張弘弛， 趙翊婷， 廉佳佩， 李 慧， 周 鳳， 劉 瑞*

(1.山西大同大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西 大同 037009；2.云南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650091)

納米銀具有廣譜的抗菌和殺菌活性，由納米銀釋放出的Ag+具有抗微生物活性[1]。研究發(fā)現(xiàn)，納米銀對多種細(xì)菌及病毒有抑制作用[2]，因優(yōu)秀的抑菌活性，其在化妝品、紡織品、食品儲藏保鮮、膳食補(bǔ)充劑、食品和醫(yī)藥包裝等領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用[2-4]。除了傳統(tǒng)的物理和化學(xué)合成納米材料的方法，近年來，利用真菌胞外生物合成納米銀被廣泛關(guān)注，此工藝有利于對合成條件的優(yōu)化，具有使用常規(guī)設(shè)備、成本低，后期不需要破碎真菌細(xì)胞等優(yōu)點(diǎn)，表現(xiàn)出工業(yè)化的潛力[5-6]。

植物內(nèi)生真菌幾乎在所有植物中都能分離得到[7]，因其與宿主植物的長期共生關(guān)系，具有更加復(fù)雜的酶體系，成為了一類特殊的納米銀合成載體。已有的內(nèi)生真菌合成納米銀研究發(fā)現(xiàn)，其合成的納米銀粒徑、大小、形狀更具有優(yōu)勢，如薛柏吉[8]通過粉節(jié)皮菌和秘魯小帚梗柱孢霉合成金屬納米銀材料；黃檗通過黑附球菌合成金屬納米銀材料[9]；曲明星等[10]利用木霉屬真菌輔助合成納米銀。毛迪等[11]利用黃芪提取物生物還原制備納米銀，但利用黃芪內(nèi)生真菌生物合成納米銀的研究未有報(bào)道?；诖?，本研究篩選出能夠產(chǎn)生納米銀的黃芪內(nèi)生真菌，為內(nèi)生真菌合成金屬納米粒子提供了技術(shù)支持，同時對納米銀的合成條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 菌株和培養(yǎng)基

1.1.1 內(nèi)生真菌 課題組前期從恒山黃芪根部分離而來38株內(nèi)生真菌[12-13]，保存于山西大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所，批號Am-R01～Am-R38。活化采用察氏固體培養(yǎng)基，發(fā)酵采用察氏液體培養(yǎng)基。

1.1.2 供試細(xì)菌 大腸桿菌(貨號CGMCC 1.12874)、銅綠假單胞菌(貨號CGMCC 1.9054)、金黃色葡萄球菌(貨號CGMCC 1.6750)、枯草芽孢桿菌(貨號CGMCC 1.9086)均由山西大同大學(xué)應(yīng)用生物技術(shù)研究所提供。活化采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，抑菌作用測定采用LB液體培養(yǎng)基。

1.2 試劑 硝酸銀、蔗糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、牛肉膏、蛋白胨均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器 SW-CJ-2F型超凈工作臺(金壇市盛威實(shí)驗(yàn)儀器廠)；GW-D-100B型振蕩培養(yǎng)箱(北京市六一儀器廠)；UV-3200S型紫外分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；HS 902720型電泳儀(美國Thermo公司)；HEAL FORCE型PCR儀(日本島津公司)；ABI 3730XL型測序儀(日本尼康公司)；MASTERSIZER 3000E型粒度分析儀(德國賀利氏公司)；HT7700型透射電子顯微鏡(日本日立公司)。

2 方法

2.1 菌株篩選

2.1.1 內(nèi)生真菌活化及1次發(fā)酵 將38株黃芪內(nèi)生真菌菌株轉(zhuǎn)接于平板上，在28 ℃下培養(yǎng)7 d，無菌狀態(tài)下取出活化的內(nèi)生真菌菌餅，按4餅/100 mL培養(yǎng)液的密度接種于滅菌的含100 mL察氏培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，振蕩搖床培養(yǎng)，設(shè)置發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速130 r/min，溫度28 ℃，時間10 d。

2.1.2 內(nèi)生真菌2次發(fā)酵 1次發(fā)酵結(jié)束后無菌過濾，菌絲體用無菌水洗滌2～3次，按接種量4 g/100 mL接種于含100 mL無菌去離子水的250 mL錐形瓶中，振蕩搖床培養(yǎng)，設(shè)置發(fā)酵條件為轉(zhuǎn)速130 r/min，溫度28 ℃，發(fā)酵24 h，結(jié)束后無菌過濾，即得發(fā)酵液。

2.1.3 合成納米粒子篩選 稱取0.17 g AgNO3固體，無菌水定容至1 000 mL，得到1 mmol/L AgNO3溶液，置于棕色試劑瓶中，在4 ℃下保存，將2次發(fā)酵液與1 mmol/L AgNO3按9∶1比例混合，在28 ℃下振蕩培養(yǎng)24 h。以未加AgNO3的真菌發(fā)酵液作為空白對照，目測反應(yīng)液顏色變化，以顏色發(fā)生明顯反差變化的反應(yīng)液為初步判斷該內(nèi)生真菌具有合成金屬納米粒子的標(biāo)志，鑒于發(fā)酵過程中生物反應(yīng)量濃度較低，為了增加篩選確定性，將反應(yīng)液濃縮5倍后以納米銀粒子的特殊吸收波長范圍(400～460 nm，特定波長420 nm)為檢測依據(jù)[14]，全波長掃描范圍300～600 nm，間隔1 nm，觀察38株內(nèi)生真菌的反應(yīng)液是否在此范圍內(nèi)出現(xiàn)吸收峰。參考文獻(xiàn)[14]報(bào)道，精確篩選出具有合成金屬納米粒子活性的內(nèi)生真菌以及活性強(qiáng)弱。

2.1.4 具有納米粒子合成活性菌株的粒度分析 取具有合成金屬納米粒子生物活性菌株的2次發(fā)酵液適量，采用粒度分析儀檢測納米銀粒徑，并進(jìn)行粒度分析。

2.2 具有金屬納米粒子合成活性內(nèi)生真菌的分子鑒定 高活性內(nèi)生真菌Am-R02經(jīng)平板培養(yǎng)后，無菌提取真菌菌塊，經(jīng)真空干燥后制備干燥的菌絲，在液氮條件下將菌絲組織塊研磨至100目粉狀，采用CTAB法來提取內(nèi)生真菌DNA，并檢測DNA純度和濃度，經(jīng)PCR反應(yīng)后，送三聯(lián)兄弟生物醫(yī)藥研究(北京)有限公司測序，獲得ITS序列在GenBank，Blast進(jìn)行比對分析，選擇相似率最高的真菌ITS序列，用MEGA軟件Clustal X方法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，采用Neighbor-Joining法，Boottrap值設(shè)置1 000構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹對內(nèi)生真菌鑒定[15]。

2.3 內(nèi)生真菌Am-R02生物合成納米銀條件優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn) 對反應(yīng)時間(1、2、4、6、8、10、12、24 h)、AgNO3濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mmol/L)、反應(yīng)溫度(24、26、28、30、32 ℃)、pH值(5.0、6.0、7.0、8.0、9.0)進(jìn)行考察。

2.3.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以AgNO3濃度(A)、反應(yīng)溫度(B)、pH值(C)為影響因素，吸光度為評價指標(biāo)，采用Design-Expert V 8.05軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 因素水平

2.4 透射電鏡分析 在馬弗爐中灼燒納米銀后，研磨再溶解于乙醇，超聲清洗器分散5 min，取10 μL制備液滴在碳支持膜銅網(wǎng)，靜置5 min，去除多余液體，滴加2%磷鎢酸于碳支持膜銅網(wǎng)靜置2 min，去除多余液體，室溫干燥后置于透射電子顯微鏡下觀察，采集圖像分析。

2.5 抑菌試驗(yàn)

2.5.1 納米銀制備 按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備Am-R02二次發(fā)酵液共3 L，按“2.3”項(xiàng)下優(yōu)化條件制備納米銀，收集反應(yīng)液，15 000 r/min離心10 min，收集沉淀，進(jìn)行冷凍干燥，即得。取適量在無菌條件下超聲分散于去離子水中，得到1.0 mg/mL溶液。

2.5.2 抑菌作用測定 采用二倍梯度稀釋法[16]測定。取1.0 mg/mL納米銀溶液100 μL至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，用LB液體培養(yǎng)基以二倍梯度稀釋法依次稀釋至0.03～500 μg/mL。將2.0×107CFU/mL細(xì)菌懸液以100 μL/孔密度接種至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，設(shè)培養(yǎng)基對照孔、菌液對照孔、陽性對照孔(氨芐西林、四環(huán)素)，微孔板加蓋，保鮮膜密封以減少孵育過程中的水分蒸發(fā)，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，在630 nm波長處測定吸光度，確定最小抑菌濃度(MIC)。

3 結(jié)果

3.1 活性菌株篩選 根據(jù)反應(yīng)液顏色變化(圖1)和全波長掃描測定結(jié)果，篩選得到具有合成納米銀活性的黃芪內(nèi)生真菌有4株，分別為Am-R02、Am-R11、Am-R16、Am-R24，見表2。在400～460 nm波長處，Am-R02、Am-R11、Am-R16、Am-R24均有最大吸收峰，在420 nm處的光密度分別為1.532 1、0.436 2、0.747 9、0.423 3，表明Am-R02合成納米銀能力最強(qiáng)，其次為Am-R16、Am-R11，Am-R24最弱。

注：左邊二次發(fā)酵液無金屬離子，右邊二次發(fā)酵液添加了金屬離子。圖1 活性菌株Am-R02顏色

3.2 粒度分析 Am-R02產(chǎn)生的納米銀粒徑分布較均勻，以0～5 nm為主，占總數(shù)的1/3，5～10、10～15、15～20 nm的粒徑均占15%；Am-R11產(chǎn)生的納米銀粒徑大多在25 nm以下，以0～5 nm為主，占總數(shù)50%以上，而5～10 nm占1/3，10～25 nm在10%以內(nèi)；Am-R16產(chǎn)生的納米銀粒徑大多在30 nm以下，以0～5 nm為主，占總數(shù)50%以上，

表2 活性菌株篩選結(jié)果

而5～10 nm占1/3，10～20 nm在20%以內(nèi)；Am-R24產(chǎn)生的納米銀粒徑大多在30 nm以下，以0～5 nm為主，占總數(shù)70%，而5～10 nm占10%，10～25 nm占20%，見圖2。

圖2 納米銀粒徑分布

3.3 Am-R02測序和進(jìn)化樹分析 Am-R02的ITS序列長度為556 bp，BLAST比對結(jié)果表明，其rDNA-ITS序列與Aspergillusparvisclerotigenus的相應(yīng)序列的同源性為100%。系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖3)顯示，該菌株與Aspergillusparvisclerotigenus聚在一支，支持率為100。最終，將Am-R02鑒定為Aspergillusparvisclerotigenus。

圖3 Am-R02系統(tǒng)發(fā)育分析

3.4 合成條件優(yōu)化

3.4.1 反應(yīng)時間 由圖4可知，反應(yīng)10 min時開始有納米銀合成，隨著時間延長逐漸增多，在12 h時吸光度最高，但之后逐漸降低，可能是因?yàn)榧{米銀開始大量分解，故選擇12 h作為反應(yīng)時間。另外，超過12 h后納米銀積累值趨于飽和，故響應(yīng)面試驗(yàn)不再將反應(yīng)時間作為影響因素。

圖4 反應(yīng)時間對合成納米銀的影響

3.4.2 AgNO3濃度 由圖5可知，不同濃度AgNO3溶液與發(fā)酵液反應(yīng)時，吸光度呈明顯差異，在2 mmol/L時最高，故選擇2 mmol/L左右作為AgNO3濃度。

圖5 AgNO3濃度對合成納米銀的影響

3.4.3 反應(yīng)溫度 由圖6可知，隨著反應(yīng)溫度增加，納米銀合成速率加快，在28 ℃時吸光度最高，故選擇28 ℃左右作為反應(yīng)溫度。

3.4.4 pH 由圖7可知，在pH為8.0時吸光度最高，即納米銀合成效率最高，而在9.0時吸光度略有下降，5.0時最低，說明在酸性條件下抑制了納米銀合成，故選擇8.0左右作為pH。另外，pH對合成納米銀的影響程度大于反應(yīng)時間、AgNO3濃度，其原因可能是pH影響了納米銀合成通路的酶活性，具體需要深入研究。

3.4.5 響應(yīng)面試驗(yàn) 以AgNO3濃度(A)，反應(yīng)溫度(B)、pH(C)為影響因素，吸光度(Y)為評價指標(biāo)，響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化合成條件，結(jié)果見表3。

表3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表4 方差分析

響應(yīng)面分析顯示，隨著各因素增加或延長，吸光度隨之升高，但之后反而有降低趨勢，并且各因素之間交互作用不顯著，與方差分析結(jié)果一致。殘差圖分析顯示，模型呈正態(tài)分布，殘差擬合曲線為線性，預(yù)測值呈散點(diǎn)分布，表明擬合結(jié)果可靠。另外，預(yù)測值與實(shí)際值的擬合情況良好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)呈散點(diǎn)分布并位于直線兩側(cè)，同時誤差較小。

最終確定，最優(yōu)條件為AgNO3濃度1.97 mmol/L，反應(yīng)溫度27.67 ℃，pH 8.01，吸光度0.711，考慮到實(shí)驗(yàn)操作的可行性，將其修正為AgNO3濃度2.0 mmol/L，反應(yīng)溫度28 ℃，pH 8。

3.5 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“3.4”項(xiàng)下優(yōu)化條件進(jìn)行3批驗(yàn)證試驗(yàn)，測得吸光度分別為0.681、0.702、0.715，平均值為0.699，RSD為2.45%，表明該條件穩(wěn)定可靠。

3.6 形態(tài)表征 Am-R02胞內(nèi)提取物合成的納米銀呈球形或近球形，大小形態(tài)均一，粒徑主要為1～20 nm，分散性較好，呈單一分散狀態(tài)，見圖8。

圖8 納米銀透射電鏡圖

3.7 抑菌作用實(shí)驗(yàn) 由表5可知，納米銀對各細(xì)菌均有較強(qiáng)的抑制效果，介于氨芐西林和四環(huán)素之間。

4 討論

本研究從黃芪根的38株內(nèi)生真菌篩選具有合成金屬納米粒子能力的內(nèi)生真菌，獲得了4株能合成納米銀的菌株，其中合成活性最高的內(nèi)生真菌Am-R02鑒定為Aspergillusparvisclerotigenus。對Am-R02合成納米銀的條件優(yōu)化得到最佳條件為pH 8.0，AgNO3濃度2 mmol/L，反應(yīng)時間12 h。在影響納米銀合成的條件中，pH值屬于顯著性因素，后續(xù)pH值的影響機(jī)制需要深入研究。

表5 抑菌作用實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Mohan等[17]研究發(fā)現(xiàn)，較低濃度的納米銀即能夠抑制銅綠假單胞菌和大腸桿菌的生長。Morones等[18]發(fā)現(xiàn)粒徑1～100 nm的納米銀對革蘭氏陰性菌有很好的殺菌作用，推測可能是納米銀緩釋銀離子，進(jìn)而起到一定的殺菌效果。本研究發(fā)現(xiàn)，Am-R02合成的納米銀的粒徑主要分布在20 nm以下，抑菌作用實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了其在低濃度時就對大腸桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有很好的抑制作用，本研究合成的納米銀表征形態(tài)以及其在低濃度的抗菌活性數(shù)據(jù)與張映[19]利用鉤狀木霉生物還原制備納米銀的性質(zhì)類似，而抑菌性研究結(jié)果與以上學(xué)者利用其它植物內(nèi)生真菌合成納米銀的研究結(jié)果有一定的差異性，說明真菌胞外生物合成納米銀的抑菌能力與真菌種屬類別有一定的關(guān)系。