魯瑞娟 許秋梅

(紹興文理學(xué)院 分析測試中心，浙江 紹興 312000)

復(fù)合維生素B片是一種常見的非處方藥.為復(fù)方制劑，每片含5種有效成分：3 mg維生素B1、1.5 mg維生素B2、0.2 mg維生素B6、10 mg煙酰胺以及1 mg右旋泛酸鈣.輔料為：磷酸氫鈣、玉米淀粉、羥甲淀粉鈉、糊精和硬脂酸鎂.按照衛(wèi)生部標(biāo)準(zhǔn)WS1-73(B)-89[1]，煙酰胺采用滴定法測定含量，維生素B2采用紫外分光光度法測定含量，維生素B1采用重量法測定含量.上述方法操作煩瑣，每種成分的測定方法都不相同，且未記載泛酸鈣和維生素B6的含量測定方法.

目前，測定復(fù)合維生素B片中有效成分含量的方法研究主要有高效液相色譜(HPLC)法以及毛細(xì)管電泳法.采用HPLC法[2-4]時(shí)，較少提及泛酸鈣的含量測定方法，且對(duì)待測樣品純度要求較高，僅徐碩等[5]報(bào)道了HPLC法同時(shí)測定一種5類維生素含量均為50 mg/片的進(jìn)口復(fù)合維生素B片中這5種成分含量的方法.毛細(xì)管電泳法[6-8]測定時(shí)，同樣的較少提及泛酸鈣含量的測定方法，僅胡雯雯[9]等采用高精度定量毛細(xì)管電泳法同時(shí)測定復(fù)合維生素B片中這5種維生素含量.這兩種方法準(zhǔn)確度高、結(jié)果可靠，但樣品預(yù)處理操作比較復(fù)雜，且均需提供待測物對(duì)照品.

定量核磁共振波譜(QNMR)法無須引進(jìn)任何校正因子就可以直接根據(jù)各定量峰的積分值推算所代表的自旋核的數(shù)量[10].相較于目前主流的定量方法，其樣品預(yù)處理操作簡單、無需待測物對(duì)照品、不破壞樣品且測定快速準(zhǔn)確，現(xiàn)已越來越廣泛的應(yīng)用于藥物分析領(lǐng)域[11-12].QNMR法于2010年收錄于《中華人民共和國藥典》[13].QNMR法測定復(fù)合維生素B片中有效成分含量的研究也已經(jīng)有所報(bào)道，郭強(qiáng)勝等[14]建立了用QNMR法測定復(fù)合維生素B片中4種維生素含量的方法，操作簡單，結(jié)果可靠，但維生素B6因含量低而未能檢測.EIFF等[15]用QNMR法分析水溶性和脂溶性維生素，在同步定量維生素E、B1、B3、B5以及B6時(shí)得到較好的檢測結(jié)果，但未對(duì)維生素B2進(jìn)行同步定量分析.兩者均未涉及復(fù)合維生素B片中所有有效成分的同步測定，本文在他人工作的基礎(chǔ)上，采用QNMR法，設(shè)計(jì)合適的預(yù)處理過程，優(yōu)化采樣參數(shù)，有效控制分離所有有效成分，解決含量差異帶來的檢測困難，建立了一種簡單、快速且無需對(duì)照品的同時(shí)測定復(fù)合維生素B片中5種維生素含量的方法.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器

400 MHz核磁共振波譜儀(AVANCE Ⅲ，瑞士Bruker公司)；百萬分之一天平(CPA2P，德國Sartorius公司)；高速離心機(jī)(LG10-2.4A，北京京立離心機(jī)有限公司)；超聲波清洗器(SK3210HP，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司).

1.2 試樣和試劑

復(fù)合維生素B片購于本地藥房；順丁烯二酸(阿拉丁試劑有限公司，經(jīng)重結(jié)晶處理，用鄰苯二甲酸氫鉀標(biāo)定后含量為98.78%)；鄰苯二甲酸氫鉀(阿拉丁試劑有限公司，核磁定量標(biāo)準(zhǔn)，批號(hào)：P112254)；氘代二甲基亞砜、重水(百靈威試劑有限公司)；維生素B1標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100390-201806)，維生素B2標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100369-201504)，維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100116-201906)，泛酸鈣標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100370-201903)，煙酰胺標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100115-201604).

1.3 供試品溶液配制

取復(fù)合維生素B片10粒，用研缽磨成粉末，精確稱取適量該粉末，與精確稱重的內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸一起置于5 mL圓底樣品管中，加入DMSO-d6(氘代二甲基亞砜)0.55 mL，保持20 ℃在超聲波清洗器中溶解10 min，使其充分溶解，轉(zhuǎn)速8 000 rpm離心1 min，將上清液移入Φ5 mm核磁管，加入適量D2O(重水)搖勻靜置10 min后，進(jìn)行核磁共振定量測定.

1.4 核磁共振譜儀的調(diào)節(jié)

將待測樣放入核磁共振波譜儀中，調(diào)整儀器參數(shù)：脈沖序列：zg30，譜寬SW：20.55 ppm；采樣時(shí)間AQ：3.98 s；采樣溫度T：298 K.仔細(xì)勻場后采樣，獲得1H-NMR譜.再進(jìn)行細(xì)致認(rèn)真的相位校正，對(duì)5種有效成分和內(nèi)標(biāo)物的定量峰逐一進(jìn)行積分.每次測定積分至少重復(fù)5次，結(jié)果取平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 定量峰的選擇

復(fù)合維生素B片的1H-NMR譜圖如圖1所示，δ6.05為內(nèi)標(biāo)物順丁烯二酸的譜峰.

圖1 復(fù)合維生素B片的1H-NMR譜圖

通過比較在相同條件下單一維生素片的1H-NMR譜圖，排除多峰疊加的干擾信號(hào)，選擇可用于定量分析的NMR譜峰位置見表1.

表1 復(fù)合維生素B片中5種有效成分與內(nèi)標(biāo)NMR定量峰的選擇

樣品中5種有效成分的定量峰除表1所示位置外，部分活潑氫受重水交換影響已經(jīng)不可用于定量研究.維生素B1分離良好且非活潑氫的吸收峰在δ8.09處，其附近沒有其他峰的干擾，故選為定量峰.維生素B2與泛酸鈣情況相似，自身的兩個(gè)等質(zhì)子數(shù)峰相距較近，其中一個(gè)峰存在信號(hào)干擾，兩者都選取沒有干擾的峰進(jìn)行定量.煙酰胺δ9.03，δ8.72處兩峰的積分面積值相近，且都沒有干擾信號(hào)，考慮到δ8.72峰離內(nèi)標(biāo)峰δ6.05更近，可避免射頻場不同造成峰強(qiáng)差異的誤差，故選擇該峰作為定量峰.維生素B6含量比其他4種有效成分低一個(gè)數(shù)量級(jí)，本實(shí)驗(yàn)中，通過控制重水添加量，改變初始的干擾信號(hào)位置，得到分離度較好的δ4.52處定量峰；通過控制樣品溶解量，使信噪比N/S>150，達(dá)到檢測要求；通過增加掃面次數(shù)，使其重復(fù)測定峰面積的相對(duì)偏差(RDS)都小于3%，擁有較好的穩(wěn)定性.從而實(shí)現(xiàn)了5種有效成分含量的同時(shí)測量.

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的確定

2.2.1 維生素B片溶解量的確定

取復(fù)合維生素B片10粒在研缽中磨成粉末.分別精確稱取20 mg、30 mg、40 mg、50 mg、60 mg、70 mg復(fù)合維生素B粉末，置于5 mL圓底樣品管中，加入DMSO-d6 0.55 mL，保持20 ℃在超聲波清洗器中振動(dòng)溶解10 min，使其充分溶解，轉(zhuǎn)速8 000 rpm離心1 min，取上清液加入核磁管中，進(jìn)行核磁共振定量測定.

以溶劑DMSO-d6中內(nèi)含的0.03%的TMS為基準(zhǔn)，標(biāo)定積分面積，樣品加入量與積分面積呈良好的線性關(guān)系.考慮到信噪比須大于150，且節(jié)省物料，因此取維生素B的加入量為50 mg.

2.2.2 重水交換中重水加入量的確定

首先要求學(xué)生查找相關(guān)資料，對(duì)該話題有一定的了解。眾所周知，日本最初沒有書面文字，是從中國的隋朝開始派遣隋使來到中國學(xué)習(xí)先進(jìn)的知識(shí)和文化，把中國的文字引進(jìn)日本?？梢哉f日語的文字最初是完全借鑒中文，只是后來為了方便民眾接受教育才又在漢字的基礎(chǔ)上創(chuàng)造了平假名和片假名。漢字為日本后來的發(fā)展起到了卓越的貢獻(xiàn)。讓學(xué)生了解到這一點(diǎn)更加能夠使學(xué)生對(duì)漢字的優(yōu)美和歷史地位感到自豪。

以上述加入50 mg復(fù)合維生素B粉末的樣品為研究對(duì)象， 分別加入5 μL，10 μL，20 μL，30 μL，50 μL重水，得到的譜圖如圖2所示.隨著重水交換量的不斷增加，煙酰胺(δ8.72)以及泛酸鈣(δ0.80)的定量峰基本不受影響，維生素B1(δ8.09)和維生素B6(δ4.52)的定量峰隨著交換量的增加分離度變好，維生素B2(δ7.94)定量峰隨著交換量的增加分離度變差.綜合考慮各定量峰的分離度，取重水的加入量為20 μL.

圖2 復(fù)合維生素B片加入不同重水量的1H-NMR譜圖

2.3 核磁測試條件的選擇

得到的1H-NMR譜圖中的峰面積受多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)參數(shù)影響，張友杰等[16]研究了峰面積與脈沖延遲時(shí)間、取數(shù)時(shí)間、采樣次數(shù)、脈沖寬度和發(fā)射偏置等因素的關(guān)系，結(jié)果表明對(duì)于不同的檢測試樣，脈沖延遲時(shí)間和采樣次數(shù)對(duì)峰面積的影響較大，其他參數(shù)的儀器默認(rèn)值正好處于其建議范圍之內(nèi)，故分別研究了延遲時(shí)間和采樣次數(shù)對(duì)復(fù)合維生素B片中各個(gè)特征峰峰面積所帶來的影響.為了便于計(jì)算，本文將δ6.05處內(nèi)標(biāo)順丁烯二酸的峰面積設(shè)置為10.

2.3.1 延遲時(shí)間對(duì)積分面積的影響

設(shè)置核磁共振掃描次數(shù)：NS=16(常規(guī)測試默認(rèn)值)，其他參數(shù)同2.3(見表2).

表2 延遲時(shí)間對(duì)復(fù)合維生素B片各峰相對(duì)面積的影響

由表2可見，延遲時(shí)間較短時(shí)，峰面積變化明顯，當(dāng)延遲時(shí)間d1≥10 s時(shí)，各定量峰峰面積變化趨于穩(wěn)定，為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高檢測效率，本實(shí)驗(yàn)選取d1=10 s.

2.3.2 采樣次數(shù)對(duì)積分面積的影響

設(shè)置核磁共振脈沖延遲時(shí)間：d1=10 s，其他參數(shù)同2.3(見表3).

表3 采樣次數(shù)對(duì)復(fù)合維生素B片各峰相對(duì)面積的影響

由表3數(shù)據(jù)可以看出，采樣次數(shù)少，數(shù)據(jù)的重現(xiàn)性會(huì)比較差，在ns ≥64次后，各定量峰面積的變化趨于穩(wěn)定，因此，為了節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高檢測效率，本實(shí)驗(yàn)選取NS=64次.

2.4 復(fù)合維生素B片中5種維生素含量的測定

取待測復(fù)合維生素B片與內(nèi)標(biāo)順丁烯二酸適量，按1.3節(jié)的方法得到待檢溶液并放在核磁管中，避光室溫保存.在5天時(shí)間內(nèi)，每天按照2.1節(jié)的方法進(jìn)行QNMR檢測，測得復(fù)合維生素B片中5種有效成分的相對(duì)定量峰積分面積，如表4所示.

表4 存放時(shí)間對(duì)復(fù)合維生素B片各峰相對(duì)面積的影響

結(jié)果顯示，在4天時(shí)間內(nèi)得到的數(shù)據(jù)較為穩(wěn)定，第5天測得的數(shù)據(jù)波動(dòng)較大.說明復(fù)合維生素B片與內(nèi)標(biāo)順丁烯二酸的DMSO-d6(含少量D2O)溶液在4天內(nèi)于遮光的核磁管中具有很好的穩(wěn)定性.這也說明本方法在同時(shí)測定維生素B片中的5種有效成分時(shí)具有很好的重現(xiàn)性.

2.4.2 含量測定

由1H-NMR譜圖中得到樣品定量峰和內(nèi)標(biāo)定量峰積分面積，并使用下面的公式計(jì)算樣品的含量(Vt)：

(1)

其中，E表示當(dāng)量(分子量/定量峰對(duì)應(yīng)的質(zhì)子數(shù))；A表示峰面積；W表示稱樣量；下角標(biāo)S表示內(nèi)標(biāo)物；下角標(biāo)X表示樣品.其中內(nèi)標(biāo)順丁烯二酸的當(dāng)量ES為58.04，峰面積AS都設(shè)為10，結(jié)果見表5.

由表5可以看到5份樣品中含量處于中間值的維生素B1、B2以及泛酸鈣的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%，而含量最多的煙酰胺與含量最少的維生素B6穩(wěn)定性略差，但其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于5%，依舊符合定量檢測的要求，結(jié)果穩(wěn)定、可靠.所測復(fù)合維生素B的平均片重為77.07 mg，根據(jù)平均百分含量得到平均每片含維生素B1為2.96 mg、維生素B2為1.42 mg、煙酰胺為9.39 mg、泛酸鈣為0.96 mg以及維生素B6為0.21 mg，測定值在藥典規(guī)定的標(biāo)示范圍(90.0%～110.0%)內(nèi).

2.5 回收實(shí)驗(yàn)

在樣品編號(hào)為1-5號(hào)樣品的核磁管中分別加入維生素B1、維生素B2、 煙酰胺、 泛酸鈣以及維生素B6標(biāo)準(zhǔn)品，超聲振蕩，溶解完全后，在相同條件下測定核磁共振氫譜，計(jì)算樣品回收率，結(jié)果如表6所示.

表5 復(fù)合維生素B片中5種維生素的含量測定

表6 復(fù)合維生素B片中5種維生素的回收率測試

結(jié)果顯示，5種維生素B1、維生素B2、煙酰胺、泛酸鈣以及維生素B6的平均回收率均接近100%，且重現(xiàn)性良好，表明該方法準(zhǔn)確度高、結(jié)果可靠.

3 結(jié)論

通過改進(jìn)前處理方法、優(yōu)化儀器參數(shù)，建立了同時(shí)測定復(fù)合維生素B片中所有有效成分的QNMR檢測方法，其結(jié)果與樣品的標(biāo)示量基本吻合，測試結(jié)果的穩(wěn)定性也比較好.通過對(duì)維生素B樣品中的5種有效成分分別進(jìn)行加標(biāo)回收率測試，表明該檢測方法的測試結(jié)果具有較好的精確度.由于復(fù)合樣品中煙酰胺與維生素B6含量分別處于最大值與最小值，使得檢測結(jié)果穩(wěn)定性略差，但是相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差仍小于5%，依舊可以滿足測試要求.因此該分析方法適用于復(fù)合維生素B片中所有有效成分的同時(shí)測定.本法操作簡單，結(jié)果可靠.