施葵 張浩

糖尿病是一種以血糖濃度升高為主要特征的代謝紊亂綜合征，治療不當(dāng)會(huì)引起一系列糖尿病慢性并發(fā)癥，危害機(jī)體心臟、大腦、腎臟等多個(gè)器官[1,2]。糖尿病腦病是公認(rèn)的一種糖尿病慢性并發(fā)癥，即由糖尿病代謝紊亂引起的中樞神經(jīng)損傷[3]。糖尿病腦病主要導(dǎo)致語言、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能障礙，臨床表現(xiàn)為短期記憶缺陷、理解能力下降、行動(dòng)遲緩等[4,5]。目前有研究報(bào)道糖尿病腦病與海馬神經(jīng)元凋亡具有密切關(guān)系[6]，因此尋找一種有效抑制海馬神經(jīng)元凋亡的藥物對(duì)于糖尿病腦病的深入研究具有重要意義。右美托咪定是一種α2-腎上腺素受體激動(dòng)劑，具有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抑制交感神經(jīng)活性等作用[7]及有神經(jīng)保護(hù)作用[8]。本文擬對(duì)右美托咪定在高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷中是否具有保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行研究，以期為臨床治療糖尿病腦病提供實(shí)驗(yàn)研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑儀器 SPF級(jí)SD大鼠乳鼠10只購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，體重5～10 g，雌雄各半，許可證號(hào)：SCXK(京)2019-0009；控制SPF屏障內(nèi)溫度20℃～25℃，濕度50%～70%。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)SD大鼠的處理符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利及倫理規(guī)范。DMEM培養(yǎng)液(31600034)、胎牛血清(FBS)(16000-044)、胰蛋白酶(25200-056)等購(gòu)自Gibco公司；CCK-8試劑盒(4020ES60)購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(PT0001)購(gòu)自北京雷根生物技術(shù)有限公司；TUNEL檢測(cè)試劑盒(C1088)、Hoechst 染色液(C1018)購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；總蛋白提取試劑盒(78510)購(gòu)自Thermo公司；GAPDH單抗(ab181602)、NeuN抗體(ab104224)、SYP抗體(ab184176)、cleaved cas-3抗體(ab13847)、Bax抗體(ab32503)、Bcl-2抗體(ab182858)、p-Akt蛋白抗體(ab38449)、Akt蛋白抗體(ab18785)、p-STAT3蛋白抗體(ab76351)、STAT3蛋白抗體(ab119352)等兔源多抗以及FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗(ab6717)和HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗(ab6721)均購(gòu)自Abcam。倒置熒光顯微鏡(Olympus IX70)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(Eppendorf centrifuge,5415R)；PCR儀(Bio-Rad,S1000)；超低溫冰箱(HISENSE)；蛋白凝膠成像儀(Thermo)；細(xì)胞恒溫CO2培養(yǎng)箱(SANYO)；其他常規(guī)儀器均由本實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 原代大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng) 脫頸處死出生24 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠，置于75%乙醇中浸泡消毒10 min，置于冰盒上操作。分層剪開頭部皮膚和顱骨，暴露雙側(cè)大腦，用眼科鑷分開大腦皮層，暴露雙側(cè)海馬組織，分離出新月形海馬組織后置于事先加入預(yù)冷PBS的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，剔除海馬組織中血管和腦膜組織后，將其剪成1 mm3的小碎塊，隨后轉(zhuǎn)移至2 ml離心管中，加入胰蛋白酶置于37℃培養(yǎng)箱中消化10 min，期間振蕩2～3次，待消化液變渾濁且不見組織塊時(shí)終止消化。168 g離心5 min，棄上清液，加入2 ml DMEM培養(yǎng)液再次離心5 min，棄上清液后用加入10%FBS及雙抗的DMEM培養(yǎng)液重懸沉淀，輕輕捶打混勻，轉(zhuǎn)移至細(xì)胞培養(yǎng)瓶中置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后更換全部培養(yǎng)液，之后每2～3天進(jìn)行半量換液培養(yǎng)。

1.3 免疫熒光試驗(yàn)鑒定海馬神經(jīng)元 待海馬神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)至第12天時(shí)，將其接種至24孔板中(孔內(nèi)提前放入爬片)培養(yǎng)24 h后對(duì)其進(jìn)行鑒定。棄掉細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS緩沖液洗滌3次，預(yù)冷的4%多聚甲醛固定30 min后，PBS緩沖液再?zèng)_洗3次，加入預(yù)冷的甲醇室溫透化10 min，PBS再?zèng)_洗3次，加入5%BSA室溫封閉45 min，棄掉封閉液，加入1∶1 000稀釋的NeuN單抗，室溫孵育1 h，回收一抗后PBS沖洗3次，加入1∶5 000 稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔熒光二抗避光孵育1 h，棄二抗，加入1∶500稀釋的鬼筆環(huán)肽，37℃孵育50 min，PBS清洗3次，加入1 μg/ml DAPI染料，避光作用15 min，棄DAPI，PBS沖洗3次，最后加入少許PBS，將爬片轉(zhuǎn)移至載玻片置于熒光顯微鏡下觀察。

1.4 CCK-8試驗(yàn) 分組及處理：制備海馬神經(jīng)元細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液隨機(jī)分為3組，參考相關(guān)文獻(xiàn)[9]分別給予100 mmol/L葡萄糖處理(高糖組,HG group)、400 μmol/L右美托咪定與100 mmol/L葡萄糖共同處理(高糖+右美托咪定組，HG+Dex group)以及不做任何處理(對(duì)照組，control group)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。分別制備各組細(xì)胞懸液并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，將細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔加100 μl，用培養(yǎng)液做10倍倍比稀釋，共設(shè)置5個(gè)細(xì)胞濃度梯度，同時(shí)每個(gè)樣本設(shè)置3個(gè)重復(fù)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中預(yù)培養(yǎng)24 h。向每孔中加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～4 h，置于酶標(biāo)儀中測(cè)定其在450 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.5 TUNEL試驗(yàn) 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。首先進(jìn)行Hoechst活細(xì)胞染色，將各組處理后的細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)，將106個(gè)細(xì)胞懸浮于1 ml含有10%FBS的培養(yǎng)液中，加入10 μl Hoechst 染色液混勻后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 min，將細(xì)胞置于冰上冷卻，4℃離心后棄上清，將細(xì)胞用培養(yǎng)液重懸接種于24孔板中(提前放入爬片)，進(jìn)行后續(xù)TUNEL染色。參照TUNEL檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行試驗(yàn)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿爬片的70%～80%后取出爬片，室溫晾干固定20 min，PBS沖洗3次，5 min/次。封閉液室溫封閉10 min，PBS洗滌3次，5 min/次。通透液室溫透化2 min，在濕盒中進(jìn)行后續(xù)標(biāo)記反應(yīng)。PBS沖洗細(xì)胞爬片并用濾紙吸干周圍洗液，每個(gè)樣本加入100 μl TdT酶反應(yīng)液，置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60 min。20×SSC溶液終止反應(yīng)，室溫靜置15 min，PBS沖洗3次，每次5 min。將爬片置于0.3%H2O2/PBS溶液中室溫封閉5 min，PBS沖洗3次。加入 Streptavidin-HRP工作液100 μl，置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育60 min，PBS沖洗3次。加入DAB顯色液，去離子水沖洗數(shù)次后用中型樹膠封片，置于熒光顯微鏡下觀察。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)mRNA表達(dá) 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種至6孔板中，細(xì)胞接種量為2.5×105個(gè)細(xì)胞。通過Trizol法提取細(xì)胞中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。以GAPDH為內(nèi)參，通過法計(jì)算海馬突觸素蛋白(SYP)mRNA相對(duì)表達(dá)量。見表1。

表1 引物序列

1.7 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 分組及處理方法同1.4，分組處理24 h后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。按照總蛋白提取試劑盒說明書操作提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，蛋白定量后渦旋混勻，置于沸水浴中煮樣10 min，存放于-80℃?zhèn)溆?。配制SDS-PAGE凝膠，電泳時(shí)濃縮膠電壓為90 V，分離膠電壓為120 V，電泳結(jié)束后采用恒流轉(zhuǎn)印，將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，轉(zhuǎn)印條件為恒流250 mA，1～2 h。轉(zhuǎn)膜后TBST洗膜3次，5%脫脂乳封閉1 h，分別加入GAPDH單抗、SYP、cleaved cas-3、Bcl-2、Bax、p-Akt、Akt、p-STAT3和STAT3的兔源多抗，稀釋倍數(shù)均為1∶1 000，室溫孵育4～6 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入1∶5 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，每次5 min。顯色液顯色，置于蛋白凝膠成像儀下分析目的蛋白的相對(duì)含量。

2 結(jié)果

2.1 海馬神經(jīng)元的鑒定 原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元采用NeuN蛋白進(jìn)行特異性標(biāo)記，免疫熒光結(jié)果顯示，NeuN蛋白主要表達(dá)在細(xì)胞核，且NeuN呈強(qiáng)陽性蛋白，表達(dá)強(qiáng)度為(93.21±3.01)%。見圖1。

圖1 免疫熒光檢測(cè)海馬神經(jīng)元中NeuN蛋白表達(dá)；A 細(xì)胞核：DAPI；B 骨架蛋白：鬼筆環(huán)肽；C NeuN蛋白；D Merge，標(biāo)尺50 μm

2.2 右美托咪定抑制高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞活力的降低 CCK-8檢測(cè)3組細(xì)胞存活率，與對(duì)照組比較，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞的存活率顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞的存活率顯著升高(P<0.05)。見表2。

表2 MTT檢測(cè)3組細(xì)胞存活率

2.3 右美托咪定抑制高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡 TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡，與對(duì)照組比較，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率顯著升高(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡率顯著降低(P<0.05)。WB檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白cleaved cas-3、Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞cleaved cas-3、Bax蛋白顯著升高,Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞cleaved cas-3、Bax蛋白顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)。見表3，圖3。

圖3 右美托咪定抑制高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡；A TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡；B WB檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表3 右美托咪定抑制高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡

2.4 右美托咪定促進(jìn)突觸素蛋白和mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組比較，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞SYP蛋白顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞SYP蛋白顯著升高(P<0.05)。qRT-PCR檢測(cè)SYP mRNA表達(dá)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞SYP mRNA顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞SYP mRNA顯著升高(P<0.05)。見圖4，表4。

圖4 右美托咪定對(duì)SYP蛋白表達(dá)的影響(WB檢測(cè)各組SYP蛋白表達(dá))

表4 右美托咪定對(duì)SYP蛋白表達(dá)的影響

2.5 右美托咪定激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號(hào)通路 與對(duì)照組比較，高糖組神經(jīng)元細(xì)胞p-Akt和p-STAT3蛋白顯著降低(P<0.05)；與高糖組比較，高糖+右美托咪定組神經(jīng)元細(xì)胞p-Akt和p-STAT3蛋白顯著升高(P<0.05)。各組Akt和STAT3蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖5，表5。

圖5 3組PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)

表5 3組PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號(hào)通路蛋白表達(dá)

3 討論

糖尿病腦病與海馬神經(jīng)元損傷密切相關(guān)，具體表現(xiàn)為高糖可導(dǎo)致機(jī)體代謝紊亂、血液黏稠度升高、血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷等[10,11]，進(jìn)而引發(fā)大腦供血不足，造成與認(rèn)知有關(guān)的大腦海馬神經(jīng)元損傷[12]。臨床上對(duì)于糖尿病腦病所引起的神經(jīng)元損傷治療大多以藥物控制為主，但目前所用的藥物存在較為嚴(yán)重的不良反應(yīng)。右美托咪定是一種主要作用于神經(jīng)系統(tǒng)的藥物，臨床上多與鎮(zhèn)靜藥物等聯(lián)合使用進(jìn)行麻醉，具有良好的抑制交感神經(jīng)活性作用[13]，且近期有研究顯示右美托咪定對(duì)神經(jīng)性疾病具有良好的治療效果[14]。本研究的免疫熒光試驗(yàn)、CCK-8、TUNEL以及WB等實(shí)驗(yàn)表明右美托咪定能有效抑制高糖誘導(dǎo)的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性降低和細(xì)胞凋亡，對(duì)于高糖誘導(dǎo)的神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用。

Cas-3蛋白是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，cleaved cas-3是其活化后被剪切產(chǎn)生的活性片段，具有蛋白水解酶的作用，能夠促使細(xì)胞凋亡[15]。Bcl-2家族在調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中具有重要作用，Bcl-2蛋白是抗凋亡基因，可降低細(xì)胞內(nèi)氧化還原電位從而抑制細(xì)胞凋亡[16]。Bax則是凋亡促進(jìn)基因，可以和Bcl-2結(jié)合形成二聚體抑制Bcl-2的抗凋亡作用[17]。本研究顯示，高糖可誘導(dǎo)cleaved cas-3和Bax表達(dá)量增加以及Bcl-2表達(dá)量減少，與高糖組比較，高糖+右美托咪定組大鼠海馬神經(jīng)元中cleaved cas-3和Bax表達(dá)量顯著降低，Bcl-2表達(dá)量顯著升高，表明在加入右美托咪后，cleaved cas-3和Bax表達(dá)被抑制，而Bcl-2表達(dá)被增強(qiáng)，即右美托咪定具有對(duì)抗高糖引起的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的作用。

SYP是主要存在于海馬神經(jīng)元突觸前膜的囊泡中的一種糖蛋白，與突觸功能和結(jié)構(gòu)密切相關(guān)[18,19]。有研究報(bào)道，SYP的表達(dá)能夠反映突觸的再生和重構(gòu)能力，神經(jīng)元損傷后導(dǎo)致突觸功能異?；騿适ВM(jìn)而引發(fā)嚴(yán)重的認(rèn)知功能障礙[20]。本研究顯示，高糖損傷的神經(jīng)元細(xì)胞中SYP表達(dá)量降低，而給予右美托咪定處理后，與高糖組比較，高糖+右美托咪定組中SYP蛋白表達(dá)量顯著增加，進(jìn)一步佐證了右美托咪定能夠抑制高糖導(dǎo)致的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元損傷。

有研究報(bào)道，某些藥物治療對(duì)腦損傷具有保護(hù)作用，而該過程是在PI3K/Akt信號(hào)通路激活的參與下完成的，其中的機(jī)制為：抑制Akt蛋白的磷酸化能夠加重神經(jīng)元損傷患者的認(rèn)知和記憶損傷，反之，促進(jìn)Akt蛋白磷酸化則能顯著抑制信號(hào)通路中Bax蛋白的表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生[21]。JAK2/STAT3信號(hào)通路是一條參與細(xì)胞增殖、凋亡和炎癥等多個(gè)生理和病理過程的重要信號(hào)通路[22]，李霞等[23]觀察STAT3被激活后能夠有效抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，當(dāng)JAK2/STAT3信號(hào)通路受到抑制且STAT3磷酸化被干擾時(shí)會(huì)加重神經(jīng)元損傷。本研究通過檢測(cè)p-Akt、p-STAT3的表達(dá)量顯示，與對(duì)照組比較，高糖組p-Akt蛋白表達(dá)減少，右美托咪定處理后p-Akt蛋白表達(dá)量顯著增加；高糖誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生損傷后，由于STAT3磷酸化被抑制而發(fā)生細(xì)胞凋亡，但當(dāng)加入右美托咪定后，p-STAT3蛋白表達(dá)量顯著增加，即右美托咪定可在一定程度上解除磷酸化抑制并發(fā)揮對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。以上結(jié)果表明，應(yīng)用右美托咪定后，PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活并增加p-Akt和p-STAT3表達(dá)量，但右美托咪定是否通過這兩條信號(hào)通路發(fā)揮保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞作用，以及這兩條信號(hào)通路的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和通路間的相互關(guān)系還需進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，右美托咪定對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元損傷具有保護(hù)作用，右美托咪定可以激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號(hào)通路，推測(cè)右美托咪定可能通過激活PI3K/Akt和JAK2/STAT3信號(hào)通路對(duì)高糖誘導(dǎo)的大鼠乳鼠海馬神經(jīng)元損傷發(fā)揮保護(hù)作用。