姚曉慧，陳紹占，劉麗萍，劉 洋，李乾玉

(1.北京市疾病預(yù)防控制中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100013；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，北京 100069)

硒是人體必需的微量元素之一。Rotruck等[1]發(fā)現(xiàn)硒是谷胱甘肽過(guò)氧化酶(GSHPx)的必要成分，也是動(dòng)物體內(nèi)許多蛋白質(zhì)的組成成分。硒能清除體內(nèi)有害自由基，保護(hù)身體各器官。硒攝入不足會(huì)導(dǎo)致克山病、大骨節(jié)病、癌癥、心血管疾病、免疫系統(tǒng)疾病等多種病癥[2]，攝入過(guò)量則可導(dǎo)致硒中毒，對(duì)人體健康造成危害。體內(nèi)各種硒化物不同的遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律和生物活性不僅取決于硒總量，而且與硒的化學(xué)形態(tài)和濃度水平直接相關(guān)[3-4]。研究表明[5]，不同形態(tài)的含硒化合物對(duì)人體的健康狀況具有重要的指示作用，分析生物樣品中硒形態(tài)對(duì)有效評(píng)估硒的營(yíng)養(yǎng)作用具有重要意義。血清對(duì)經(jīng)飲食攝入的硒水平變化敏感，是評(píng)估人體硒水平應(yīng)用最多的生物指標(biāo)之一[6-8]。

目前硒形態(tài)的分離檢測(cè)技術(shù)主要有液相色譜-原子熒光光譜(LC-AFS)法、體積排阻色譜(SEC-HPLC)法、高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜(HPLC-ICP-MS)法等，其中HPLC-ICP-MS因靈敏度高、線性范圍寬、分析速度快，已成為應(yīng)用最廣泛的硒形態(tài)分析技術(shù)。胡良等[9]采用HPLC-ICP-MS法測(cè)定血清中4種硒形態(tài)，樣品經(jīng)直接稀釋后超濾離心，僅檢出亞硒酸鹽Se(Ⅳ)。Yu等[10]采用截留分子質(zhì)量為3 ku的離心濃縮裝置離心過(guò)濾去除血清中大分子蛋白后，采用HPLC-ICP-MS法分析測(cè)定，發(fā)現(xiàn)血清中主要為無(wú)機(jī)硒。

為更全面地探究經(jīng)飲食途徑進(jìn)入體內(nèi)硒的水平及形態(tài)，本研究擬采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析人血清中硒酸鹽(Se(Ⅵ))、亞硒酸鹽(Se(Ⅳ))、硒代胱氨酸(SeCys2)、甲基硒代半胱氨酸(MeSeCys)、硒代蛋氨酸(SeMet)等5種硒形態(tài)，希望為硒與人體健康的研究提供支持。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

1260型高效液相色譜儀、7700x型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；Milliplus 2150超純水處理系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品；超聲波清洗機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

檸檬酸、己烷磺酸鈉、氨水：優(yōu)級(jí)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；甲醇(HPLC級(jí))、蛋白酶XIV：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；亞硒酸根離子溶液(GBW10032)、硒酸根離子溶液(GBW10033)、甲基硒代半胱氨酸(GBW10088)、硒代蛋氨酸(GBW10034)、硒代胱氨酸(GBW10087)：購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；超純水(電阻率18.2 MΩ·cm)：由超純水處理系統(tǒng)制備。

1.3 樣品前處理

血清樣品：A為正常人血清，B為去除大分子蛋白后的人血清(經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾的人血清)。

直接稀釋法：取0.5 mL血清樣品于15 mL離心管中，加入1 mL超純水稀釋，混勻，以9 000 r/min離心10 min，過(guò)0.22 μm水系濾膜，同時(shí)做空白對(duì)照。

超聲酶解法：取0.5 mL血清樣品于15 mL離心管中，加入1 mL超純水稀釋，然后加入10 mg蛋白酶XIV渦旋混勻后于37 ℃加熱超聲2 h，以9 000 r/min離心10 min，過(guò)0.22 μm水系濾膜，同時(shí)做空白對(duì)照。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；流動(dòng)相：10 mmol/L檸檬酸和5 mmol/L己烷磺酸鈉(含1%甲醇，pH 4.0)；流速0.8 mL/min；進(jìn)樣量20 μL。

1.4.2質(zhì)譜條件 射頻功率1 550 W；載氣為高純氬氣，流速0.65 L/min；補(bǔ)償氣流速0.45 L/min；射頻電壓1.80 V；采樣深度8.0 mm；泵速0.3 r/s。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)分別采用直接稀釋法和超聲水浴酶解法分析人血清樣品，結(jié)果列于表1。對(duì)同一血清樣品，直接稀釋法僅能檢出低含量的Se(Ⅳ)；而采用蛋白酶XIV進(jìn)行超聲水浴酶解法處理樣品可以檢測(cè)出3種硒形態(tài)，但隨著蛋白酶加入量的增加，各硒形態(tài)的濃度并未顯著增加，且SeMet的含量略有降低。由于蛋白酶XIV價(jià)格較高，本研究選擇蛋白酶加入量10 mg。

表1 2種前處理方法對(duì)血清中硒形態(tài)分析結(jié)果的比較Table 1 Comparison of two pretreatment methods for speciation analysis of selenium in serum

2.2 色譜條件的優(yōu)化

2.2.1流動(dòng)相優(yōu)化 借鑒文獻(xiàn)[11]，以檸檬酸為流動(dòng)相，5 mmol/L己烷磺酸鈉為離子對(duì)試劑，考察10、15、20、25 mmol/L檸檬酸對(duì)硒形態(tài)分離和靈敏度的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著檸檬酸濃度的增加，5種硒形態(tài)的保留時(shí)間以及峰高和峰面積變化不大，但分離度越來(lái)越差。因此，選擇檸檬酸濃度為10 mmol/L。

流動(dòng)相pH值是影響硒形態(tài)分離的主要因素，本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相pH 2.0～5.5時(shí)對(duì)5種硒形態(tài)分離情況的影響，示于圖1。結(jié)果表明，當(dāng)10 mmol/L檸檬酸-5 mmol/L己烷磺酸鈉流動(dòng)相的pH值為2.0時(shí)，5種硒形態(tài)的分離時(shí)間長(zhǎng)達(dá)20 min；隨流動(dòng)相pH值的增大，SeMet的保留時(shí)間縮短，但對(duì)Se(Ⅵ)和Se(Ⅳ)的分離效果有明顯影響；當(dāng)pH為4.0時(shí)，5種硒形態(tài)的分離效果最好，無(wú)衍生峰，且靈敏度最佳；當(dāng)pH>5.0時(shí)，Se(Ⅵ)和Se(Ⅳ)不能有效分離，且出現(xiàn)1個(gè)衍生峰。因此，選擇流動(dòng)相pH 4.0。

圖1 流動(dòng)相pH 2(a)和pH 4(b)的分離色譜圖Fig.1 Chromatograms of mobile phases of pH 2 (a) and pH 4 (b)

2.2.2甲醇濃度對(duì)信號(hào)強(qiáng)度的影響 甲醇作為增敏劑被廣泛應(yīng)用于HPLC-ICP-MS檢測(cè)中，本研究考察了在流動(dòng)相中加入0%～5%不同濃度甲醇對(duì)硒形態(tài)信號(hào)強(qiáng)度的影響，趨勢(shì)圖示于圖2。結(jié)果表明，向流動(dòng)相中加入甲醇對(duì)5種硒形態(tài)具有明顯的增敏效果，當(dāng)加入1%甲醇后，5種硒形態(tài)的信號(hào)強(qiáng)度均比無(wú)甲醇時(shí)增加1倍；隨著甲醇濃度的增加，增敏效果進(jìn)入平臺(tái)期，且在甲醇濃度大于2%時(shí)，信號(hào)強(qiáng)度有所下降。由于過(guò)量的甲醇會(huì)富集在ICP-MS進(jìn)樣錐上沉積為碳，影響測(cè)定結(jié)果，因此選擇1%甲醇為增敏劑。

圖2 流動(dòng)相中甲醇濃度對(duì)5種硒形態(tài)信號(hào)強(qiáng)度的影響Fig.2 Effect of methanol concentration in mobile phases on signal intensity of five selenium compounds

2.2.3樣品進(jìn)樣量?jī)?yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了20、25、50、100 μL樣品進(jìn)樣量對(duì)5種硒形態(tài)信號(hào)的影響。結(jié)果表明，隨著進(jìn)樣量的增大，5種硒形態(tài)的峰高及峰面積都逐漸增大，但Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)分離效果逐漸變差。綜合考慮，選擇進(jìn)樣量為20 μL。

2.2.4流速優(yōu)化 本實(shí)驗(yàn)考察了0.6、0.8、1.0、1.2、1.5 mL/min流速對(duì)5種硒形態(tài)分離效果的影響。結(jié)果表明，隨著流速的不斷增大，硒形態(tài)的保留時(shí)間逐漸縮短，造成Se(Ⅳ)和Se(Ⅵ)分離效果變差；當(dāng)流速為0.8 mL/min時(shí)，各硒形態(tài)分離效果最佳，示于圖3。綜合考慮分離度、保留時(shí)間等因素，選擇流動(dòng)相的流速為0.8 mL/min。

2.3 線性范圍和檢出限

分別配制0.0、0.5、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0和100.0 μg/L的Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、SeCys2、MeSeCys和SeMet 5種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下考察線性范圍。結(jié)果表明，在0.0～100.0 μg/L范圍內(nèi)，5種硒形態(tài)的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r)均大于0.999，色譜分離圖示于圖4。采用逐級(jí)稀釋法測(cè)定方法檢出限和定量限，以3倍信噪比(S/N)對(duì)應(yīng)的濃度為檢出限，10倍S/N對(duì)應(yīng)濃度為定量限，結(jié)果列于表2。

表2 線性方程、檢出限及定量限Table 2 Linear equation,LODs and LOQs

注：a.0.6 mL/min;b.0.8 mL/min;c.1.5 mL/min圖3 不同流速下5種硒形態(tài)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of five selenium compounds under different flow speeds

圖4 5種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(10 μg/L)Fig.4 Chromatogram of standard solution of five selenium forms (10 μg/L)

2.4 方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性

2.4.1樣品加標(biāo)回收率及精密度 選取血清樣品A和B各1份，添加5.0、10.0、30.0 μg/L 3個(gè)不同濃度水平的5種硒形態(tài)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收和精密度實(shí)驗(yàn)，以考察方法的準(zhǔn)確性和重復(fù)性，結(jié)果列于表3和表4。結(jié)果表明，血清A中，Se(Ⅳ)的加標(biāo)回收率在35.1%～39.3%之間，SeCys2的加標(biāo)回收率在57.7%～66.0%之間，其余3種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率在90.8%～100.0%之間；血清B中，SeCys2的加標(biāo)回收率在69.5%～72.5%之間，其余4種硒形態(tài)的加標(biāo)回收率在87.9%～110.3%之間；血清A和B硒形態(tài)的RSD均小于5%。添加濃度和本底的血清硒形態(tài)色譜圖示于圖5。

表3 血清A精密度及加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)Table 3 Determination results of precision and spiked recovery of serum A (n=6)

表4 血清B精密度及加標(biāo)回收率測(cè)定結(jié)果(n=6)Table 4 Determination results of precision and spiked recovery of serum B (n=6)

為分析Se(Ⅳ)加標(biāo)回收率較低的原因，取血清A過(guò)濾后的濾膜加酸進(jìn)行消解，采用ICP-MS測(cè)定硒含量，未檢出硒，表明加標(biāo)的硒在過(guò)濾過(guò)程中沒(méi)有損失，推測(cè)可能為加入的Se(Ⅳ)與血清樣品中的蛋白結(jié)合所致。

2.4.2實(shí)際樣品精密度 選取1個(gè)硒含量較高的正常血清樣品，制備6個(gè)平行樣品，測(cè)定硒形態(tài)的含量，并計(jì)算其RSD。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，血清樣品中各硒形態(tài)含量測(cè)定值的RSD值均小于5%，結(jié)果列于表5。

表5 血清樣品精密度測(cè)定結(jié)果(n=6)Table 5 Precision measurement results of serum samples (n=6)

2.5 樣品分析

采用本方法測(cè)定30例正常人的血清樣品，結(jié)果表明，人血清中主要硒形態(tài)為SeCys2，其質(zhì)量濃度范圍在16.2～29.3 μg/L之間；其次為SeMet，其質(zhì)量濃度范圍在6.2～16.3 μg/L之間；另有少量的Se(Ⅵ)、Se(Ⅳ)、MeSeCys及未知硒化合物，色譜圖示于圖6。

注：a.正常血清;b.去除大分子蛋白血清圖5 血清硒形態(tài)色譜圖Fig.5 Chromatograms of serum selenium speciation

圖6 血清1(a)和2(b)的色譜圖Fig.6 Chromatograms of serum 1 (a) and 2 (b)

3 結(jié)論

本研究采用高效液相色譜-電感耦合等離子體質(zhì)譜法分析人血清中的5種硒形態(tài)，比較了直接稀釋法與超聲水浴酶解法的提取效率，并優(yōu)化了色譜分離條件。3個(gè)不同濃度水平的5種硒形態(tài)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)表明，血清中Se(Ⅵ)、MeSeCys、SeMet的加標(biāo)回收率均在88.3%～110.3%之間。Se(Ⅳ)在去除大分子蛋白后的人血清樣品中的加標(biāo)回收率為87.9%～88.7%，而在正常人血清樣品中加標(biāo)回收率較低，為35.1%～39.3%，推測(cè)可能是血清樣品中含有的大分子蛋白與Se(Ⅳ)結(jié)合所致。2種血清樣品中SeCys2的加標(biāo)回收率在57.7%～72.5%之間，由于SeCys2穩(wěn)定性較差，可能存在轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。以精密度考察方法的重復(fù)性，3個(gè)不同濃度水平的血清樣品中硒形態(tài)的RSD均小于5%。通過(guò)測(cè)定正常人血清樣品，發(fā)現(xiàn)人血清中硒形態(tài)主要以SeCys2為主，其次是SeMet，還存在少量的無(wú)機(jī)硒及其他未知硒化合物。