寶力道， 朱景濤， 趙玉英*

(1.赤峰學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院，赤峰學(xué)院附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 赤峰 024000；2.廣州華夏職業(yè)學(xué)院衛(wèi)建學(xué)院，廣東 廣州 510900)

廣棗為藏、蒙醫(yī)習(xí)用的重要藥材，主要用于氣滯血瘀、胸痹作痛、心悸氣短、心神不安等疾病[1]。多糖是來自于高等植物、動物細(xì)胞膜、微生物細(xì)胞壁中的天然大分子，也是一切生物體維持生命活動所需要能量的主要來源和生物體合成其他化合物的基本原料。多糖的糖鏈能控制細(xì)胞的分裂與分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、延緩衰老、增強機(jī)體的免疫等[2-3]。近些年來對多糖生物活性的研究日趨廣泛，相繼發(fā)現(xiàn)糖類物質(zhì)具有抑制氧自由基、抗病毒、抗輻射、抗艾滋病、降血脂、誘導(dǎo)干擾素產(chǎn)生，以及與DNA復(fù)合而抑制細(xì)菌和腫瘤細(xì)胞繁殖的功能，起到抗菌抑菌、抑制腫瘤細(xì)胞生成的作用[4-7]。多糖結(jié)構(gòu)特征研究的報道較多[8-10]，并在很多領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用[11-12]。用不同方法提取的多糖其結(jié)構(gòu)和生物活性有所不同[13]，本研究對廣棗多糖的提取方法、結(jié)構(gòu)、活性進(jìn)行研究，以期為其產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物 廣棗購自通遼蒙王醫(yī)藥有限責(zé)任公司中藥飲片廠，經(jīng)內(nèi)蒙古民族大學(xué)布和巴特教授鑒定為正品，采用中藥粉碎機(jī)粉碎成粉末后，過80目篩備用。

1.2 儀器 Nicolet Nexus 670FT紅外光譜儀(美國Nicolet公司)；紫外光-240分光光度計(日本島津公司)；D8 FOCUS型X射線衍射儀(德國Bruker公司)。

1.3 試劑 SephadexC-25(瑞典Pharmacia公司)；透析袋(批號MD44-3500，美國Viskase公司)。葡萄糖(純度≥98%，批號BCY-000577，江西佰草源生物科技有限公司)；復(fù)合酶(纖維素酶+果膠酶，濃度≥15 000 U/g，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。苯酚、95%乙醇、丙酮、乙醚、濃硫酸、氫氧化鈉(分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 多糖提取

2.1.1 水提法 稱取廣棗粉末300 g，轉(zhuǎn)移至3 000 mL錐形瓶中，加入2 400 mL水浸泡24 h，80 ℃水浴加熱，攪拌提取3 h，固液分離，重復(fù)3次，合并提取液，減壓濃縮至原體積的10%，加入濃縮液體積5倍量的95%乙醇，沉淀靜置24 h，抽濾，依次用乙醇、甲醇、乙醚洗滌，減壓抽濾，低溫干燥，即得水提淺灰色粗多糖。

2.1.2 堿提法 稱取廣棗粉末300 g，轉(zhuǎn)移至3 000 mL錐形瓶中，加入NaOH溶液(pH 9)2 400 mL，浸泡24 h，80 ℃水浴加熱，攪拌提取3 h，固液分離，重復(fù)3次，合并提取液，減壓濃縮至原體積的10%，加入濃縮液體積5倍量的95%乙醇，沉淀靜置24 h，抽濾，依次用乙醇、甲醇、乙醚洗滌，減壓抽濾，低溫干燥，即得堿提深灰色粗多糖。

2.1.3 超聲法 取300 g廣棗粉末，按1∶8比例加入超純水，超聲提取30 min(超聲功率300 W、頻率40 kHz)，抽濾，重復(fù)2次，合并提取液，減壓濃縮至原體積的10%，加入濃縮液體積5倍量的95%乙醇，沉淀靜置24 h，抽濾，依次用乙醇、甲醇、乙醚洗滌，減壓抽濾，低溫干燥，即得超聲提淺灰色粗多糖。

2.1.4 酶提法 稱取300 g粉碎廣棗，轉(zhuǎn)移至3 000 mL燒杯中，加入4 g復(fù)合酶，加水量以用布袋擠壓時不滴水為標(biāo)準(zhǔn)，充分混合，室溫放置24 h，加水補足至2 400 mL，在45 ℃搖床上提取3 h，重復(fù)3次，合并提取液，減壓濃縮至原體積的10%，加入濃縮液體積5倍量的95%乙醇，沉淀靜置24 h，抽濾，依次用乙醇、甲醇、乙醚洗滌，減壓抽濾，低溫干燥，即得酶提淺灰色粗多糖。

2.2 多糖純化 采用Sevage法脫蛋白，將三氯甲烷-正丁醇混合溶液(4∶1)與多糖溶液充分混合，振搖，脫蛋白，重復(fù)上述操作至無蛋白為止(茚三酮檢驗)。取已脫蛋白的不同提取方法所得廣棗多糖，溶解在水中，轉(zhuǎn)移至分子量3 500 kDa的透析袋中透析，將無機(jī)鹽、小分子物質(zhì)、果膠等成分分離掉，即得純度較高的多糖。

2.3 多糖分子量測定 采用高效凝膠色譜法測定，色譜圖見圖1～4，結(jié)果見表1。

圖1 水提多糖高效凝膠色譜圖

圖2 酶提多糖高效凝膠色譜圖

圖3 超聲多糖高效凝膠色譜圖

圖4 堿提多糖高效凝膠色譜圖

表1 多糖分子量測定結(jié)果

2.4 多糖提取率比較 按公式提取率=(提取得到多糖質(zhì)量/原料質(zhì)量)×100%進(jìn)行計算，結(jié)果水提、酶提、超聲、堿提多糖提取率分別為10.66%、17.3%，12.0%、10.0%。

2.5 多糖含量比較

2.5.1 供試品溶液制備 稱取4種提取方法所得多糖各10.0 mg，置于4個密封管中，加入1 mL蒸餾水充分溶解，再加入1 mL 2 mol/L稀硫酸，封口，沸水浴水解1.2 h，冷卻至室溫，加水定容至10 mL，即得。

2.5.2 對照品溶液制備 精密量取葡萄糖對照品0.010 2 g，溶于100 mL量瓶中，超純水定容，即得。

2.5.3 線性關(guān)系考察 分別吸取對照品溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加到6只比色管中，蒸餾水補足1 mL，每只試管中加入1.5 mL 5%苯酚溶液，再分別加入5 mL濃硫酸，搖勻，靜止22 min，在490 nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，吸光度為縱坐標(biāo)(A)進(jìn)行回歸,得方程為A=0.793 3X+0.083 86(r=0.999 4)，在0.008～0.120 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5.4 多糖含量測定 取供試品溶液數(shù)量，稀釋至規(guī)定質(zhì)量濃度后在490 nm波長處測定吸光度，代入“2.5.3”項下回歸方程，測得水提、酶提、超聲、堿提多糖含量分別為90.9%、90.5%、85.6%、82.3%。

2.6 理化性質(zhì)考察

2.6.1 溶解性 取4種提取方法所得多糖少量，分別置于乙醚、三氯甲烷、二甲亞楓、水中，發(fā)現(xiàn)多糖均易溶于水，微溶于二甲亞砜，不溶于有機(jī)溶劑，pH值為6.0。

2.6.2 熔點 取4種提取方法所得多糖少量，夾在2片蓋玻片中間，置于熔點儀上加熱，發(fā)現(xiàn)多糖在超過300 ℃時均開始變色，但不熔融。

2.6.3 三氯化鐵實驗 取4種提取方法所得多糖少量，依次加入1 mL乙醇、1 mL 1 mol/L鹽酸、1滴5%FeCl3溶液，發(fā)現(xiàn)多糖與5%FeCl3溶液反應(yīng)后顯黃色。

2.6.4 碘-碘化鉀反應(yīng) 取4種提取方法所得多糖少量，發(fā)現(xiàn)碘-碘化鉀溶液反應(yīng)均呈陰性。

2.7 波譜分析

2.7.1 紫外光譜 將4種提取方法所得多糖分別溶于超純水中，在190～800 nm波長處進(jìn)行紫外吸收光譜掃描，結(jié)果見圖5。

圖5 多糖紫外吸收光譜掃描圖

2.7.2 紅外光譜 采用KBr壓片法，將4種提取方法所得多糖在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，特征峰見表2。

表2 多糖紅外光譜特征峰(cm-1)

2.7.3 X射線粉末 將4種提取方法所得多糖研成細(xì)粉，采用X射線衍射儀掃描，掃描范圍20°～100°(2θ)，均未發(fā)現(xiàn)有明顯譜線的譜圖。

2.8 抗氧化活性研究

2.8.1 羥自由基(·OH) 準(zhǔn)確量取1.50 mL 0.2 mol/L PBS緩沖液(pH 7.4)，依次加入0.7 mL 2.0 mmol/L EDTANa2·Fe(Ⅱ)溶液、1.0 mL 0.4 mg/mL供試品溶液、0.4 mL 6% H2O2溶液、0.2 mL 0.52 mg/mL番紅花紅T溶液，超純水定容至5 mL，混合均勻，37 ℃水浴反應(yīng)30 min，在520 nm波長處測定吸光度，空白值以1.0 mL超純水代替供試品溶液，對照值以1.7 mL超純水代替供試品溶液和EDTANa2·Fe(Ⅱ)溶液，重復(fù)測定5次，計算清除羥自由基活性的抑制率，公式為抑制率=[(A樣品-A空白)/(A對照-A空白)]×100%，其中A樣品表示加入供試品溶液后的吸光度，A空白表示以水代替供試品溶液時得到的吸光度，A對照表示以水代替供試品溶液和EDTANa2·Fe(Ⅱ)溶液時的吸光度，結(jié)果見圖6。

圖6 抗羥自由基活性與抑制率的關(guān)系

2.8.2 超氧自由基(·O2-) 準(zhǔn)備7只具塞試管，標(biāo)記1～7號，在1號試管中加入3 mL Met-NBC(在反應(yīng)時放在暗處)，2號試管中加入3 mL Met-NBC、0.1 mL VB2作為空白樣品，3～7號試管中依次加入3 mL Met-NBC、0.1 mL VB2、不同質(zhì)量濃度的4種提取方法所得多糖溶液，熒光燈光照30 min，在560 nm波長處測定吸光度，重復(fù)5次，結(jié)果見圖7。

圖7 抗超氧自由基活性與抑制率的關(guān)系

3 討論

3.1 提取率及多糖含量比較 4種方法中酶提法的提取率最高為17.3%，較排第二的超聲法高出5.3%，酶提多糖的含量雖然不是最高(90.5%)，但與最高的水提法(90.9%)僅相差0.4%，這是因為酶提法屬于生物方法，能有效保存多糖生物活性。

3.2 理化性質(zhì)與波譜比較 4種方法所得多糖水溶性好且顯中性、沒有烯醇式和酚羥基結(jié)構(gòu)，不含蛋白質(zhì)和淀粉，在300 ℃以下對熱穩(wěn)定。由表1、圖1～4可知，水提、酶提、超聲多糖的數(shù)均分子量和重均分子量以及分散度基本一致，而堿提多糖的數(shù)均分子量和重均分子量較小，而分散度較大。紫外光譜進(jìn)一步驗證，廣棗多糖沒有氨基結(jié)構(gòu)。X射線顯示，4種提取方法所得多糖均為無定形體。紅外光譜顯示，4種提取方法所得多糖均有多糖的特征峰，α-和β-吡喃糖苷鍵,具有多種生物活性，是一種活性多糖，具有開發(fā)潛力。

3.3 多糖抗氧化性比較 由圖6～7可知，多糖抗羥自由基活性IC50值順序為酶提法、水提法、超聲法、堿提法、甘露醇；多糖抗超氧自由基活性的IC50值順序為酶提法、水提法、堿提法、超聲法、甘露醇。酶提和水提多糖的抗氧自由基的曲線形狀近似，幾乎重合，說明酶提和水提多糖抗氧自由基活性非常接近，而超聲多糖抗羥自由基較堿提多糖好，堿提多糖抗超氧自由基較超聲多糖好，表明4種提取方法所得多糖均有很強的抗氧化性，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照品甘露醇，且抑制率與濃度呈正相關(guān)。

綜上所述，4種方法獲得的廣棗多糖均不含氨基，重均分子量除堿提多糖外，都在10 kDa以上，是無定形大分子粉末。其中酶提法得到多糖的提取率最高，多糖抗氧化性最好，多糖含量很高，且操作簡單、耗能低，所以廣棗多糖最佳提取方法為酶提法。另外廣棗多糖提取率(17%以上)、含量(90%以上)較其他植物多糖高，且廣棗價格低廉，是獲得植物活性多糖非常好的原料之一，有廣闊的應(yīng)用前景和開發(fā)潛力。