；其水解衍生副產(chǎn)物FMOC-OH的保留時間為12.1 min（圖3）。

圖2 春雷霉素柱前衍生化反應(yīng)示意圖

圖3 春雷霉素衍生后的液相色譜圖

2.3 春雷霉素衍生物的質(zhì)譜分析結(jié)果

將春雷霉素標(biāo)樣溶液在質(zhì)譜條件下進行試驗，通過質(zhì)譜的斷裂機理確定衍生化試劑（FMOC-Cl）對春雷霉素的衍生位置，以及春雷霉素衍生物的結(jié)構(gòu)。春雷霉素衍生物的質(zhì)譜圖，見圖4。

圖4 春雷霉素衍生物質(zhì)譜圖

2.4 線性范圍

按照系列稀釋方法配制6個質(zhì)量濃度的春雷霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，在1.2所述色譜條件下進行測定。以質(zhì)量濃度和峰面積為橫、縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，來驗證方法的線性關(guān)系。線性方程為y=4 887.3x-29.319，相關(guān)系數(shù)（R2）為0.999 5（圖4），R2＞0.999，則春雷霉素衍生物的色譜峰面積與其質(zhì)量濃度在0.039 6～0.415 4 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，

圖5 春雷霉素衍生物標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5 精密度與回收率的測定

按試樣溶液的制備方法配制6個春雷霉素溶液。根據(jù)以上操作條件測定這6個樣品溶液中春雷霉素的含量，結(jié)果見表2。在此春雷霉素樣品中選取6個標(biāo)樣的添加水平，按本方法測定其中的春雷霉素含量，并計算添加回收率，結(jié)果見表3。從表2中可以看出，所配制的6個春雷霉素樣品中相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.4%；從表3中可以看出，計算得到的回收率為98.56%～99.31%。

表2 春雷霉素精密度試驗結(jié)果

表3 春雷霉素回收率試驗結(jié)果

2.6 春雷霉素衍生物結(jié)構(gòu)的確證

根據(jù)春雷霉素衍生物的質(zhì)譜圖（圖4），m/z 602、422、351和378為主要的質(zhì)譜峰，通過質(zhì)譜的一般斷裂機理來確證春雷霉素衍生物的具體結(jié)構(gòu)（圖6），以此驗證春雷霉素衍生物的分子量和各官能團信息。

圖6 春雷霉素衍生物質(zhì)譜斷裂機理示意圖

3 結(jié)論

本文創(chuàng)新性地建立了柱前衍生方法對春雷霉素進行液相色譜分析，使用乙腈-水的流動相體系，解決了在傳統(tǒng)的春雷霉素分析方法中需要使用緩沖鹽溶液作為流動相而導(dǎo)致的體系平衡緩慢、靈敏度低、對色譜柱損耗大以及雜質(zhì)分離不理想等問題，提高了對春雷霉素產(chǎn)品分析的簡便性及可靠性。此外，本文也通過液質(zhì)聯(lián)用方法對春雷霉素衍生物進行了結(jié)構(gòu)分析，闡明了春雷霉素柱前衍生化反應(yīng)原理，并通過春雷霉素衍生化前后紫外全波長掃描圖的對比，進一步證明了方法的科學(xué)性。本方法具有較高的精密度與準(zhǔn)確度，可快速分離及測定春雷霉素有效成分的含量，線性相關(guān)性好，可為春雷霉素產(chǎn)品的分析提供新的思路，適用于各企業(yè)及相關(guān)檢測機構(gòu)對春雷霉素產(chǎn)品質(zhì)量的監(jiān)督與把控。