張洪銘，郭文軍，孫英蓮，王英軍，解生旭，徐雅娟※

（1.長春中醫(yī)藥大學，吉林 長春 130117；2.吉林省中醫(yī)藥科學院第一臨床醫(yī)院中藥藥效物質基礎重點實驗室，吉林 長春 130012）

發(fā)熱是較多疾病的共同特征，具有復雜的病理過程，現(xiàn)代醫(yī)學認為發(fā)熱是因外源性熱原作用于免疫活性細胞導致機體產生內源性熱原，而內源性熱原作用于環(huán)磷腺苷等體溫調節(jié)介質導致機體產熱增加或散熱減少[1,2]。清肺化痰顆粒（QFHT）是吉林省中醫(yī)藥科學院第一臨床醫(yī)院的協(xié)定方劑，由桑白皮和地骨皮等12味藥材組成，在解熱、祛痰、鎮(zhèn)咳和平喘的臨床應用中療效確切，但該方劑的藥效物質基礎和作用機制尚未明確，需要利用全面有效的研究手段進行探討。近幾年提出的代謝組學研究思維符合中藥多成分、多靶點和多途徑的系統(tǒng)性治療原則，該研究方法已被廣泛應用于探討藥物作用機制[3-5]。本文擬以UPLC-Q-Exactive-MS的血清代謝組學為技術手段，篩選酵母誘導大鼠發(fā)熱的潛在生物標志物，探討QFHT解熱作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級SD 大鼠60 只，雌雄各半，180~200 g，購自遼寧長生生物技術股份有限公司，許可證號：SCXK（遼）2020-0001；質量合格證號：210726210100264952，實驗動物使用符合倫理委員會規(guī)定。

1.2 試藥與試劑

QFHT由吉林省中醫(yī)藥科學院第一臨床醫(yī)院制劑室提供；對乙酰氨基酚片，葵花藥業(yè)集團湖北武當有限公司，批號：190402；酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限責任公司，批號：20120516；氯化鈉注射液，長春豪邦藥業(yè)有限公司，批號：S13030601；質譜級甲醇，德國Fisher 公司；超純水（Milli-Q 儀器所制）；大鼠環(huán)磷酸腺苷（cAMP）酶聯(lián)免疫分析試劑盒，上海酶聯(lián)生物科技有限公司，批號：03/2021。

1.3 儀器

ST-360酶標儀，上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司；Vanquish Duo 超高效液相色譜儀，Q-Exactive 質譜儀，美國Thermo Fisher Science；GL-21M 高速冷凍離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；PD-1C-80 冷凍干燥機，上海比朗儀器制造有限公司。

1.4 方法

1.4.1 動物分組及給藥 實驗前每只大鼠測肛溫2次，選取體溫波動不超過0.5℃的大鼠為實驗用大鼠，以2次合格體溫的平均值作為大鼠基礎體溫值。大鼠60 只，兼顧體溫、體重將其均分6 組，每組10 只，分別為對照組、模型組、陽性藥組、QFHT 高劑量組、中劑量組和低劑量組。陽性藥組灌胃0.1 g/kg 對乙酰氨基酚片，給藥組灌胃3.5 g/kg QFHT，對照組給予同體積水，連續(xù)給藥5 d，末次給藥前大鼠禁食不禁水16 h，末次給藥后，除對照組外，其余各組大鼠立即于背部皮下注射15%酵母混懸液10mL/kg 致熱，建立大鼠發(fā)熱模型。

1.4.2 藥效學評價 各組大鼠致熱后1 h、2 h、4 h、5 h和6 h 各測肛溫1 次，記錄體溫值并計算與基礎體溫差值；大鼠最后1 次測量體溫后腹腔注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g），腹主動脈采血，靜置3 h，3 000 r/min離心10 min 分離血清，按照cAMP 酶聯(lián)免疫法測定大鼠血清cAMP 的含量。

1.4.3 血清代謝組學分析

1.4.3.2 液相質譜條件 色譜柱：Hypersil GOLD（50 mm 2.1 mm，1.9m）；流動相：水（A）-甲醇（B），梯度：5% B（0~2 min），5%~35% B（2~5 min），35%~55%B（5~12 min），55%~65%B（12~14 min），65%~100%B（14~20 min），100% B（20~25 min），100%~5%B（25~30 min），5%B（30~35 min）；流速0.4 mL/min；進樣量：5L；柱溫：50 ℃。

采用電噴霧電離源（ESI），樣品分別采用正、負離子模式檢測。鞘氣流量60 Arb；輔助氣流量15 Arb；毛細管溫度300℃；一級檢測掃描范圍100~1 500 m/z，分辨率35 000。二級裂解掃描范圍100~1 500 m/z，分辨率17500，裂解能量為10，20，30；動態(tài)排除設為30s。

1.4.4 主成分分析和潛在生物標志物的篩選 使用Compound Discoverer-3.1 對原始的UPLC-Q-Exactive-MS 數據進行預處理，得到包含每個離子峰的保留時間、m/z值和歸一化強度等詳細信息的多維數據集，保存為.csv 文件并導入SIMCA-P14.1 軟件，建立偏最小二乘判別分析（PLS-DA）模型，探討不同組間血清代謝物的差異，參數R2Y 和Q2被用來評價PLS-DA 模型的擬合程度。模型組與對照組比較，根據投影值（VIP＞1）和P ＜0.05，篩選潛在生物標志物。分析給藥組與模型組之間這些潛在生物標志物的水平來說明QFHT對大鼠解熱的作用。

1.4.5 潛在生物標志物的鑒定及通路富集分析 潛在生物標志物的一級和二級質譜碎片信息與人類代謝組數據庫（HMDB，http://www.hmdb.ca） 中已知代謝物的碎片信息進行比對，來實現(xiàn)潛在生物標志物的鑒定。將鑒定出的潛在生物標志物導入MetaboAnalyst 5.0 網站進行通路富集分析。

2 結果

2.1 QFHT 對發(fā)熱大鼠體溫和血清中cAMP 的影響

如圖1 A 所示，與對照組相比，模型組大鼠在注射酵母混懸液后體溫逐漸增加，4 h 后體溫顯著升高，且大鼠出現(xiàn)活動減少、足部、耳廓和鼠尾發(fā)紅發(fā)燙的現(xiàn)象，表明發(fā)熱模型建立成功。與模型組相比，陽性藥組和QFHT 中劑量組大鼠體溫均呈現(xiàn)下降趨勢，且效果明顯（P ＜0.05）。如圖1B 所示，造模6 h 后，模型組大鼠血清中cAMP 含量明顯高于對照組，陽性藥組和QFHT 中劑量組大鼠血清中cAMP 含量明顯低于模型組（P ＜0.05），結果表明QFHT 具有解熱作用。

圖1 各組大鼠肛溫上升曲線圖（A）和血清中cAMP 含量柱形圖（B）Fig.1 Curve of anal temperature rise (A)and column chart of serum cAMP content (B)of rats in the each group

2.2 血清代謝輪廓分析

利用UPLC-Q-Exactive-MS 分析對照組、模型組、陽性藥組和QFHT 中劑量組大鼠的代謝輪廓，進樣分析每10 個血清樣品后，進樣一次QC 樣品，分析評價儀器和方法的穩(wěn)定性。QC 樣品的原始數據進行預處理后，在正離子模式（P）和負離子模式（N）下提取了包含4 755 個和2 331 個離子的兩個數據集，通過計算同一離子在不同QC 中歸一化強度的相對標準偏差（RSD%）來評價儀器和方法的穩(wěn)定性。如圖2 所示，在正離子模式和負離子模式下分別有74%和70%的被測離子的相對標準偏差小于30%[6]，表明該方法重復性、穩(wěn)定性良好。

圖2 所有代謝物在QC 樣品中的RSD（%）分布Fig.2 RSD(%)distribution of all metabolites in QC samples

血清樣品總離子流圖如圖3 所示，各組間總離子流圖存在細微差別，但直觀分析不足以闡明各組間血清代謝譜的差異，故采用主成分分析的手段進一步闡明QFHT 對發(fā)熱大鼠代謝譜的影響。

圖3 總離子流圖Fig.3 Total ion flow diagram

將對照組、模型組和QFHT 中劑量組的多維數據集導入SIMCA-P 14.1 建立PLS-DA模型，并進行200次置換檢驗對模型進行驗證，具體擬合參數見表1，一般認為R2Y 及Q2值大于0.5 的模型擬合較好，穩(wěn)定性較高[7]。如圖4A、4B 所示，模型組和對照組主成分間完全分離，表明大鼠經干酵母造模后，血清代謝譜發(fā)生紊亂，發(fā)熱模型造模成功。圖4C、4D 中顯示，QFHT中劑量組的聚類脫離了模型組，而表現(xiàn)出接近對照組的趨勢，表明QFHT中劑量組的大鼠發(fā)熱已得到恢復，QFHT 起到了解熱的效果。

圖4 PLS-DA 得分圖Fig.4 PLS-DA score diagram

表1 置換檢驗的擬合參數Table 1 Fitting parameters of the replacement test

2.3 潛在生物標志物篩選及鑒定

分析模型組和對照組的PLS-DA 得分圖，根據投影值（VIP ＞1）和t 檢驗（P ＜0.05）篩選了123 個潛在生物標志物，將潛在生物標志物的碎片信息與HMDB數據庫進行比對鑒定。以RT 18.876 min-m/z 480.309 6的LysoPE（18:0/0:0）離子為例說明了鑒定結構過程，如圖5所示，在m/z 196.037 5處觀察到對應于C5H11NO5P-頭基的碎片離子，并且在m/z283.2643 處觀察到該頭基碎片的損失；m/z 214.048 6、m/z 140.011 8 和m/z 78.959 1 處的離子分別代表頭基上的C5H13NO6P-、C2H7NO4P-和O3P-碎片離子，以此將RT18.876min-m/z480.309 6離子鑒定為LysoPE（18:0/0:0）。

圖5 LysoPE（18:0/0:0）二級質譜圖Fig.5 LysoPE(18:0/0:0)secondary mass spectrometry

通過上述方法鑒定出21 個潛在生物標志物，并運用MetaboAnalyst 5.0 分析了潛在生物標志物在各組間的變化趨勢，大鼠發(fā)熱后21 個潛在生物標志物發(fā)生不同程度的改變，并在QFHT治療后能夠被逆轉，詳細信息見表2，表明QFHT 可以通過調節(jié)這些潛在生物標志物達到解熱的效果。

表2 內源性潛在生物標志物及其在組間的變化趨勢Table 2 Endogenous potential biomarkers and their variation trends among groups

這些潛在生物標志物的改變提示了代謝表型發(fā)生變化，有助于了解大鼠發(fā)熱的潛在代謝機制和QFHT的治療機制。生成熱圖以顯示不同組中每個生物標記物的相應水平。如圖6 所示，不同組間的色差表現(xiàn)出潛在生物標志物的變化。

圖6 潛在生物標志物熱圖Fig.6 Heat map of potential biomarkers

2.4 代謝通路分析

將潛在生物標志物的Compound Name導入MetaboAnalyst 5.0 進行通路富集分析，共富集9 條代謝通路，見圖7，其中Impact ＞0.1 為最主要的代謝途徑，詳見表3，表明QFHT解熱的機制與調控色氨酸代謝、牛磺酸和亞?；撬岽x有關。

圖7 潛在生物標志物的代謝通路分析Fig.7 Metabolic pathway analysis of potential biomarkers

表3 潛在生物標志物的代謝通路參數Table 3 Metabolic pathway parameters of potential biomarkers

3 討論

發(fā)熱是較多疾病的共同臨床特征，具有復雜的病理過程。現(xiàn)代醫(yī)學認為，細菌、病毒、真菌和炎性滲出物等外源性熱原作用于免疫活性細胞，導致機體產生內源性熱原[1]。內源性熱原最初作用于前列腺素、環(huán)磷腺苷等體溫調節(jié)介質，通過它們的正向調節(jié)，使得大腦中的體溫調節(jié)點上移，導致產熱增加或散熱減少，最終引起發(fā)燒[2]。常用于誘導大鼠發(fā)熱模型的誘導劑為干酵母、脂多糖和2，4-二硝基苯酚、面包酵母和釀酒酵母甘露聚糖等[8]，其中2，4-二硝基苯酚性發(fā)熱模型升溫最快，但持續(xù)時間較短；脂多糖誘導的發(fā)熱模型的特征為雙相或三相發(fā)熱，其造模劑量極小，高劑量易導致動物死亡；與前兩個誘導劑誘導的發(fā)熱模型相比，干酵母誘導的發(fā)熱模型相對穩(wěn)定，熱程長，重復性好，且原料易得[9]。

發(fā)熱反應大多是各種致熱因子作用于機體，產生和釋放內熱原，并進一步影響體溫調節(jié)中樞，使調溫起步點提高，體溫相應升高。大鼠皮下注射酵母懸液可激活產生內熱原。內生致熱原一般包括IL-1、IL-6和TNF-等，體溫中樞調節(jié)介質包括單胺物質、cAMP和PGE2等，發(fā)熱過程中，內生致熱原通過中樞發(fā)熱介質作用于體溫調節(jié)中樞，使體溫調定點上移，機體產熱。本實驗通過皮下注射15%酵母混懸液建立感染性發(fā)熱大鼠模型，結果QFHT 給藥組在給藥后4 h 對酵母引起的大鼠體溫升高具有降低作用。

cAMP 是中樞神經系統(tǒng)重要的炎癥介質之一，是體內第二信使，對外界刺激做出反應的一類重要的信息傳遞分子，也是中樞主要的正性發(fā)熱介質，cAMP含量上升是多種致熱原引起發(fā)熱的共同中間環(huán)節(jié)[10]，可以通過內源性熱原 下丘腦Na+/Ca2+-cAMP 途徑參與體溫調節(jié)[11-13]。因此抑制cAMP 的合成和釋放是抑制發(fā)熱反應的有效方法。本實驗運用ELISA法測定大鼠血清中cAMP 含量，結果表明，對乙酰氨基酚組和QFHT 給藥組可明顯降低發(fā)熱大鼠血清中cAMP 的含量（P ＜0.05）。提示QFHT 具有一定的解熱作用，其解熱機制可能是通過調節(jié)中樞發(fā)熱介質cAMP，從而達到降低體溫的作用。

色氨酸是人體必需氨基酸，主要參與蛋白質合成和代謝網絡的調節(jié)，其中5-羥色氨酸是5-羥色胺（5-HT）的前體物質，5-HT途徑是色氨酸降解的主要代謝途徑之一。據報道，酵母菌引起的發(fā)熱與5-HT 有關，而下丘腦5-HT含量與溫度呈正相關[14]。有研究表明，5-HT等中樞神經系統(tǒng)單胺類神經遞質能引起大鼠發(fā)熱[15]。本實驗中，與對照組相比，高熱大鼠體內色氨酸、5-HT顯著升高，提示色氨酸合成5-羥色胺的能力增強，從而導致體溫升高，給予QFHT 后，色氨酸、5-HT 水平明顯下降，表明下丘腦體溫調節(jié)中樞受到調節(jié)，從而達到解熱作用，同時也證實了QFHT 調控色氨酸代謝的可能。

有研究發(fā)現(xiàn)，腦室注射IL-1 腦脊液中牛磺酸顯著增多，同時一些動物實驗表明，牛磺酸能夠緩解發(fā)熱過程中出現(xiàn)的興奮沖動傳遞和電解質的改變等。家兔腦室內注射牛磺酸，能夠抑制由內毒素、致熱性細胞因子或PGE2 誘發(fā)的發(fā)熱反應[16]。牛磺熊去氧膽酸是熊去氧膽酸和?；撬峤Y合的產物，本代謝組學實驗中，模型組?；切苋パ跄懰犸@著改變，QFHT治療后，其水平發(fā)生逆轉，提示QFHT 通過調控?；撬岷蛠喤；撬岽x途徑起到解熱的療效。

本研究通過UPLC-Q-Exactive-MS 代謝組學技術發(fā)現(xiàn)QFHT 對發(fā)熱大鼠的治療作用與其改善血清中內源性潛在生物標志物的水平有關，并主要通過調控色氨酸代謝、?；撬岷蛠喤；撬岽x途徑發(fā)揮解熱作用，可為臨床上QFHT 的合理應用提供理論依據。