陳文鈞， 駱 媱， 章建華， 尹 華*

(1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥標(biāo)準(zhǔn)化研究實驗室，浙江 杭州 311402；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院，浙江 杭州 310006)

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變?yōu)楹诵?，累及骨質(zhì)并包括滑膜、關(guān)節(jié)囊及關(guān)節(jié)其他結(jié)構(gòu)的慢性炎癥[1-2]。骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)“骨痹”范疇，臨床多采用補腎活血方藥治療。淫羊藿-川芎藥對取自《太平圣惠方》中的仙靈脾散，由淫羊藿、川芎、威靈仙、肉桂、蒼耳子組成，取淫羊藿補腎陽、強筋骨之功，川芎活血行氣、祛風(fēng)止痛之效，兩藥合用可標(biāo)本兼治。中醫(yī)骨傷科臨床診治骨關(guān)節(jié)炎時，常以淫羊藿、川芎配伍使用，再隨證加減其他藥味，療效顯著。研究表明，淫羊藿苷可調(diào)控軟骨細胞代謝，促進滑膜細胞增殖，抑制MMP-13、MMP-3、IL-1β、PGE2表達，從而延緩骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)展[3-5]；川芎可改善外周血管循環(huán)，抑制血小板聚集，改善炎癥[6-7]。

本研究采用HPLC法建立22批淫羊藿-川芎藥對指紋圖譜，酶聯(lián)免疫法檢測MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平，應(yīng)用雙變量相關(guān)分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析和遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)研究其譜-效關(guān)系，初步闡明該藥對治療骨關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 儀器 Waters alliancee 2695高效液相色譜儀(美國Waters公司，配置e2695分離模塊、柱溫箱、2998PDA檢測器、Empower色譜工作站)；MettlerXS105電子天平(十萬分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；BP211D電子分析天平(德國賽多利斯公司)；Centrifuge 5804R高速冷凍離心機、手動移液器(德國Eppendorf公司)；KQ5200B型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；高速萬能粉碎機(天津市泰斯特儀器有限公司)；Biorad 680全自動酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；Ti-S正置顯微鏡(日本Nikon公司)。

1.2 試劑與藥物 淫羊藿、川芎飲片共22批，具體信息見表1～2，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室鑒定為正品，編號S1～S22。硫酸氨基葡萄糖膠囊購自永信藥品工業(yè)(昆山)股份有限公司，批號GSCyK004；塞來昔布膠囊購自美國Pfizer公司，批號W64712。綠原酸購自中國食品藥品檢定研究院，純度均>98%，批號0753-200111；阿魏酸、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、藁本內(nèi)酯對照品購自上海源葉生物科技有限公司，純度均>98%，批號B20007、B20170、B20172、B20173、B21576、B20075、B20492；洋川芎內(nèi)酯I、洋川芎內(nèi)酯A購自成都克洛瑪生物科技有限公司，純度均>98%，批號CHB180617、CHB180615。MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2試劑盒均購自江蘇酶免實業(yè)有限公司，批號MM-O11OR1、MM-0112R1、MM-0047R1、MM-20607R1、MM-0068R1。乙腈、甲醇為色譜純；其他試劑均為分析純；水為娃哈哈純凈水。

表1 淫羊藿飲片信息

表2 川芎飲片信息

1.3 動物 清潔級SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，實驗動物生產(chǎn)許可號SCXK(滬)2017-0005，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心屏障系統(tǒng)內(nèi)。

2 方法與結(jié)果

2.1 HPLC指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 按照文獻[8-9]報道，Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脫，程序見表3；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長275 nm；進樣量10 μL。

表3 梯度洗脫程序

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 供試品溶液 精密稱取淫羊藿(批號180101)、川芎(批號171201)飲片粉末各0.2 g(過40目篩)，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入80倍量50%乙醇，稱定質(zhì)量，在40 ℃下超聲處理30 min，冷卻至室溫，50%乙醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，12 000 r/min離心15 min，取上清液，即得。

2.1.2.2 對照品溶液 精密稱取綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯適量，置于10 mL量瓶中，甲醇制成質(zhì)量濃度為2.255、2.330、2.167、2.041、2.042、2.327、2.173、2.112、2.261、2.049 mg/mL的溶液，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察 以朝藿定C(11號峰)為參照峰，取同一供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定6次，測得各成分色譜峰相對保留時間RSD均<1.7%，相對峰面積均RSD<2.8%，表明儀器精密度良好。按“2.1.2.1”項下方法制備供試品溶液6份，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得各成分色譜峰相對保留時間RSD均<0.1%，相對峰面積RSD均<2.9%，表明該方法重復(fù)性良好。取同一供試品溶液，于0、2、4、8、12 h在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，測得各成分色譜峰相對保留時間RSD均<1.2%，相對峰面積RSD均<2.9%，表明溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 圖譜生成 按“2.1.2.1”項下方法制備22批藥對的供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣測定，采用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)建立指紋圖譜，共確定20個共有峰，見圖1，再采用SPSS 17.0軟件，以共有峰峰面積為變量，將22批次飲片分為7類，見圖2。最終，選取S3、S19、S12、S21進行后續(xù)藥效學(xué)研究。

注：S2為淫羊藿對照圖譜，S3為川芎對照圖譜，S4為對照品溶液。1.綠原酸 5.阿魏酸 8.洋川芎內(nèi)酯Ⅰ 9.朝藿定A 10.朝藿定B 11.朝藿定C 12.淫羊藿苷 17.寶藿苷Ⅰ 18.洋川芎內(nèi)酯A 19.藁本內(nèi)酯圖1 22批藥對HPLC指紋圖譜

圖2 22批藥對聚類分析圖

2.2 藥效學(xué)研究

2.2.1 造模與給藥 56只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，分為正常組(8只)和造模組(48只)，造模組大鼠采用切斷前交叉韌帶并損傷半月板法建立骨關(guān)節(jié)炎模型，術(shù)后每天腹腔注射青霉素40 000 U/只，連續(xù)3 d，以預(yù)防感染。

圖2顯示，22批藥對分為7類，其中S16、S11、S20這3批飲片單獨成類，樣本量較少，無可比性，故選取其他4類中的各1批。將造模組大鼠隨機分為模型組，淫羊藿-川芎藥對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組，陽性藥組，每組8只，雌雄分籠飼養(yǎng)，正常飲水?dāng)z食。

造模3 d后，淫羊藿-川芎藥對Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組大鼠分別灌胃給予2 g/mL藥液，陽性藥物組大鼠灌胃給予2 mg/mL塞來昔布、12.5 mg/mL硫酸氨基葡萄糖溶液，劑量均為1 mL/100 g；正常組、模型組大鼠灌胃給予等體積蒸餾水。

2.2.2 淫羊藿-川芎藥對對骨關(guān)節(jié)炎大鼠血漿中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平的影響 給藥8周后，大鼠禁食12 h，腹腔注射3%戊巴比妥(0.15 mL/100 g)麻醉，心臟取血，4 ℃、3 000 r/min離心20 min，分離血漿，按酶聯(lián)免疫檢測試劑盒說明書操作，檢測血漿中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平，結(jié)果見表4。由此可知，與正常組比較，模型組大鼠血漿中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平升高(P<0.01)；與模型組比較，各淫羊藿-川芎藥對組和陽性藥組大鼠血漿中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平降低(P<0.05，P<0.01)。

表4 淫羊藿-川芎藥對對大鼠血漿中MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平的影響

2.3 譜效關(guān)系研究 以20個共有峰峰面積為X，MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2水平分別為Y1、Y2、Y3、Y4、Y5，將數(shù)據(jù)進行歸一化處理后，采用雙變量相關(guān)分析、灰色關(guān)聯(lián)度分析、遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[10-13]進行分析，結(jié)果見表5。雙變量相關(guān)分析得出，1(綠原酸)、9(朝藿定A)、10(朝藿定B)、17(寶藿苷Ⅰ)號峰對抑制MMPs(MMP-13、MMP-3)水平的貢獻較大，5(阿魏酸)、10(朝藿定B)、18(洋川芎內(nèi)酯A)號峰對抑制炎性因子(IL-1β、NO、PGE2)水平的貢獻較大；灰色關(guān)聯(lián)度分析得出，2、11(朝藿定C)、12(淫羊藿苷)號峰與MMPs關(guān)聯(lián)度大于0.7，說明這3種成分對抑制MMPs表達的貢獻較大，而其他共有峰均在0.6～0.7之間；遺傳神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)分析得出，9(朝藿定A)、16、12(淫羊藿苷)、13號峰對抑制MMPs表達貢獻較大，3、6、10(朝藿定B)、15、2號峰對抑制炎性因子的表達貢獻較大。3種分析方法表明，抑制MMPs表達貢獻較大的為1(綠原酸)、2、9(朝藿定A)、10(朝藿定B)、11(朝藿定C)、12(淫羊藿苷)、13、16、17(寶藿苷Ⅰ)號峰，均為淫羊藿成分；抑制炎性因子貢獻較大的為2、3、5(阿魏酸)、6、10(朝藿定B)、15、18(洋川芎內(nèi)酯A)號峰，均為淫羊藿-川芎藥對成分。

表5 相關(guān)系數(shù)測定結(jié)果

3 討論

本研究考察提取方式(超聲、回流)、提取時間(15、30、45、60 min)、溶劑倍數(shù)(40、80、100、120、150、200倍)、浸泡時間(0、0.5、1、2 h)等，以綠原酸、阿魏酸、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、寶藿苷Ⅰ、洋川芎內(nèi)酯A、藁本內(nèi)酯10個成分的提取率、色譜峰響應(yīng)及分離情況為評價指標(biāo)，確定供試品溶液的制備方法。

骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機制有基質(zhì)金屬蛋白酶、炎性因子和一氧化氮學(xué)說等?；|(zhì)金屬蛋白酶過表達會導(dǎo)致軟骨退化，MMP-13是作用于軟骨降解的主要酶[14-15]；IL-1β是促使軟骨代謝平衡轉(zhuǎn)向分解和退化的細胞因子之一，誘導(dǎo)滑膜和軟骨產(chǎn)生MMPs等蛋白水解酶造成軟骨基質(zhì)的降解破壞；PGE2參與全身的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致軟骨下骨的吸收，影響骨與軟骨合成代謝，并通過細胞間cAMP的積累誘導(dǎo)軟骨細胞凋亡[16-17]；炎性介質(zhì)導(dǎo)致NO合成增多，導(dǎo)致滑膜、軟骨的氧化損傷。選擇MMP-13、MMP-3、IL-1β、NO、PGE2進行藥效評價，可客觀準(zhǔn)確地評價淫羊藿-川芎藥對對骨關(guān)節(jié)炎的治療作用。4批淫羊藿-川芎藥對、陽性藥給藥后，骨關(guān)節(jié)炎大鼠血漿中各指標(biāo)含量均下降，說明淫羊藿-川芎藥對對骨關(guān)節(jié)炎確切有效。

采用3種統(tǒng)計方法聯(lián)用并進行交叉驗證，結(jié)果更準(zhǔn)確。結(jié)果顯示，淫羊藿中1(綠原酸)、2、9(朝藿定A)、10(朝藿定B)、11(朝藿定C)、12(淫羊藿苷)、13、16、17(寶藿苷Ⅰ)號峰對抑制MMPs表達貢獻較大，淫羊藿-川芎藥對中2、3、5(阿魏酸)、6、10(朝藿定B)、15、18(洋川芎內(nèi)酯A)號峰抑制炎性因子貢獻較大。綜上所述，淫羊藿對抑制MMPs表達貢獻較大，而抑制炎性因子的表達是淫羊藿-川芎藥對協(xié)同作用的結(jié)果，初步闡明了淫羊藿-川芎藥對治療骨關(guān)節(jié)炎的物質(zhì)基礎(chǔ)。