劉夢麗， 余函紋， 李 景， 徐 睿， 吳君賢， 彭華勝,2， 查良平*， 桂雙英,3,4,5*

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，安徽 合肥 230012；2.中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心，道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；3.安徽省中醫(yī)藥科學(xué)院藥物制劑研究所，安徽 合肥 230012；4.現(xiàn)代藥物制劑安徽省教育廳工程技術(shù)研究中心，安徽 合肥 230012；5.藥物制劑技術(shù)與應(yīng)用安徽省重點實驗室，安徽 合肥 230012)

桔梗為桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorus(Jacq)A.DC 的干燥根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》[1]，性平，味苦、辛，歸肺經(jīng)[2]，具有宣肺、利咽、祛痰、排膿的功效，臨床用于肺癰吐膿、咽痛音啞、胸悶不暢、咳嗽痰多[3]，是一種傳統(tǒng)“引經(jīng)”藥，可載藥上行直達(dá)病所[4-5]。現(xiàn)代研究表明，桔梗中含有皂苷、甾醇、黃酮、氨基酸、多糖及微量元素等多種化學(xué)成分[6-7]，其中三萜皂苷為其主要活性成分[8]，具有祛痰、鎮(zhèn)咳、抗炎、保肝、抗腫瘤及免疫調(diào)節(jié)等多種藥理活性[9-11]。

三萜皂苷是一類具有多種生理功能的次生代謝產(chǎn)物，在自然界中分布廣泛[12]，其中雙子葉植物中含量最佳、分布最多，可以增強(qiáng)植物抗病和抗蟲害能力，是中藥材藥用有效成分的重要組分[13]。桔梗皂苷類成分均屬于齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷[14]，通過萜類化合物的生物合成途徑產(chǎn)生，即細(xì)胞質(zhì)中甲羥戊酸途徑(MVA)和質(zhì)體中的甲基赤蘚醇磷酸(MEP)途徑[15-16]。MEP途徑第一步是由1-脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶催化3-磷酸甘油醛和丙酮酸縮合生成1-脫氧-木酮糖-5-磷酸(DXP)，其次，由1-氧-D-木酮糖-5-磷酸還原異構(gòu)酶通過還原反應(yīng)將DXP催化生成MEP。隨后，通過2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胱氨酰轉(zhuǎn)移酶(MCT)、4-(5′-焦磷酸胞苷)-2-C-甲基D-赤蘚糖醇激酶(CMK)等一系列酶促反應(yīng)將MEP磷酸化、環(huán)化等生成異戊烯基焦磷酸(IPP)與二甲基烯丙基焦磷酸(DMAPP)[17-19]。

目前，MCT和CMK基因已經(jīng)從多種植物中成功克隆，例如巴西[20]、杜仲[21]、銀杏[22]、南方紅豆杉[23]、黃花蒿[24]，而桔梗MCT和CMK基因尚未有報道。本文首次從桔梗中克隆得到MEP途徑的關(guān)鍵酶基因PgMCT和PgCMK的全長序列，進(jìn)行序列分析，構(gòu)建原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，為深入研究桔梗三萜皂苷的生物合成分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材 桔梗來源于安徽省桐城市唐灣鎮(zhèn)013縣道，采取2年生桔梗，收集根、莖和葉，經(jīng)液氮速凍，保存于-80 ℃冰箱。

1.2 細(xì)胞與試劑 Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞、Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購自于北京全式金生物技術(shù)有限公司。原核表達(dá)載體購自于武漢淼靈生物科技有限公司，引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

2 方法

2.1 基因數(shù)據(jù)獲取 桔梗PgMCT和PgCMK基因序列來源于桔梗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(本實驗室)，經(jīng)冗余序列去除和組裝，功能注釋后分類。GenBank數(shù)據(jù)庫獲取其他物種的MCT和CMK氨基酸序列。

2.2 總RNA的提取和cDNA的合成 以桔梗根部為材料，根據(jù)RNA prep Pure Plant Kit試劑盒說明書提取得到桔梗根部總RNA，電泳檢測桔?？俁NA的完整性，ND2000(Denovix DS-11+, S-03512)測定RNA的A260和A280值，以桔梗RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到桔梗cDNA。

2.3 桔梗PgMCT和PgCMK基因的克隆 根據(jù)桔梗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，設(shè)計PgMCT和PgCMK基因特異性引物。PgMCT正向引物ATGGCAATTCTGCAAGTCTGTCTCC，反向引物TTATGATGACTCTTCAGAAGTGCCA；PgCMK正向引物ATGGCTTCAACCCAGTTGCTCAGTT，反向引物CTAATCAG CAGACACAAAAGGGTCA。以桔梗根部cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳分離、檢測，進(jìn)行切膠回收。將目的基因與克隆載體于25 ℃連接3 h，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)菌液PCR驗證，陽性菌液送至公司完成測序。

2.4 桔梗PgMCT和PgCMK基因的生物信息學(xué)分析 使用NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在線工具BLAST對PgMCT和PgCMK基因序列進(jìn)行同源比對分析；運用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm. nih.gov/ orffinder/)查找基因的開放閱讀框(ORF)；ExPASy(https://web.expasy.org /protparam/)預(yù)測基因編碼蛋白的理化性質(zhì)；利用NPS(https://npsa-prabi.ibcp.fr/ cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)；使用Swiss Model(http://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)建模，結(jié)合PyMOL軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)；CDD(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預(yù)測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；TMHMM(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白序列的跨膜結(jié)構(gòu)域分析；SinalP4.0Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行蛋白序列的信號肽預(yù)測分析；運用ClustalW軟件，將PgMCT和PgCMK氨基酸序列與其他植物的氨基酸序列進(jìn)行比對，用MEGA 6.06軟件構(gòu)建Neighbor-joining系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap重復(fù)次數(shù)為1 000次。

2.5 桔梗PgMCT和PgCMK基因的原核表達(dá) 依據(jù)測序所得序列，在PgMCT和PgCMK基因核苷酸序列兩側(cè)設(shè)計帶有BamHI酶切位點的特異性引物，PgMCT-32a-BamHI正向引物AGGCCATGGCTGATATCGGAATGGCAATTCTG CAAGTCTGTCTCC，反向引物CGACGGAGCTCGAATTCG GACTAATCAGCAGACACAAAAGGGTCA；PgCMK-28a-BamHI正向引物GACAGCAAATGGGTCGCGGAATGGCTT CAACCCAGTTGCTCAGTT，反向引物CGACGGAGCTCGA ATTCGGATTATGATGACTCTTCAGAAGTGCCA。以重組質(zhì)粒為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增、檢測，進(jìn)行切膠回收。同時對pET-32a、pET-28a載體進(jìn)行BamH Ⅰ單酶切，經(jīng)電泳檢測，進(jìn)行切膠回收。在50 ℃條件下，目的基因與原核表達(dá)載體完成無縫拼接，產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落，菌液PCR驗證并挑選陽性菌液送至公司測序。將測序陽性、包含目的基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Transetta(DE3)中，37 ℃下至OD600值為0.6～0.8時，將pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK分別在0.8、0.4 mmol/L的IPTG條件下，28 ℃誘導(dǎo)12 h，收集菌液，完成SDS-PAGE檢測。

3 結(jié)果

3.1 桔梗PgMCT和PgCMK基因克隆和序列分析 依據(jù)桔梗轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)文庫PgMCT和PgCMK的基因序列分析，以桔梗cDNA為模板，經(jīng)過PCR擴(kuò)增，電泳分離、檢測，結(jié)果顯示，PgMCT基因電泳條帶約為954 bp(圖1A)，PgCMK基因電泳條帶約為1 227 bp(圖1B)。PgMCT和PgCMK基因cDNA序列分析結(jié)果顯示，PgMCT基因ORF全長954 bp，編碼317個氨基酸，PgCMK基因ORF全長1 227 bp，編碼408個氨基酸，與目的基因條帶大小一致。

PgMCT和PgCMK蛋白序列通過Genebank中BLASTX進(jìn)行序列比對，結(jié)果顯示，PgMCT和PgCMK與GenBank中已注冊植物基因有較高的同源性，桔梗MCT與萵苣LsMCT(XP_023729231.1)同源相似性為78.91%，與獼猴桃(PSS29099.1)同源相似性為74.48%，將該基因命名為PgMCT，GenBank注冊號為MZ736414。桔梗CMK與茶(XP_028107767.1)同源相似性為80.35%，與水忍冬(AGE10579.1)同源相似性為77.04%，將該基因命名為PgCMK，GenBank注冊號為MZ736415。

3.2 桔梗PgMCT和PgCMK基因的生物信息學(xué)分析

3.2.1 蛋白理化性質(zhì)分析 根據(jù)PgMCT和PgCMK的氨基酸序列，利用ExPASy在線工具對桔梗PgMCT和PgCMK蛋白理化性質(zhì)分析，結(jié)果顯示，PgMCT編碼的蛋白質(zhì)分子式為C1576H2516N420O479S9，編碼317個氨基酸，相對分子質(zhì)量35 300.38，理論pI 6.27，脂肪指數(shù)94.95，不穩(wěn)定性系數(shù)(Ⅱ)為43.68；PgCMK編碼的蛋白質(zhì)分子式為C1978H3105N543O606S12，編碼408個氨基酸，相對分子質(zhì)量44 573.41，理論pI 7.54，脂肪指數(shù)81.54，不穩(wěn)定性系數(shù)(Ⅱ)為44.23。理論上PgMCT和PgCMK蛋白均為不穩(wěn)定蛋白。

3.2.2 蛋白二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 采用NPS在線分析軟件預(yù)測PgMCT和PgCMK蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)(圖2A、2B)，結(jié)果顯示，PgMCT中含有83個α-螺旋，占比26.18%；延伸鏈為78個，占比 24.61%；β-轉(zhuǎn)角為26個，占比8.20%；無規(guī)卷曲為130個，占比41.01%；PgCMK中含有139個α-螺旋，占比34.07%；延伸鏈為69個，占比16.91%；β-轉(zhuǎn)角為25個，占比6.13%；無規(guī)卷曲為175個，占比42.89%，這兩種蛋白的二級結(jié)構(gòu)中所占比例最高的均為無規(guī)卷曲。

通過SWISS-MODEL Workspace在線軟件對PgMCT和PgCMK蛋白進(jìn)行同源建模，構(gòu)建三維空間模型(圖2C、2D)，通過ExPAsy structure assessment程序評測推導(dǎo)PgMCT蛋白模型2yc3.1.A 序列相似性為77.97%，GMQE值為0.62。PgCMK蛋白模型2vf3.1.A序列相似性為31.08%，GMQE值為0.45。

圖2 PgMCT和PgCMK的二級和三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3.2.3 蛋白結(jié)構(gòu)功能域及跨膜結(jié)構(gòu)域分析 利用NCBI的Conserved domains在線工具對PgMCT和PgCMK蛋白結(jié)構(gòu)功能域進(jìn)行預(yù)測分析(圖3A、3B)，結(jié)果顯示，PgMCT屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GT-A超家族；PgCMK具有IspE功能域，屬于IspE超家族。用TMHMM2.0在線工具對PgMCT和PgCMK跨膜結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測分析(圖3C、3D)，結(jié)果顯示，PgMCT和PgCMK均未出現(xiàn)跨膜結(jié)構(gòu)或膜結(jié)合區(qū)域，推測這個兩個蛋白為非跨膜蛋白。

圖3 PgMCT和PgCMK的結(jié)構(gòu)功能域和跨膜結(jié)構(gòu)域

3.2.4 氨基酸序列同源比對 采用DNAMAN軟件對桔梗MCT和CMK氨基酸序列進(jìn)行比對，見圖4。PgMCT與茶CsMCT(XP_028127240.1)、向日葵HaMCT(XP_022038869.1)、萵苣LsMCT(XP_023729231.1)、木薯MeMCT(XP_021592947.1)氨基酸序列的一致性為73.81%，5種植物MCT的N端非催化區(qū)域氨基酸序列是序列對比的主要差異，保守區(qū)主要集中在中部和尾部，具有依賴于Mg2+的底物CTP結(jié)合位點和底物MEP結(jié)合位點。將PgCMK氨基酸序列與長春花CrMCT(ABI35992.1)、杜仲EuCMK(AQZ26750.1)、水忍冬LdCMK(AGE10579.1)、山銀花LhCMK(AGE10580.1)氨基酸序列的一致性為85.33%。發(fā)現(xiàn)PgCMK和其他植物的CMK蛋白均具有3個典型結(jié)合域Motif A、Motif B和Motif C。

圖5 PgMCT和PgCMK與其他物種MCT、CMK氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

3.2.5 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析 從GenBank數(shù)據(jù)庫中選取其他植物的MCT和CMK基因的氨基酸序列，利用MEGA 6.06軟件通過鄰接法構(gòu)建包括桔梗在內(nèi)的MCT和CMK氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖5)。結(jié)果顯示，系統(tǒng)進(jìn)化樹聚集為5種類型，即雙子葉植物、單子葉植物、裸子植物、藻類和菌類。PgMCT與萵苣MCT、橡膠草MCT、向日葵MCT聚為一支，表明其親緣關(guān)系最高。PgCMK與罌粟CMK、非洲相思子CMK、桑CMK、棗CMK聚為一支，表明2者具有較高的親緣關(guān)系。Ls.萵苣Lactucasativa；Tk.橡膠草Taraxacumkok-saghyz；Ha.向日葵Helianthusannuus；Rv.蘿芙木Rauvolfiaverticillata；Of.桂花Osmanthusfragrans；Ir.碎米椏Isodonrubescens；Pv.夏枯草Prunellavulgaris；Cs.茶Camelliasinensis；Ma.桑樹Morusalba；Zj.棗Ziziphusjujuba；Bo.紅木Bixaorellana；Hb.橡膠樹Heveabrasiliensis；Me.木薯Manihotesculenta；At.擬南芥Arabidopsisthaliana；Pk.思茅松Pinuskesiya；Tc.紅豆杉Taxuschinensis；Zm.玉米Zeamays；Bp.綠藻Bathycoccusprasinos；Ol.鞭毛藻Ostreococcuslucimarinus；Gs.硫還原地桿菌Geobactersulfurreducens；Ma.桑樹Morusalba；Zj.棗Ziziphusjujuba；Ap.相思子Abrusprecatorius；Ps.罌粟Papaversomniferum；Eu.杜仲Eucommiaulmoides；Vv.葡萄Vitisvinifera；Ca.小?？Х菴offeaarabica；Sm.丹參Salviamiltiorrhiza；Of.桂花Osmanthusfragrans；Nt.煙草Nicotianatabacum；Sl.番茄Solanumlycopersicum；Lh.菰腺忍冬Lonicerahypoglauca；Aa.黃花蒿Artemisiaannua；Ao.石刁柏Asparagusofficinalis；Zm.玉米Zeamays；Gb.銀杏Ginkgobiloba；Gs.紅藻Galdieriasulphuraria；Es.長囊水云Ectocarpussiliculosus；Ab.鮑曼不動桿菌Acinetobacterbaumannii；Ec.大腸桿菌Escherichiacoli。

3.3 PgMCT和PgCMK原核表達(dá)載體構(gòu)建及誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET-32a-PgMCT、pET-28a-PgCMK轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Transetta(DE3)中，經(jīng)過菌液PCR及公司測序驗證，得到陽性菌株。以pET-32a和pET-28a轉(zhuǎn)入大腸桿菌Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞作為對照，觀察重組融合蛋白pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK經(jīng)過IPTG誘導(dǎo)后的蛋白表達(dá)情況，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示(圖6)，pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK在大腸桿菌Transetta(DE3)中，全菌和沉淀中均有目的基因的表達(dá)，分別在55、50 kDa出現(xiàn)條帶，與預(yù)測結(jié)果一致，而上清液中均沒有目的基因的表達(dá)，沉淀中出現(xiàn)目的蛋白，表明兩種蛋白是以包涵體形式存在。

注：M為 Marker，A1為pET-32a空載，A2為未誘導(dǎo)的pET-32a-PgMCT菌株，A3為IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-PgMCT菌株，A4為IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-PgMCT上清液，A5為IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-PgMCT沉淀，B1為pET-28a空載，B2為未誘導(dǎo)的pET-28a-PgCMK菌株，B3為IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-PgCMK菌株，B4為IPTG誘導(dǎo)的pET-28a-PgCMK上清液，B5為IPTG誘導(dǎo)的pET-32a-PgCMK沉淀。圖6 PgMCT(A)和PgCMK(B)重組蛋白原核表達(dá)

4 討論

桔梗是傳統(tǒng)的藥食兩用中藥材品種之一[25]，其主要成分為結(jié)構(gòu)和功能多樣的萜類化合物，是由共同的結(jié)構(gòu)前體物質(zhì)IPP與DMAPP合成[26]，這2種前體的生物合成途徑包括細(xì)胞質(zhì)中的MVA途徑和質(zhì)體中MEP途徑[16]。近年來，MEP途徑是植物次生代謝調(diào)控研究的熱點領(lǐng)域，MCT和CMK是MEP途徑中的關(guān)鍵酶。

目前，MCT和CMK基因已經(jīng)從多種不同植物中成功克隆，并驗證其蛋白功能。簡東琴等[23]從南方紅豆杉中克隆了TcMCT基因的cDNA序列全長，研究發(fā)現(xiàn)TcMCT基因在綠色樹皮中的表達(dá)量最高，并在大腸桿菌中超表達(dá)，驗證TcMCT基因可促進(jìn)β-胡蘿卜素大量積累，證實MCT基因?qū)τ谳祁愇镔|(zhì)的生物合成的重要性。本研究生物信息學(xué)分析表明PgMCT屬于糖基轉(zhuǎn)移酶GT-A超家族，與青蒿MCT[27]結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果一致，推測為非跨膜蛋白。PgMCT與其他植物的MCT進(jìn)行同源性比對，表明不同植物MCT蛋白的N端氨基酸序列保守性較差，保守區(qū)主要集中在中部和尾部，均具有底物CTP結(jié)合位點和底物MEP結(jié)合位點。王學(xué)勇等[28]從丹參毛狀根中克隆SmCMK基因的全長cDNA序列，初步驗證茉莉酸甲酯誘導(dǎo)下SmCMK基因表達(dá)量與丹參酮類成分的積累呈正比關(guān)系。本研究預(yù)測PgCMK屬于IspE超家族，與雷公藤[29]結(jié)構(gòu)域預(yù)測結(jié)果一致，推測為非跨膜蛋白。PgCMK與其他植物的CMK進(jìn)行同源性比對，表明不同植物的CMK蛋白均具有三個典型結(jié)合域Motif A、Motif B和Motif C，其中，Motif A是底物的結(jié)合位點；Motif B富含甘氨酸，是ATP結(jié)合位點和活性位點；Motif C是穩(wěn)定Motif A和Motif B兩個位點的保守區(qū)域，發(fā)揮穩(wěn)定蛋白的作用。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的制備多克隆抗體的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，具有菌種遺傳背景和生化特性清楚、培養(yǎng)條件簡單、成本低及周期短等特點[30-31]。在大腸桿菌中，外源基因的表達(dá)受很多因子的影響，包括目的基因結(jié)構(gòu)的特性、溫度、IPTG濃度、pH值和時間等[32]。本研究構(gòu)建表達(dá)載體pET-32a-PgMCT、pET-28a-PgCMK，分別在0.8、0.4 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)下，28 ℃培養(yǎng)12 h后，在大腸桿菌Transetta(DE3)中正確表達(dá)，且有較高的表達(dá)量，以包涵體的形式存在。包涵體蛋白一般沒有生物活性，但其形成是宿主細(xì)胞對于外源有害蛋白高效表達(dá)的一種保護(hù)機(jī)制，可以增加蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，有利于減少表達(dá)蛋白的降解[33]。同時，包涵體中雜蛋白的含量較少，經(jīng)過簡單的分離與純化，可以得到純度較高的目的蛋白[34]。

本研究從桔梗中首次克隆得到了PgMCT和PgCMK基因，其ORF全長分別為954、1 227 bp，推測分別編碼317、408個氨基酸，均為不穩(wěn)定蛋白。構(gòu)建了重組質(zhì)粒pET-32a-PgMCT和pET-28a-PgCMK，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌Transetta(DE3)中誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示PgMCT和PgCMK在大腸桿菌中表達(dá)量較高，以包涵體形式存在。下一步研究可以通過包涵體溶解與復(fù)性的方式，獲得有活性的PgMCT和PgCMK蛋白，研究其體外酶學(xué)特征，為功能鑒定提供物質(zhì)基礎(chǔ)。MEP途徑參與桔梗三萜皂苷的生物合成，該途徑中多個基因的表達(dá)量對萜類化合物產(chǎn)量具有決定性影響，因此對桔梗MEP途徑中關(guān)鍵酶基因的研究，為桔梗三萜皂苷成分的生物合成奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。