閻永偉 楊慧超,2 莫照蘭,2,3 李 杰

患擬油壺菌病條斑紫菜表面附生菌群分析*

閻永偉1楊慧超1,2莫照蘭1,2,3李 杰1①

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海水養(yǎng)殖病害防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東 青島 266071； 2. 上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)科學(xué)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心 上海 201306； 3. 中國(guó)海洋大學(xué)三亞海洋研究院 熱帶海洋生物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)與種業(yè)工程實(shí)驗(yàn)室 海南 三亞 572024)

擬油壺菌病(disease)是海上栽培紫菜(sensu lato)的主要病害之一，常引起紫菜大面積病爛并造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。本研究利用擬油壺菌感染海區(qū)內(nèi)不同健康狀態(tài)下的條斑紫菜()[未發(fā)生任何病爛(PyOlpH)、部分紫菜發(fā)生病爛(PyOlpM)和發(fā)生嚴(yán)重病爛(PyOlpS)]，分析其附生菌群多樣性、群落結(jié)構(gòu)和主要類群之間的相互作用。結(jié)果顯示，3種紫菜附生菌群α多樣性指數(shù)不存在顯著差異，但PyOlpM組指數(shù)高于其他組。3種紫菜附生菌群共有可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)數(shù)僅占總OTU數(shù)的22.7%，菌群之間存在顯著差異(置換多元方差分析,2=0.405,<0.05)。紫菜感染程度越高，與PyOlpH之間的差異類群數(shù)量越多。共注釋出23門208屬，α-變形菌綱(α-Proteobacteria)、γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)在所有樣品中均占優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度前20個(gè)屬中有16個(gè)也位于這3個(gè)類群中，且隨著感染程度的增加分別出現(xiàn)遞增或遞減的趨勢(shì)。其中，貪銅菌屬()和鞘氨醇單胞菌屬()是共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)中連接度最高的細(xì)菌類群，二者及其依靠正相互作用連接的細(xì)菌類群之間存在負(fù)相互作用。本研究可為闡明擬油壺菌致病的微生態(tài)機(jī)制及尋找生防細(xì)菌提供一定的數(shù)據(jù)支持。

條斑紫菜；擬油壺菌??；附生菌群；細(xì)菌互作

紫菜(sensu lato，亦稱laver)是一種深受世界人民喜愛(ài)的高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值海洋紅藻，其廣泛栽培主要集中在中國(guó)、韓國(guó)和日本等亞洲國(guó)家。由于部分海區(qū)的水質(zhì)貧瘠、潮流不通、水體污染、溫度不適、養(yǎng)殖管理不當(dāng)?shù)纫蛩?，近年?lái)我國(guó)紫菜栽培業(yè)飽受頻發(fā)病害的困擾(黃健等, 2000)，部分栽培海區(qū)的病爛面積可達(dá)40%～50% (Yan, 2019; 何禮娟等, 2021)。擬油壺菌病(disease)是海上栽培紫菜的重要病害之一，可在短時(shí)間內(nèi)蔓延并導(dǎo)致大面積病爛(Klochkova, 2016)。已確定該病病原屬于專性細(xì)胞內(nèi)寄生的卵菌綱擬油壺菌屬()，已發(fā)現(xiàn)的、.、.var.、var.、、.以及等7種菌均具有感染紫菜的能力(West, 2006; Sekimoto, 2008、2009; Klochkova, 2016; Kwak, 2017; Badis, 2019)。我國(guó)最早于1992年在江蘇省南部栽培的條斑紫菜(，原名[Yang, 2020])中發(fā)現(xiàn)該病(馬家海, 1992)，并先后在栽培條斑紫菜和壇紫菜(, 原名[Yang, 2020])中發(fā)現(xiàn)感染該病(馬家海等, 2007; 劉一萌等, 2012; 何禮娟等, 2021)。擬油壺菌病是對(duì)紫菜栽培威脅最大的病害之一，目前對(duì)病原尚沒(méi)有體外分離培養(yǎng)的方法(Sekimoto, 2008)，因此，對(duì)其致病機(jī)制還知之甚少，也缺乏對(duì)該病害長(zhǎng)期有效的防控方法。已經(jīng)施用的措施包括降低栽培密度、網(wǎng)簾干出以及酸洗等，但效果并不理想(Kim, 2014)。因此，探索病害發(fā)生的機(jī)理及其生物防控方法十分有必要。

近年來(lái)，附生細(xì)菌逐漸成為探究藻類病害發(fā)生機(jī)理和生物防控的熱點(diǎn)和靶點(diǎn)。這是因?yàn)樵孱惛缴?xì)菌除了為藻類生長(zhǎng)提供重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和生長(zhǎng)因子、幫助藻類完成生命周期等重要作用(Goecke, 2010; Singh, 2014)，還與藻類病害密切相關(guān)。一方面，環(huán)境脅迫條件下藻類附生微生物的生態(tài)失調(diào)是導(dǎo)致病害的重要原因。某些致病微生物類群或其毒力相關(guān)的功能基因群在受脅迫個(gè)體上大量富集并最終致病(Egan, 2014、2016)。另一方面，藻類附生細(xì)菌還能通過(guò)分泌抗菌物質(zhì)或群感效應(yīng)(quorum sensing, QS)抑制劑等次級(jí)代謝產(chǎn)物干擾和抵抗致病菌的附著，保護(hù)海藻不受環(huán)境中病原的侵染等(Egan, 2014)。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，藻類附生細(xì)菌中約有12%～50%的菌株具有抗菌活力，是生防菌和抗病物質(zhì)的重要來(lái)源(Singh, 2015)。

此外，對(duì)植物和動(dòng)物卵菌病害的研究也充分體現(xiàn)了附生細(xì)菌在促病、防病方面的重要作用。一方面，植物表面附生細(xì)菌可產(chǎn)生卵菌毒力必需的細(xì)菌毒素或通過(guò)共感染以加強(qiáng)卵菌效應(yīng)基因表達(dá)來(lái)促進(jìn)卵菌的致病性(Larousse, 2017)。另一方面，附生細(xì)菌能抑制卵菌病原的附著或者利用其基因產(chǎn)物抑制卵菌孢子的萌發(fā)及菌絲的生長(zhǎng)。例如，大西洋鮭(L.)的卵受水霉病侵染時(shí)，低發(fā)病率的魚卵上附著的高豐度葉居菌屬()細(xì)菌能有效抑制病原的附著(Liu, 2014)；而陰溝腸桿菌()則能利用和基因表達(dá)的氧化酶和蛋白與終極腐霉()競(jìng)爭(zhēng)植物產(chǎn)生的不飽和脂肪酸，從而抑制腐霉的萌發(fā)并達(dá)到抑病的效果(van Dijk, 2000)。

然而迄今為止，附生細(xì)菌與紫菜擬油壺菌病的關(guān)系尚未明確，一定程度上阻礙了附生細(xì)菌在促病、抗病方面的研究進(jìn)展。因此，研究紫菜附生細(xì)菌與擬油壺菌病之間的關(guān)系，對(duì)病害的生物防控具有十分重要的意義。本研究分析了受擬油壺菌病感染的不同健康狀態(tài)下的條斑紫菜附生菌群變化，擬為探究病害發(fā)生的微生態(tài)機(jī)制及尋找潛在生防細(xì)菌類群提供一定的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集地點(diǎn)為條斑紫菜的重要栽培區(qū)域，位于江蘇省鹽城市大豐區(qū)沿岸東沙海區(qū)(121°03′25.88″E, 33°20′11.28″N)，海區(qū)面積約為1333hm2。2018年10月—2019年1月，該海區(qū)條斑紫菜栽培面積共約333 hm2。2019年1月4日開(kāi)始，約133 hm2區(qū)域條斑紫菜發(fā)生病爛，病爛面積達(dá)40%左右。從該區(qū)域選擇3種不同狀況的網(wǎng)簾進(jìn)行條斑紫菜采樣：網(wǎng)簾上紫菜未發(fā)生任何病爛(PyOlpH)、網(wǎng)簾上部分紫菜已發(fā)生病爛(PyOlpM)以及網(wǎng)簾上紫菜已經(jīng)發(fā)生嚴(yán)重病爛(PyOlpS)(圖1)。每種類型網(wǎng)簾均采集3個(gè)生物重復(fù)，每個(gè)生物重復(fù)采集同一網(wǎng)簾上相對(duì)較為完整的多株(30～40株)條斑紫菜藻體，均勻混合后置于無(wú)菌采樣袋中，同時(shí)用無(wú)菌采水袋采集網(wǎng)簾下部的原位海水以浸沒(méi)采樣袋中的紫菜樣品。采集好的紫菜樣品存放于低溫保溫箱中帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)研究。在每個(gè)生物重中隨機(jī)挑選5～6株條斑紫菜，通過(guò)鏡檢確認(rèn)感染情況。然后，在每個(gè)生物重復(fù)中再隨機(jī)挑選5～6株紫菜藻體，混合后用于附生菌群DNA提取及微生物群落分析。

1.2 病理觀察及病原鑒定

病理觀察及病原鑒定過(guò)程見(jiàn)何禮娟等(2021)。將紫菜樣品用無(wú)菌海水沖洗3～5次后用滅菌的毛筆去除表面雜質(zhì)，并用無(wú)菌刀片切取面積約為1 cm2的條斑紫菜典型病爛部位，在顯微鏡下觀察后，記錄病爛紫菜的組織病理變化。未發(fā)生病爛網(wǎng)簾的紫菜則隨機(jī)切取相同面積的組織進(jìn)行顯微觀察。

用真菌基因組DNA提取試劑盒(思科捷, 青島)提取PyOlpM和PyOlpS組樣品基因組DNA，并分別用真菌ITS通用引物ITS5和ITS4 (White, 1990)、腐霉()1序列特異引物1-pyth-F和1-pyth-R (Lee, 2015)以及擬油壺菌1特異引物1-olpi-F和1-olpi-R (Kwak, 2017)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。最后，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并將目的片段膠回收、T載體連接及轉(zhuǎn)化，將陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序分析。所得序列在NCBI中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，并在MEGA-X軟件中用鄰接法(Neighbor-Joining, N-J)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，模型選擇為Kimura2-paramete (Bootstrap設(shè)置為1000)。

圖1 不同健康狀態(tài)下的紫菜栽培網(wǎng)簾比較

1.3 附生菌群DNA提取、PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序

紫菜樣品表面附生細(xì)菌群落DNA提取參照Burke等(2009)的方法并做適當(dāng)修改：每個(gè)生物重復(fù)的5～6株紫菜藻體先用滅菌海水清洗3次以去除松散結(jié)合的浮游微生物；然后，將藻體置于15 mL CMFSW緩沖液(含0.45 mol/L NaCl、10 mmol/L KCl、7 mmol/L Na2SO4和0.5 mmol/L NaHCO3)中，并添加10 mmol/L EDTA和150 μL過(guò)濾除菌的快速多酶消化液(3M, 澳大利亞)于室溫下孵育2 h；移除藻體后，清液用等體積的酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)和氯仿∶異戊醇(24∶1)各抽提一次，取上清液并加入3倍體積的無(wú)水乙醇和0.1倍體積的醋酸鈉溶液(3 mol/L, pH 5.2)，混合均勻后于?20℃過(guò)夜沉淀；4℃20000×離心30 min獲得DNA沉淀后，用70%的乙醇溶液洗滌2次；最后，用200 μL的無(wú)酶滅菌水溶解DNA并用瓊脂糖凝膠電泳確定DNA片段大小及質(zhì)量。

取2 μL DNA，用Q5高保真DNA聚合酶及地球微生物組計(jì)劃(Earth Microbiome Project)推薦的16S rRNA基因通用引物515F (5′-GTGYCAGCMGCCGCG GTAA-3′)和926R(5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT -3′)擴(kuò)增V4～V5可變區(qū)(Walters, 2016)。每個(gè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增時(shí)，515F引物5′端會(huì)附加6堿基的barcode以對(duì)不同樣品加以區(qū)分。擴(kuò)增條件：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性15 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25～27個(gè)循環(huán)；72℃后延伸5 min。每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒(Axygen, 美國(guó))切膠回收，并用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit (ThermoFisher Scientific, 美國(guó))對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行定量。PCR擴(kuò)增子在上海派森諾公司用Illumina MiSeq平臺(tái)進(jìn)行2×300的雙端測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

每個(gè)樣品的雙端下機(jī)序列用USEARCH 10.0.240 (Edgar, 2010)進(jìn)行拼接、質(zhì)控、去除嵌合體，并按照97%的相似度聚類成可操作分類單元(operational taxonomic unit, OTU)。采用RDP classifier貝葉斯算法在QIIME 1.9.1 (Caporaso, 2010)中基于SILVA132 數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)OTU代表序列進(jìn)行分類(cutoff值設(shè)為0.8)并生成OTU表，將注釋為Unassignable、Unclassified、Chloroplast以及Mitochondria等的OTU信息從OTU表中去除，所得OTU表用以計(jì)算α多樣性、β多樣性和附生菌群組成等。用R (R core team, 2014)和Excel對(duì)微生物多樣性及群落進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，包括各個(gè)類群相對(duì)豐度統(tǒng)計(jì)、α多樣性指數(shù)的單因素方差分析(one-way ANOVA)、韋恩圖分析、主坐標(biāo)分析(PCoA)及置換多元方差分析(PERMANOVA)。

1.5 差異菌群分析

用LEfSe [line discriminant analysis (LDA) effect size] (Segata, 2011)分析不同感染程度紫菜與未感染紫菜附生菌群中的差異類群。其中，本研究中LEfSe分析的參數(shù)分別設(shè)定為L(zhǎng)DA score>2.5，=0.05。

1.6 共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

用相對(duì)豐度前20的細(xì)菌屬構(gòu)建共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)(co- occurrence network)。用pysch包中的corr.test ()函數(shù)在R中計(jì)算各細(xì)菌屬間成對(duì)的Spearman相關(guān)系數(shù)矩陣，并用Gephi 0.9.2 (Bastian, 2009)對(duì)共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行可視化。網(wǎng)絡(luò)圖中的每一個(gè)節(jié)點(diǎn)(node)均代表某個(gè)細(xì)菌屬，節(jié)點(diǎn)之間的連線(也叫作邊, edge)表示2個(gè)細(xì)菌屬間具有顯著的Spearman相關(guān)性(||>0.6, 且FDR校正的<0.01)。

2 結(jié)果

2.1 病理觀察及病原鑒定結(jié)果

不同狀況網(wǎng)簾上紫菜的顯微觀察結(jié)果見(jiàn)圖2。如圖2所示，PyOlpH組紫菜樣品未觀察到任何感染跡象。而PyOlpM和PyOlpS組樣品在顯微鏡下觀察到紫菜細(xì)胞受擬油壺菌感染后呈現(xiàn)的典型病理變化特征(紅色箭頭)，且后者病變程度明顯高于前者。詳細(xì)的病理觀察結(jié)果及分析見(jiàn)何禮娟等(2021)。

利用ITS通用引物、腐霉1特異引物及擬油壺菌1特異引物對(duì)患病紫菜DNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)僅ITS通用引物和擬油壺菌1特異引物出現(xiàn)擴(kuò)增條帶(圖3A)，經(jīng)測(cè)序及構(gòu)建N-J進(jìn)化樹(shù)發(fā)現(xiàn)該病原與聚為一支(圖3B)，說(shuō)明引起大豐地區(qū)紫菜病爛的病原為擬油壺菌。

2.2 各樣本測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

各樣品16S rRNA基因高通量測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表1。如表1所示，下機(jī)序列經(jīng)過(guò)拼接、質(zhì)控等預(yù)處理，共獲得有效序列283 911條。經(jīng)過(guò)OTU聚類、代表序列注釋以及剔除無(wú)效序列等，共獲得247 657條高質(zhì)量序列，分屬于432個(gè)OTU。對(duì)測(cè)序覆蓋度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果顯示，各樣本Good′s coverage指數(shù)均大于0.99 (表1)，表明該測(cè)序深度能夠在很大程度上反映各樣品中的附生菌群多樣性。

圖2 不同狀態(tài)網(wǎng)簾上條斑紫菜的顯微觀察

PyOlpS組條斑紫菜顯微觀察結(jié)果引自何禮娟等(2021)

Microscopic observation ofin PyOlpS is a quotation from He(2021)

圖3 江蘇省大豐病爛條斑紫菜病原鑒定

A：ITS和1基因擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖；B：基于1基因構(gòu)建的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

A: Argarose gel elecgtrophoresis for the amplification of ITS and1; B: N-J phylogenetic tree constructed based on1 gene sequences

M：DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1、2：嚴(yán)重和中度病爛紫菜ITS擴(kuò)增；3、4：嚴(yán)重和中度病爛紫菜的腐霉1擴(kuò)增；5、6：嚴(yán)重和中度病爛紫菜的擬油壺菌1擴(kuò)增；7、8和9分別為ITS、腐霉1和擬油壺菌1陰性對(duì)照(無(wú)菌水作模板)

M: DL 2000 DNA marker; 1, 2: ITS amplification for PyOlpS and PyOlpM; 3, 4:1 amplification for PyOlpS and PyOlpM; 5, 6:1 amplification for PyOlpS and PyOlpM; 7, 8 and 9: Negative controls using sterilized water as template for ITS,1 and1 amplification, respectively

表1 各樣本測(cè)序結(jié)果統(tǒng)計(jì)

Tab.1 Statistics of the sequencing results of all samples

2.3 α多樣性和β多樣性

用Observed species (Obs)、Chao1、PD whole tree (PD)和Shannon等指數(shù)來(lái)表征α多樣性(圖4)。各組之間的多樣性差異均不顯著(>0.05, ANOVA, Tukey′s HSD test)。但是，PyOlpM組樣品的4個(gè)α多樣性指數(shù)(分別為133.00、143.00、11.01和5.30)均高于PyOlpH組(分別為122.00、134.00、10.40和5.26)和PyOlpS組(分別為125.00、132.00、9.91和4.41)，而PyOlpS組除了Obs高于PyOlpH組外，其余指數(shù)也均低于PyOlpH組。

根據(jù)各組間附生菌群落結(jié)構(gòu)多樣性的相互關(guān)系在OTU水平上繪制了韋恩圖(圖5A)。結(jié)果顯示，3組樣品特有的OTU分別為77、86和92個(gè)。有98個(gè)OTU在3組樣品中均存在，占OTU總數(shù)的22.7%。3組樣品兩兩之間也存在共有OTU，其中，PyOlpH和PyOlpM之間共有31個(gè)，PyOlpM和PyOlpS之間共有30個(gè)OTU，而PyOlpH和PyOlpS之間僅共有18個(gè)OTU?；贐ray-Curtis距離的PCoA顯示，紫菜附生菌群可根據(jù)條斑紫菜被侵染的程度而分開(kāi)(PCo1解釋度為41.4%)，表明不同狀態(tài)紫菜附生菌群之間存在明顯差異(圖5B)。基于Bray-Curtis距離的PERMANOVA表明，這種組間差異具有顯著性(2= 0.405,=0.042<0.05)。

圖4 不同狀態(tài)紫菜附生菌群的α多樣性指數(shù)比較

圖5 基于OTU的韋恩圖分析(A)和主坐標(biāo)分析(B)

2.4 微生物群落組成及差異分析

經(jīng)過(guò)序列注釋及分類信息統(tǒng)計(jì)，所得高質(zhì)量序列共注釋出23門208屬。其中，變形菌門(Proteobacteria)中的α-變形菌綱(α-Proteobacteria)和γ-變形菌綱(γ-Proteobacteria)以及厚壁菌門(Firmicutes)在所有樣品中均占優(yōu)勢(shì)，在PyOlpH、PyOlpM和PyOlpS組中共分別占84.7%、83.4%和88.0% (圖6)。α-變形菌綱(PyOlpH: 26.91%; PyOlpM: 24.59%; PyOlpS: 20.44%)和厚壁菌門(PyOlpH: 17.29%; PyOlpM: 9.56%; PyOlpS: 5.95%)相對(duì)豐度隨著感染程度增加呈遞減趨勢(shì)，而γ-變形菌綱相對(duì)豐度(PyOlpH: 40.5%; PyOlpM: 49.2%; PyOlpS: 61.6%)則隨著感染程度增加呈遞增趨勢(shì)。

圖6 不同狀態(tài)條斑紫菜附生菌群在門(或變形菌綱)水平上的相對(duì)豐度變化

從細(xì)菌屬水平來(lái)看，相對(duì)豐度前20的細(xì)菌屬中共有16個(gè)屬分布于α-變形菌綱、γ-變形菌綱和厚壁菌門(圖7)。例如，α-變形菌綱中的甲基桿菌屬()、鞘氨醇單胞菌屬()和柄桿菌屬()，前二者相對(duì)豐度隨著感染程度的增加而降低，而后者則相反；γ-變形菌綱中的貪銅菌屬()、假單胞菌屬()和屬的相對(duì)豐度均隨感染程度增加而增加；厚壁菌門中的屬的相對(duì)豐度隨感染程度增加而減少。

LefSe分析得到的差異菌群結(jié)果顯示，PyOlpM與PyOlpH的附生菌群之間共有16個(gè)類群存在相對(duì)豐度的顯著差異，其中鞘脂單胞菌目(Sphigomonadales)細(xì)菌在PyOlpH中顯著富集，而黃單胞菌目(Xanthomonadales)則在PyOlpM中顯著富集(圖8A)。PyOlpS與PyOlpH的附生菌群之間相對(duì)豐度存在顯著差異的菌群數(shù)量則達(dá)到37個(gè)，如PyOlpS中的假單胞菌目(Pseudomonadales)和柄桿菌目(Caulobacterales)，表明有更多的細(xì)菌類群參與到擬油壺菌的后期感染中(圖8B)。

2.5 附生細(xì)菌的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)分析

利用相對(duì)豐度前20的細(xì)菌屬構(gòu)建了一個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)為18、邊數(shù)為27的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的平均度為3，表示平均每個(gè)細(xì)菌屬連接3個(gè)其他細(xì)菌屬，正相互作用的邊數(shù)為14 (51.85%)，負(fù)相互作用的邊數(shù)為13 (48.15%)。其中，貪銅菌屬的度為最高(8)，且與柄桿菌屬、假單胞菌屬和屬之間存在正相互作用(圖9)；鞘氨醇單胞菌屬的度次之(7)，該屬細(xì)菌與甲基桿菌屬、酸桿菌屬()、蒼白桿菌屬()以及高溫放線菌屬()之間存在正相互作用，且這些細(xì)菌屬均與貪銅菌屬細(xì)菌或與貪銅菌屬細(xì)菌存在正相互作用的細(xì)菌類群之間具有負(fù)相互作用(圖9)。

3 討論

本研究以江蘇省大豐區(qū)某栽培海區(qū)遭受擬油壺菌感染的條斑紫菜為研究對(duì)象，分析了不同感染狀態(tài)下條斑紫菜附生菌群的多樣性和組成差異以及主要主要細(xì)菌類群之間的互作關(guān)系。

圖7 不同狀態(tài)條斑紫菜附生菌群中前30個(gè)細(xì)菌屬的相對(duì)豐度熱圖

綠色表示相對(duì)豐度較高(>1%)的屬，紅色表示相對(duì)豐度較低(<1%)的屬

Genus with high relative abundance (>1%) are marked in green, and those with low relative abundance (<1%) are marked in red

圖8 健康紫菜附生菌群與不同感染程度條斑紫菜附生菌之間的差異菌群分析

紅色表示相對(duì)豐度在PyOlpH組顯著更高的微生物類群，綠色表示相對(duì)豐度在病爛紫菜中顯著更高的類群

Microbial taxa with relative abundance significantly higher in PyOlpH are marked in red, and those with relative abundance significantly higher in diseasedare marked in green

圖9 前20個(gè)細(xì)菌屬之間的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)

節(jié)點(diǎn)的大小與某一屬連接其他屬數(shù)量的多少成正相關(guān); 邊的粗細(xì)與Spearman相關(guān)系數(shù)的大小成正比, 其中灰色的邊表示細(xì)菌屬之間的正顯著相互作用, 而紅色的邊則表示負(fù)顯著相互作用

The size of each node is proportional to the number of connections. The thickness of the edge is proportional to the Spearman’s correlation coefficient. The gray edge indicates significantly positive interaction between bacteria genera, while the red edge indicates significantly negative interaction

研究結(jié)果顯示，附生菌群的α多樣性指數(shù)在不同狀態(tài)樣品之間不存在顯著差異。這與赤腐病感染紫菜的菌群多樣性變化較為一致(Yan, 2019)。但兩項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)，初期感染樣品附生菌群的α多樣性指數(shù)高于未發(fā)生感染樣品，而且β多樣性的結(jié)果顯示了不同感染狀態(tài)樣品附生菌群之間存在顯著差異，表明病原的感染與菌群的紊亂密切相關(guān)。另外，擬油壺菌病的發(fā)生與栽培環(huán)境的變化緊密相關(guān)，如水溫的升高、海水鹽度的降低、水流交換不佳以及干出時(shí)間不足等(馬家海, 1992; Klochkova, 2012、2016)。綜合兩方面，與Egan等(2016)提出的觀點(diǎn)較為符合，即環(huán)境脅迫條件下的微生物生態(tài)失調(diào)是造成藻類病害發(fā)生的主要原因，因此，藻類病害的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)過(guò)程。

研究表明，變形菌門和厚壁菌門通常是海藻表面占主導(dǎo)地位的2個(gè)細(xì)菌類群，在海藻表面廣泛存在的細(xì)菌中它們可被看作是“微生物的雜草種類” (microbial weed species)，并且具有多種多樣的生物功能，例如幫助宿主抵抗多種脅迫環(huán)境因子、具有高效的產(chǎn)能系統(tǒng)以及誘導(dǎo)宿主的形態(tài)發(fā)生和后續(xù)的生長(zhǎng)，表明這些類群的細(xì)菌對(duì)藻類宿主健康的重要性(Singh, 2014)。由于絕大多數(shù)細(xì)菌在藻類特別是紫菜葉狀體上的功能還沒(méi)有詳盡的解析，因此，只能通過(guò)細(xì)菌在植物等宿主或者環(huán)境中的相應(yīng)功能在一定程度上解析其在本研究中的生態(tài)功能。例如，α-變形菌綱中的主要類群(如甲基桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬)以及γ-變形菌綱中的假單胞菌屬是陸生植物的葉際最常檢出的微生物類群。其中，甲基桿菌屬和假單胞菌屬都能分泌AHLs (acyl homoserine lactones)，是植物葉際QS的重要參與者，且后者往往對(duì)植物具有致病性，并通過(guò)QS分泌胞外聚合物增強(qiáng)其對(duì)附著生活的適應(yīng)性(Vorholt, 2012)。此外，甲基桿菌屬細(xì)菌還具有競(jìng)爭(zhēng)利用植物葉際碳源的功能，因此，它可能通過(guò)QS或底物競(jìng)爭(zhēng)等形式調(diào)節(jié)微生物的正常附著和聚集(Vorholt, 2012)。而善于從植物葉際吸收低濃度營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌則對(duì)病原假單胞菌的感染具有強(qiáng)烈的抑制作用，不僅能夠抑制感染癥狀，還能夠減弱病原的生長(zhǎng)(Innerebner, 2011)。另外，土壤、水體以及植物等環(huán)境中常見(jiàn)的貪銅菌屬細(xì)菌能利用多種碳源進(jìn)行生長(zhǎng)，并且具有抗生素和消毒劑的抗性，甚至可導(dǎo)致免疫力低下的人患上嚴(yán)重并發(fā)癥(Balada-Llasat, 2010; Khan, 2016)。這些微生物的生態(tài)功能在一定程度上解釋了這些細(xì)菌類群的相對(duì)豐度變化規(guī)律，亦即對(duì)宿主健康有益的細(xì)菌則相對(duì)豐度隨著感染程度增加而減少，不利宿主健康的細(xì)菌則反之。

除此之外，細(xì)菌之間的共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)圖也能比較直觀地反映細(xì)菌的功能和互作關(guān)系。比如，與鞘氨醇單胞菌屬細(xì)菌具有正相互作用的細(xì)菌類群(如甲基桿菌等，圖9藍(lán)色圓圈)往往與假單胞菌和貪銅菌等病害相關(guān)的細(xì)菌類群(圖9紫色圓圈)具有負(fù)相互作用，表明二者之間具有競(jìng)爭(zhēng)、抑制的作用。這樣的負(fù)相互作用為抑病生防菌的查找提供了重要的理論指導(dǎo)(Poudel, 2016)。研究還發(fā)現(xiàn)，PyOlpM比PyOlpH組的附生菌群顯著富集了黃單胞菌目的細(xì)菌，這類細(xì)菌也是植物葉際表面QS的參與者之一。Berendsen等(2018)研究表明，葉片受霜霉病病原菌侵染的擬南芥在根際招募黃單胞菌目的黃單胞菌屬、寡養(yǎng)單胞菌屬()以及放線菌目(Actinomycetales)的微桿菌屬()等細(xì)菌協(xié)同幫助植物抵抗病害。因此可推測(cè)，擬油壺菌對(duì)紫菜的感染也可使宿主招募某些類群的益生菌來(lái)抵抗病害。但是，由于擬油壺菌和霜霉均為內(nèi)寄生的病原，而由益生菌誘導(dǎo)出的宿主抗病力并不足以治愈已經(jīng)感染的個(gè)體(Berendsen, 2018)，因此，紫菜最終仍會(huì)被病原及后續(xù)生長(zhǎng)起來(lái)的其他致病菌侵染。

基于本研究結(jié)果可提出以下設(shè)想：當(dāng)環(huán)境條件變得適宜擬油壺菌侵染時(shí)，紫菜附生菌群發(fā)生紊亂并朝著利于病原及其他有害微生物附著生長(zhǎng)的方向演變(如甲基桿菌、鞘氨醇單胞菌豐度的不斷降低，貪銅菌和假單胞菌豐度的不斷升高)，這使得擬油壺菌病原不斷附著到紫菜上并侵染、殺死宿主細(xì)胞；隨著病原的持續(xù)感染，雖然紫菜會(huì)招募一些益生菌(如黃單胞菌目細(xì)菌)來(lái)幫助其抗病，但并不足以使其痊愈；貪銅菌和假單胞菌等有害細(xì)菌通過(guò)不斷增殖甚至產(chǎn)生抵抗抗生素和消毒劑的能力，導(dǎo)致病害難以控制，紫菜組織持續(xù)病爛并凋亡。

綜上所述，本研究探究了遭受擬油壺菌感染后不同健康狀態(tài)下條斑紫菜的附生菌群多樣性、群落結(jié)構(gòu)和主要類群之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)不同健康狀態(tài)下的紫菜附生菌群存在明顯差異，且主要細(xì)菌類群之間存在顯著的互作關(guān)系，表明附生菌群的變化和互作在病害發(fā)生過(guò)程中起到了重要的作用。這些結(jié)果為闡明擬油壺菌致病的微生態(tài)機(jī)制及尋找生防細(xì)菌提供了一定的數(shù)據(jù)支持，今后仍需要大量實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證發(fā)病的生態(tài)機(jī)制及附生細(xì)菌的生物功能。

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Epiphytic Microbial Communities Associated withwithDisease

YAN Yongwei1, YANG Huichao1,2, MO Zhaolan1,2,3, LI Jie1①

(1. Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology (Qingdao), Key Laboratory of Maricultural Organism Disease Control, Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Qingdao, Shandong 266071, China; 2. National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 3. Laboratory of Tropical Marine Germplasm Resources and Breeding Engineering, Sanya Oceanographic Institution, Ocean University of China, Sanya, Hainan 572024, China)

disease is one of the main diseases affecting laver cultivation in the sea, often causing large-scale rot and serious economic losses. Although the oomycetic genushas been identified as the pathogen, little is known regarding its mechanisms, including its interaction with epiphytic microbial communities. In the present study, diversities, structures, and major interactions of epiphytic microbial communities were analyzed usingin sea infected by. Theused in the experiment had different health statuses, including no infection (PyOlpH), partial infection (PyOlpM), and serious infection (PyOlpS). The results showed that no significant difference was observed for the α diversity indices among microbial communities associated with the three groups of, but those of PyOlpM were higher than the other two. Shared operational taxonomic units (OTUs) among the three groups of communities only accounted for 22.7% of the total OTUs, in addition to significant community dissimilarity (permutational multivariate analysis of variance,2=0.405,<0.05). More microbial taxa were obtained when communities associated with more seriously infectedcompared to those associated with PyOlpH. In total, 208 genera belonging to 23 phyla were annotated, and α-Proteobacteria, γ-Proteobacteria, and Firmicutes were dominant in all samples. Sixteen of the top 20 genera were also assigned to the three groups, with their relative abundances increasing or decreasing across the infection status from none to severe. Among them, generaandwere the most connected bacterial taxa in the co-occurrence network, and negative interactions were determined between the two taxa and their positively interacting bacterial taxa. This study provides primary datasets for clarifying the microbial ecological mechanisms and searching for probiotics fordisease.

;disease; Epiphytic microbial communities; Bacterial interaction

S917.1

A

2095-9869(2022)03-0165-11

10.19663/j.issn2095-9869.20210326002

http://www.yykxjz.cn/

閻永偉, 楊慧超, 莫照蘭, 李杰. 患擬油壺菌病條斑紫菜表面附生菌群分析. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2022, 43(3): 165–175

YAN Y W, YANG H C, MO Z L, LI J. Epiphytic microbial communities associated withwithdisease. Progress in Fishery Sciences, 2022, 43(3): 165–175

LI Jie, E-mail: lijie@ysfri.ac.cn

* 財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部: 國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助 [This work was supported by China Agriculture Research System of MOF and MARA]. 閻永偉，E-mail: yanyw@ysfri.ac.cn

李 杰，副研究員，E-mail: lijie@ysfri.ac.cn

2021-03-26,

2021-04-19

(編輯 馬璀艷)