張菲菲， 成 芳， 馬紅芬， 康利娜， 賈碧紅， 安 紅

(邢臺市人民醫(yī)院，河北 邢臺 054000)

川崎病是兒童時期常見的一種急性自限性血管炎，一般指黏膜皮膚淋巴結(jié)綜合癥，常見臨床表現(xiàn)有發(fā)熱、皮疹、眼結(jié)合膜充血、頸部非膿性淋巴結(jié)腫大等。調(diào)查顯示，我國川崎病的發(fā)病率約為51/100 000，主要發(fā)生于5歲以內(nèi)嬰幼兒[1]，大多呈自限性，但仍有20%～25%可并發(fā)嚴重的心血管病，甚至引發(fā)心力衰竭[2]。因此，降低川崎病患兒冠脈并發(fā)癥風險，保護其冠脈組織意義重大。

丙種球蛋白(IVIG)是川崎病常用的治療藥物，效果確切，并對冠脈損傷有一定的保護作用，但在并發(fā)冠脈損傷的川崎病患兒中IVIG的效果不理想[3]。黃芪甲苷可保護大鼠冠脈組織，減輕炎癥浸潤[4]，但各成分是否可減輕川崎病患者的冠脈損傷尚不明確。白介素-35(IL-35)可調(diào)控Janus激酶1(JAK1)/信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄激活子1(STAT1)通路參與川崎病所致的冠脈損傷，它屬于免疫負調(diào)控分子，可增加JAK1、STAT1及其磷酸化表達，參與炎癥反應(yīng)，誘發(fā)冠脈組織炎癥浸潤[5-7]。因此，本研究建立C57BL/6小鼠川崎病冠脈損傷模型，探討黃芪甲苷是否通過調(diào)控該信號通路來減輕川崎病所致的冠脈損傷。

1 材料

1.1 動物 清潔級C57BL/6小鼠58只，雌雄各半，4～6周齡，體質(zhì)量18～22 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK(滬)2020-0002。

1.2 試劑與藥物 干酪乳桿菌細胞壁提取物(湖南朗林生物資源股份有限公司，批號R1912105)；黃芪甲苷對照品(純度≥99.6%，成都科程生物科技開發(fā)有限公司，批號201910145)；IVIG(成都蓉生藥業(yè)有限責任公司，批號201908A103)。鼠IL-35、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測試劑盒(上海信帆生物科技公司，批號RS1811102、RS1905137、R1904126)；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司，批號201907A)；原位末端標記法(TUNEL)檢測試劑盒(瑞士Roche公司，批號AR1904135007)；Trizol溶液(美國Invitrogen公司，批號1907125003)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(德國Qiagen公司，批號R1812102C)；細胞裂解液(上海麥克林生化科技有限公司，批號CL18350)；蛋白質(zhì)提取試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司，批號P190115)；十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠(上海聯(lián)邁生物工程有限公司，批號1910117)；兔單克隆抗體IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1，酶標記的羊多克隆抗體IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司，批號R19101、R19072、R19038、R19041、R19117、R19091、R19108、R19026]。

1.3 儀器 FA-1 A型勻漿機(江蘇盛藍儀器制造有限公司)；TG22-WS型醫(yī)用離心機(長沙湘銳離心機有限公司)；JB-5C型光學顯微鏡(上海光學儀器廠)；SP-723型分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；9700型聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)儀(美國ABI公司)；SE 600X Chroma型電泳儀(美國Hofer公司)；170-3940型轉(zhuǎn)膜儀(美國Bio-Rad公司)；FluorChem R型號凝膠成像分析系統(tǒng)(美國ProteinSimple公司)。

2 方法

2.1 建模、分組及給藥 參照川崎病冠脈損傷建模操作規(guī)程[8]，50只C57BL/6小鼠單次腹腔注射0.5 mg干酪乳桿菌細胞壁提取物，第5天按照文獻[8]標準判斷是否建模成功。將建模成功的小鼠隨機分為模型組、IVIG組及黃芪甲苷低、中、高劑量，另取8只小鼠作為對照組，IVIG組腹腔注射2 mg/g IVIG(臨床等效劑量)，黃芪甲苷低、中、高劑量組分別腹腔注射0.25、0.5、1.0 mg/kg黃芪甲苷(分別為臨床等效劑量的1/2、臨床等效劑量、臨床等效劑量的2倍)，對照組、模型組均腹腔注射等容量生理鹽水，于建模成功并分組后當天開始給藥，每天1次，連續(xù)1周。

2.2 ELISA法檢測血清及心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平 小鼠斷頭取血，3 000 r/min離心15 min(離心半徑8 cm)，取上清，即得血清；迅速剝離心臟，洗凈后取心臟組織進行勻漿，12 000 r/min離心10 min(離心半徑10 cm)，取上清液，即得心臟組織勻漿液，按照試劑盒說明書檢測小鼠血清和心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平。

2.3 HE染色觀察冠脈病變情況 取小鼠冠脈組織，經(jīng)固定、沖洗、脫水、包埋、切片、攤片、烤片、脫蠟后采用蘇木素染色10 min，鹽酸乙醇分化3～5 s，飽和碳酸鋰返藍，伊紅復染，最后中性樹膠封片，在光學顯微鏡下觀察。

2.4 TUNEL法檢測冠脈組織細胞凋亡率 按“2.3”項下方法制作組織切片，于脫蠟后加入蛋白酶K工作液，在37 ℃下反應(yīng)30 min，室溫固定30 min，按照TUNEL試劑盒說明書操作，棕黃色染色的細胞為冠脈組織凋亡細胞，隨機選取5個不重復視野計算凋亡細胞占比，即為冠脈組織細胞凋亡率。

2.5 RT-qPCR法檢測冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表達 小鼠冠脈組織液氮研磨后按Trizol法提取總RNA，分光光度計檢測其濃度，鑒定純度，以1.8～2.0為合格，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。PCR反應(yīng)體系為95 ℃ 30 s，95 ℃ 60 s，74 ℃ 90 s，70 ℃ 20 s，共35個循環(huán)，最后52 ℃ 10 min。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量，參照NCBI基因數(shù)據(jù)庫設(shè)計引物序列，IL-35正向5′-TCGTATAGGCTTATAGCTATG-3′，反向5′-AGGCTAGAGGGAGAGCTTAG-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度240 bp；JAK1正向5′-CTGAGATTGAGAGGAGGTTA-3′，反向5′-GAGATC TCGAGAGGAGGCTATAGCTAG-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度320 bp；STAT1正向5′-CGCGATATATGCG GCGCGATATGC-3′，反向5′-GAGAGCTTAGGAGAG CTAG-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度256 bp；β-actin正向5′-AGGACTCTTAGAGCTAG-3′，反向5′-TAGAGC TTTCTAGAGCTAG-3′，預(yù)計擴增產(chǎn)物長度180 bp，委托寶生物工程(大連)有限公司合成。

2.6 Western blot法檢測冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達 小鼠冠脈組織液氮研磨后用磷酸鹽緩沖液沖洗，2 000 r/min離心10 min(離心半徑8 cm)，沉淀物中加入裂解液提取蛋白，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加入兔抗IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1單克隆抗體(1∶2 000、1∶1 000、1∶2 000、1∶2 000)，在4 ℃下孵育過夜，TBST緩沖液洗滌，加入酶標記的羊抗IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1多克隆抗體(稀釋倍數(shù)1∶5 000、1∶10 000、1∶5 000、1∶5 000)，室溫靜置2 h，洗膜，加入化學發(fā)光液曝光顯影，采用凝膠成像分析系統(tǒng)計算蛋白相對表達。

3 結(jié)果

3.1 造模情況 50只小鼠中48只建模成功，成功率為96.00%，分別為模型組9只、IVIG組10只、黃芪甲苷低劑量組10只、黃芪甲苷中劑量組10只、黃芪甲苷高劑量組9只，給藥期間各組小鼠均無脫落。

3.2 黃芪甲苷對小鼠血清及心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平的影響 如表1所示，與對照組比較，模型組小鼠血清及心臟組織IL-35水平均降低(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組血清及心臟組織IL-35水平均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；黃芪甲苷高劑量組小鼠血清及心臟組織IL-35水平高于IVIG組(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠血清及心臟組織TNF-α、IL-6水平均升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組血清及心臟組織TNF-α、IL-6水平均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性(P<0.05)；黃芪甲苷高劑量組小鼠血清及心臟組織TNF-α、IL-6水平低于IVIG組(P<0.05)。

3.3 黃芪甲苷對小鼠冠脈病理變化的影響 如圖1所示，對照組小鼠冠脈組織細胞排列致密、規(guī)整，血管內(nèi)壁光滑，未見炎癥細胞浸潤；模型組小鼠冠脈組織細胞排列嚴重紊亂，血管內(nèi)壁極度不光滑，可見較多炎癥細胞浸潤；黃芪甲苷低劑量組小鼠冠脈組織細胞排列明顯紊亂，血管內(nèi)壁明顯不光滑，可見部分炎癥細胞浸潤；黃芪甲苷中劑量組和IVIG組冠脈組織細胞排列紊亂，血管內(nèi)壁不光滑，可見少量炎癥細胞浸潤；黃芪甲苷高劑量組冠脈組織細胞排列稍有紊亂，血管內(nèi)壁欠光滑，可見較少炎癥細胞浸潤。

3.4 黃芪甲苷對小鼠冠脈組織細胞凋亡率的影響 如表2、圖2所示，與對照組比較，模型組小鼠冠脈組織細胞凋亡率升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織細胞凋亡率均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織細胞凋亡率低于IVIG組(P<0.05)。

表1 各組小鼠血清及心臟組織IL-35、TNF-α、IL-6水平

圖1 各組小鼠冠脈病變(HE染色，×400，50 μm)Fig.1 Mouse coronary artery lesions in each group (HE staining, ×400, 50 μm)

表2 各組小鼠冠脈組織細胞凋亡率

圖2 各組小鼠冠脈組織TUNEL染色(×400，50 μm)Fig.2 TUNEL staining of mouse coronary tissues in each group(×400, 50 μm)

3.5 黃芪甲苷對小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表達的影響 如表3所示，與對照組比較，模型組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA表達降低(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA表達均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA表達高于IVIG組(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1 mRNA表達均升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1 mRNA表達均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1 mRNA表達均低于IVIG組(P<0.05)。

3.6 黃芪甲苷對小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達的影響 如表4所示，與對照組比較，模型組小鼠冠脈組織IL-35蛋白表達降低(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織IL-35蛋白表達均升高(P<0.05)，并呈劑量依賴性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織IL-35蛋白表達高于IVIG組(P<0.05)。與對照組比較，模型組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達均升高(P<0.05)；與模型組比較，IVIG組和黃芪甲苷各劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達均降低(P<0.05)，并呈劑量依賴性；黃芪甲苷高劑量組小鼠冠脈組織JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達高于IVIG組(P<0.05)。

表3 各組小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1 mRNA表達

表4 各組小鼠冠脈組織IL-35、JAK1、STAT1、p-STAT1蛋白表達

4 討論

川崎病冠脈損傷的發(fā)生和發(fā)展機制復雜，急性炎癥、免疫失衡、氧化應(yīng)激損傷等均可能參與川崎病并發(fā)心血管病的進程[9-10]。在川崎病患兒急性期和亞急性期，外周血T淋巴細胞處于異常免疫激活狀態(tài)，以T細胞亞群失衡為主要表現(xiàn)，而T細胞異常激活可導致炎癥細胞因子合成和分泌紊亂，其中IL-35水平下降，TNF-α與IL-6水平則升高[11-13]。黃芪具有補氣固表、養(yǎng)血補氣、補中益氣等功效，具有抗氧化、減輕炎癥反應(yīng)和保護心肌組織的作用，黃芪甲苷是黃芪的主要成分，且在既往報道中發(fā)現(xiàn)黃芪甲苷還可增強機體免疫力，調(diào)節(jié)T淋巴細胞亞群的水平和生物學活性[14-15]。因此，本研究探討了黃芪甲苷防治川崎病冠脈損傷的作用。

IVIG屬于一種重要的免疫調(diào)節(jié)劑，可增強免疫力，調(diào)節(jié)免疫平衡，IVIG靜脈注射治療川崎病患兒療效確切[16]，且對冠脈損傷也有一定的防治作用，故本研究選用IVIG作為陽性對照藥物。此外，本研究采用干酪乳桿菌細胞壁提取物腹腔注射建立川崎病冠脈損傷小鼠模型，成功率達96.00%[17]，證實采用該方法可支撐完成本次實驗。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組小鼠血清及心臟組織IL-35水平降低，TNF-α、IL-6水平及冠脈組織細胞凋亡率均升高，冠脈組織呈嚴重病理改變；而給予IVIG和黃芪甲苷干預(yù)后，以上指標均有改善。提示，黃芪甲苷和IVIG均可減輕小鼠川崎病炎癥反應(yīng)和冠脈組織損傷，減少冠脈組織細胞凋亡，且高劑量黃芪甲苷的效果優(yōu)于低、中劑量黃芪甲苷和IVIG。

川崎病所致的冠脈損傷與炎癥反應(yīng)有著密切關(guān)系。IL-35屬于白介素-12家族的重要成員，可由調(diào)節(jié)性T細胞、CD4+T細胞、內(nèi)皮細胞及平滑肌細胞等產(chǎn)生和分泌，可抑制炎癥反應(yīng)，調(diào)節(jié)免疫平衡，在多種炎癥與自身免疫性疾病中其水平均下降。血清IL-35水平下降很可能是癥狀性冠脈疾病的預(yù)測因子，也是冠脈心肌功能的關(guān)鍵因素[18]。在川崎病早期，調(diào)節(jié)性T細胞與CD4+T細胞活性下降，IL-35減少，是引發(fā)炎癥反應(yīng)、導致冠脈損傷的重要病因[19]。一方面，IL-35水平下降可激活JAK1/STAT1通路，增加STAT1磷酸化表達，JAK1和STAT1均有促凋亡、促炎癥作用，在冠脈炎癥損傷、冠脈細胞缺血缺氧性變性及凋亡等病理改變中均積極參與且均有較強的活性[20-21]。另一方面，IL-35可負向調(diào)控效應(yīng)T細胞，其水平下降可使得分泌TNF-α、IL-6等因子的免疫細胞活性增加，共同參與川崎病所致的冠脈炎及組織炎癥浸潤[22]。本研究中顯示，模型組小鼠冠脈組織IL-35 mRNA和蛋白表達均低于對照組，p-STAT1蛋白表達及JAK1、STAT1 mRNA和蛋白表達均高于對照組；黃芪甲苷各劑量和IVIG干預(yù)后，以上指標均有改善。提示，黃芪甲苷能夠是通過上調(diào)IL-35表達，抑制JAK1/STAT1信號通路轉(zhuǎn)導，下調(diào)JAK1、STAT1、p-STAT1表達，發(fā)揮對小鼠川崎病冠脈損傷的保護作用。黃芪甲苷的作用呈劑量依賴性，且高劑量黃芪甲苷效果更優(yōu)，提示黃芪甲苷在川崎病冠脈病變防治方面有良好的價值。

綜上所述，黃芪甲苷和IVIG均可增加血清及心臟組織IL-35水平，降低TNF-α、IL-6水平，減輕炎癥反應(yīng)和冠脈組織病理改變，減少冠脈組織細胞凋亡，呈劑量依賴性，且高劑量黃芪甲苷的效果更優(yōu)。黃芪甲苷可能是通過上調(diào)IL-35表達，抑制JAK1/STAT1信號通路，下調(diào)JAK1、STAT1、p-STAT1表達，實現(xiàn)對小鼠川崎病冠脈損傷的保護作用。