王家豪 陳 晨 王冰烴 鄭大恒

(紹興文理學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 紹興 312000)

多糖(Polysaccharides)又被稱作多聚糖，是由10個(gè)或10個(gè)以上的單糖通過(guò)糖苷鍵連接而成的高分子化合物，其相對(duì)分子質(zhì)量為數(shù)萬(wàn)至數(shù)百萬(wàn)[1].多糖廣泛存在于生物體中，是生物體內(nèi)重要的生物大分子，廣泛參與細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞遷移以及細(xì)胞的信號(hào)識(shí)別和傳導(dǎo)等[2].多糖在自然界分布極廣，存在于動(dòng)物、植物及微生物體內(nèi)[3]， 具有抗氧化、 抗腫瘤等多種生物活性[4].

玫瑰茄(HibiscussabdazifaL.)又名山茄、洛神花、洛神葵，屬錦葵科木槿屬一年生藥食同源植物，玫瑰茄中含有多糖、黃酮、多酚、花色苷等多種成分[5]，具有抗炎[6]、抗高血壓、調(diào)血脂等多種藥理作用[7].多糖作為玫瑰茄中重要的生物成分，研究表明具有提高機(jī)體免疫力的功效[8]，然而關(guān)于玫瑰茄多糖是否具有抗腫瘤活性少有報(bào)道.

宮頸癌作為最為常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，其全球死亡率僅次于乳腺癌，位于全球第二.HeLa細(xì)胞作為研究宮頸癌的模式細(xì)胞，研究表明植物多糖可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡[9-10]，然而玫瑰茄多糖是否能引起HeLa細(xì)胞凋亡未見(jiàn)報(bào)道.因此，本研究選擇HeLa細(xì)胞，探究玫瑰茄多糖對(duì)其誘導(dǎo)凋亡的作用.

1 材料與方法

1.1 材料

玫瑰茄，購(gòu)自東莞市巴科醫(yī)藥科技有限公司；HeLa細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；MTT細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad生物有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒以及Western Blot試劑盒，購(gòu)自碧云天生物有限公司；Bax、Bcl-2、pro-Caspase-3、Caspase-3和二抗β-actin購(gòu)于美國(guó)BBI公司；其余試劑均為國(guó)藥集團(tuán)分析純?cè)噭?

1.2 方法

1.2.1 玫瑰茄多糖的制備與純化

采用水提醇沉法制備玫瑰茄粗多糖，具體如下：定量稱取干燥玫瑰茄粉末，置于潔凈干燥的500 mL圓底燒瓶中，按1∶25料液比，95 ℃水浴溫度，浸提3 h.冷卻后將所得水提液抽濾去除雜質(zhì)，合并上清液，減壓濃縮，將濃縮后的上清液加入燒杯中，緩慢加入95%乙醇(邊加邊用玻璃棒順時(shí)針攪拌)至乙醇的最終濃度為80%，充分?jǐn)嚢韬蠓湃? ℃冰箱靜置過(guò)夜，4 000 rpm離心10 min，收集沉淀用雙蒸水復(fù)溶后揮醇，加15%三氯乙酸除去蛋白，用0.1 M NaOH調(diào)pH 7.0后裝入透析袋，流水透析48 h，蒸餾水透析24 h，冷凍干燥后得到玫瑰茄粗多糖.將制備好的粗多糖采用DEAE-52纖維素交換樹(shù)脂法純化，以ddH2O洗脫控制流速為1 min/mL，采用硫酸-苯酚法進(jìn)行糖含量測(cè)定，收集水洗多糖組分，冷卻干燥后得到玫瑰茄純化多糖.

1.2.2 細(xì)胞的培養(yǎng)

取HeLa細(xì)胞在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當(dāng)貼壁細(xì)胞數(shù)量達(dá)到80%～90%時(shí)，無(wú)菌條件下，棄去原培養(yǎng)液，用PBS溶液清洗兩次，然后加入胰蛋白酶1 mL消化1 min棄去，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液，用移液槍吹打貼壁的細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞成為均勻的單細(xì)胞懸液后，停止吹打，將細(xì)胞懸液按1∶3比例轉(zhuǎn)移至新的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)液，放于培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.3 玫瑰茄多糖對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

取玫瑰茄多糖至離心管中，放入超凈臺(tái)，在離心管中加入不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液配置濃度為4 mg/mL的多糖溶液，上下?lián)u晃至多糖溶解，過(guò)濾至無(wú)菌，加入10%的胎牛血清，然后用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液稀釋玫瑰茄多糖至終濃度為3 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL和0.5 mg/mL.

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，制成懸液后計(jì)數(shù)，用含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105個(gè)/mL，接種于96孔板上，每孔100 μL.培養(yǎng)24 h棄去原培養(yǎng)液，分別加入100 μL含玫瑰茄多糖的培養(yǎng)液， 使玫瑰茄多糖的濃度分別為4 mg/mL、3 mg/mL、2 mg/mL、1 mg/mL、0.5 mg/mL，以不加玫瑰茄多糖的培養(yǎng)液生長(zhǎng)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照，每個(gè)組別設(shè)置5個(gè)復(fù)孔.培養(yǎng)48 h后，棄去原有培養(yǎng)液加入100 μL MTT試劑，培養(yǎng)4 h，棄去上清液，每孔加入100 μL DMSO放置搖床振蕩1 h 后，于570 nm下測(cè)定吸光度，并按公式細(xì)胞抑制率(%)=(A1-A2)/A1×100%計(jì)算其抑制率，其中，A1表示空白對(duì)照組細(xì)胞的OD值的平均值；A2表示加玫瑰茄多糖組的細(xì)胞OD值的平均值.

1.2.4 HeLa細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HeLa細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/mL接種于6孔板培養(yǎng)24 h，分別加入4 mg/mL和1 mg/mL的玫瑰茄多糖的培養(yǎng)液作為高劑量組和低劑量組，同時(shí)不添加玫瑰茄多糖的正常對(duì)照組作為空白對(duì)照，培養(yǎng)24 h，按蛋白提取試劑盒制備細(xì)胞漿蛋白，BCA試劑檢法測(cè)定蛋白濃度，采用western-blot法[11]檢測(cè)細(xì)胞漿蛋白中Bax、Bcl-2、pro-Caspase-3和Caspase-3的表達(dá)量，采用Quantity One軟件分析目標(biāo)蛋白的灰度.

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，結(jié)果均用Mean±SD表示，采用ANOVA進(jìn)行方差分析，P<0.05被認(rèn)為有顯著性差異，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果和分析

2.1 玫瑰茄多糖的制備

通過(guò)水提醇沉法和DEAE-52纖維素離子交換柱制備玫瑰茄純化多糖.采用硫酸-苯酚法測(cè)定純化后的玫瑰茄多糖，發(fā)現(xiàn)隨著洗脫時(shí)間的延長(zhǎng)，從第2管到第18管檢測(cè)到了糖的存在，并且第10管的糖含量達(dá)到峰值(如圖1)，收集了第6管到第14管的組分進(jìn)行凍干，從而獲得玫瑰茄多糖純化組分.

圖1 玫瑰茄純化多糖的洗脫曲線

2.2 玫瑰茄多糖對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

采用0.5～4 mg/mL濃度的玫瑰茄多糖作用HeLa細(xì)胞后，HeLa細(xì)胞的增殖活性降低，并且隨著多糖濃度的升高，細(xì)胞抑制率也升高，呈現(xiàn)正比例關(guān)系. 當(dāng)玫瑰茄多糖濃度為2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL時(shí)，HeLa細(xì)胞增殖活性被顯著抑制(P<0.05，P<0.01)(見(jiàn)圖2).

圖2 玫瑰茄多糖對(duì)HeLa細(xì)胞增殖的影響

2.3 玫瑰茄多糖對(duì)HeLa細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白的影響

2.3.1 玫瑰茄多糖對(duì)Bax蛋白的影響

Western Blot分析方法是一種可以檢測(cè)樣品內(nèi)蛋白含量的方法.對(duì)于HeLa細(xì)胞內(nèi)的Bax蛋白，與對(duì)照組相比，添加玫瑰茄多糖后HeLa細(xì)胞內(nèi)的Bax蛋白含量明顯增高(P<0.01)，隨著玫瑰茄多糖濃度增大，Bax蛋白含量呈現(xiàn)劑量依賴性(圖3).

圖3 玫瑰茄多糖對(duì)HeLa 細(xì)胞中Bax 蛋白的影響

2.3.2 玫瑰茄多糖對(duì)Bcl-2蛋白的影響

對(duì)于HeLa細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2蛋白，與空白對(duì)照組相比，添加玫瑰茄多糖后HeLa細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2蛋白含量降低，與低劑量組相比，高劑量組的玫瑰茄多糖更能抑制HeLa細(xì)胞內(nèi)Bcl-2蛋白的表達(dá)，與空白對(duì)照組存在顯著差異(P<0.05)(圖4).

圖4 玫瑰茄多糖對(duì)HeLa細(xì)胞中Bcl-2蛋白的影響

2.3.3 玫瑰茄多糖對(duì)Bax/Bcl-2比值的影響

Bax和Bcl-2是細(xì)胞線粒體凋亡信號(hào)通路中的重要蛋白，Bax/Bcl-2比值的細(xì)微變化決定了細(xì)胞是否發(fā)生凋亡，如圖5所示.對(duì)Bax、Bcl-2二者含量進(jìn)行比較分析.添加玫瑰茄多糖后，低劑量組與高劑量組Bax/Bcl-2比值高于空白組(P<0.01)，并且隨著玫瑰茄多糖劑量的提高，Bax/Bcl-2的比值也逐漸升高，呈現(xiàn)量效關(guān)系.

2.3.4 玫瑰茄多糖對(duì)pro-Caspase-3蛋白的影響

對(duì)于HeLa細(xì)胞內(nèi)的pro-Caspase-3蛋白，與空白對(duì)照組相比，玫瑰茄多糖作用于HeLa細(xì)胞后，HeLa細(xì)胞內(nèi)的pro-Caspase-3蛋白含量明顯降低(P<0.05，P<0.01)，隨著玫瑰茄多糖劑量的增大，pro-Caspase-3蛋白含量逐漸下降(圖6).

2.3.5 玫瑰茄多糖對(duì)Caspase-3蛋白的影響

對(duì)于Caspase-3蛋白，添加高劑量玫瑰茄多糖后HeLa細(xì)胞內(nèi)的Caspase-3蛋白含量明顯升高，與空白對(duì)照組差異顯著(P<0.05)； 與低劑量組相比，高劑量組的玫瑰茄多糖作用HeLa細(xì)胞后更促進(jìn)HeLa細(xì)胞內(nèi)Caspase-3蛋白的表達(dá)(圖7).

3 討論

研究表明多糖能刺激HeLa細(xì)胞，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡通路中的相關(guān)蛋白.細(xì)胞凋亡通路有3種途徑：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路、死亡受體通路、線粒體通路[12]，其中線粒體通路是細(xì)胞凋亡最重要的一種途徑.當(dāng)細(xì)胞受到外界應(yīng)激條件或藥物刺激后，線粒體釋放凋亡介質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡[13].Bcl-2家族存在于線粒體中，是調(diào)節(jié)線粒體凋亡途徑的關(guān)鍵因子，它們中的部分蛋白質(zhì)是抗凋亡的，如Bcl-2，其余是促凋亡的，如Bax[14]，同時(shí)細(xì)胞的命運(yùn)也由Bax/Bcl-2的比例微小的變化決定[15].外界刺激通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)傳導(dǎo)線粒體后，使Bax蛋白被活化，Bax在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)升高后會(huì)增加線粒體外膜的通透性，引起細(xì)胞內(nèi)半胱天冬氨酸酶活化從而引發(fā)促凋亡因子釋放[16]，促凋亡因子活化Caspase-9，切割pro-Caspase-3使其轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腃aspase-3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生.

本研究發(fā)現(xiàn)，4 mg/mL的玫瑰茄多糖作用于HeLa細(xì)胞，細(xì)胞中Bcl-2蛋白含量顯著降低(P<0.01)，Bax蛋白含量顯著升高(P<0.01)，這說(shuō)明玫瑰茄多糖能夠刺激HeLa細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白含量升高，Bcl-2蛋白含量降低.Bcl-2是抗凋亡成員，Bax則是具有代表性的促凋亡成員[17].Bax蛋白量升高，Bcl-2蛋白量降低，說(shuō)明細(xì)胞線粒體凋亡通路被啟動(dòng)，同時(shí)Bax/BcL-2的比值升高，這說(shuō)明玫瑰茄多糖可促進(jìn)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡.

Caspase的活化是一種級(jí)聯(lián)反應(yīng)，是按照一定順序進(jìn)行水解的復(fù)雜過(guò)程[18].Caspase-9作為體內(nèi)Caspase級(jí)聯(lián)的關(guān)鍵上游激活因子[19]，Caspase-9的前體在外來(lái)蛋白的切割下轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘腃aspase-9，然后激活pro-Caspase-3，使其變?yōu)镃aspase-3.很多研究將Caspase-3定義為細(xì)胞凋亡的執(zhí)行者，Caspase-3蛋白含量的上升，代表凋亡已經(jīng)發(fā)生[20].本研究發(fā)現(xiàn)，添加玫瑰茄多糖后，HeLa細(xì)胞內(nèi)的pro-Caspase-3蛋白含量下降，而Caspase-3蛋白含量明顯升高(P<0.05)，這說(shuō)明玫瑰茄多糖能通過(guò)級(jí)聯(lián)反應(yīng)刺激pro-Caspase-3蛋白水解，成為Caspase-3，引起HeLa細(xì)胞凋亡.

綜上所述，玫瑰茄多糖處理HeLa細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白量升高，Bal-2蛋白量降低，同時(shí)pro-Caspase-3蛋白量降低，Caspase-3蛋白量提高.這說(shuō)明玫瑰茄多糖可通過(guò)線粒體介導(dǎo)途徑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的發(fā)生.