丁鴻燕，呂思敏，劉翠娟，吳 鐵,，戚 怡

(1 廣東潤(rùn)和生物科技有限公司，廣東 廣州 510800；2 廣東醫(yī)科大學(xué)，廣東 東莞 523808)

靈芝是多孔菌科真菌靈芝的子實(shí)體，具有補(bǔ)氣安神、止咳平喘、延年益壽的功效，常用于眩暈不眠、心悸氣短、神經(jīng)衰弱、虛勞咳喘。靈芝子實(shí)體是一傘形的菇狀物，呈紫紅色或棕紅色，其質(zhì)地幼時(shí)為肉質(zhì)，成熟變干后為木栓質(zhì)。子實(shí)體由菌蓋(菌傘)和菌柄構(gòu)成。2005年出版《中國(guó)藥典》，收載赤芝和紫芝為靈芝入藥品種[1]。靈芝屬的化學(xué)成分較為復(fù)雜，其中有效成份可分為十大類，包括靈芝多糖、靈芝多肽、三萜類、16種氨基酸(其中含有七種人體必需氨基酸)、蛋白質(zhì)、甾類、甘露醇、香豆精苷、生物堿、有機(jī)酸(主含延胡索酸)，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等[2-3]?，F(xiàn)代研究證明靈芝多糖是靈芝的主要有效成分之一，具有抗腫瘤[4-5]、免疫調(diào)節(jié)[6-7]、降血糖[8]、抗氧化[9]、降血脂與抗衰老作用。低、中劑量的靈芝多糖對(duì)小鼠肝腎功能無(wú)明顯影響[10-11]；可逆轉(zhuǎn)2型糖尿病所引起的腸道微生物菌群和代謝紊亂[12]。靈芝多糖的種類很多，約有200多種，從靈芝的子實(shí)體、孢子粉、發(fā)酵液中都能夠提取出靈芝多糖，針對(duì)提取部位和多糖種類的不同有著不同的提取方式。靈芝多糖的提取方式有：傳統(tǒng)提取法、復(fù)合酶法提取[13]、快速溶劑萃取法[14]、超臨界流體輔助提取、超濾法、微波輔助提取[15]、超聲波提取、超聲波-微波協(xié)同萃取。與傳統(tǒng)工藝相比，此方式提取時(shí)間較短，提取效率也有所增加同時(shí)能夠節(jié)約一定的水資源。綜上，不同的提取方式都有其優(yōu)缺點(diǎn)，要根據(jù)提取原料、條件、提取目的等綜合因素考慮。因此，對(duì)于靈芝多糖的提取不局限于一種方式而是多種方式協(xié)同作用最終得到目標(biāo)產(chǎn)物。

靈芝子實(shí)體具有致密的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，高壓、熱水、稀酸等可提高水對(duì)細(xì)胞穿透能力及細(xì)胞破壞力，可加快多糖的釋放[16]，本實(shí)驗(yàn)研究靈芝子實(shí)體高壓后加熱回流提取靈芝多糖的提取工藝，先把靈芝子實(shí)體用粉碎機(jī)粉碎，然后將粉碎后的靈芝子實(shí)體用鹽酸浸泡，然后采用高壓破壁處理，利用高壓對(duì)細(xì)胞的破碎作用，促進(jìn)靈芝多糖從胞內(nèi)溶出。按照藥典法測(cè)定靈芝子實(shí)體中靈芝多糖的含量方法，結(jié)果如下。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

樣品T1-5為實(shí)驗(yàn)室用莞香木栽培的靈芝子實(shí)體(莞香靈芝，專利申請(qǐng)?zhí)枺?01610320833.5)。FR223CN電子天平；粉碎機(jī)；高壓滅菌鍋；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)；水浴鍋；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀；無(wú)水乙醇、硫酸、無(wú)水葡萄糖對(duì)照品、鹽酸、蒽酮。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)照品溶液的母液制備

取無(wú)水葡萄糖對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含0.12 mg的溶液，即得標(biāo)準(zhǔn)品母液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

精密量取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mL，分別置10 mL具塞試管中，各加至2.0 mL，迅速精密加入硫酸蔥酮溶液(精密稱取蔥酮0.1 g，加硫酸100 mL使溶解，搖勻)6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15 min，取出，以相應(yīng)的試劑為空白同步顯色操作，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 供試品溶液的制備前準(zhǔn)備

取經(jīng)粉碎機(jī)粉碎的靈芝子實(shí)體赤靈芝、紫靈芝，各分為兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，每組10 g，1號(hào)為赤靈芝子實(shí)體對(duì)照組，2號(hào)為赤靈芝子實(shí)體加鹽酸浸泡高壓實(shí)驗(yàn)組，3號(hào)為紫靈芝子實(shí)體對(duì)照組，4號(hào)為紫靈芝子實(shí)體加鹽酸浸泡高壓實(shí)驗(yàn)組，其中：1和3號(hào)不加鹽酸浸泡不經(jīng)高壓，2和4號(hào)用40 mL的1%鹽酸浸泡2 h，后放進(jìn)高壓鍋高壓，25 min升溫121 ℃時(shí)，保持121 ℃，維持30 min，降溫，2.5 h降至65 ℃時(shí)，取出，放入65 ℃烘箱烘干6.5 h(中途稱重)，得供試品。

1.2.4 供試品溶液的制備

取上述編號(hào)1和2的粉末約1 g，精密稱定，裝袋，置圓底燒瓶中，加水30 mL靜置1 h，(95±2) ℃加熱回流4 h，濾過(guò)，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水30 mL，加熱回流3 h，濾過(guò)，合并濾液，85 ℃旋蒸至干，殘?jiān)盟?.5 mL溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇38 mL，搖勻，在4 ℃放置12 h，3000 r/min離心10min，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉(zhuǎn)移到相應(yīng)體積容量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，3000 r/min離心10 min，精密量取上清液適量，加水稀釋，搖勻，取稀釋液2 mL，即得供試品溶液。

1.2.5 靈芝多糖測(cè)定

精密量取供試品溶液2 mL，置10 mL EP管中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，迅速精密加入硫酸蔥酮(0.1 g+100 mL硫酸)溶液6 mL，立即搖勻，放置15 min后，立即置冰浴中冷卻15 min，取出，以相應(yīng)的試劑為空白同步顯色操作，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中無(wú)水葡萄糖的含量，計(jì)算，即得

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線紫外檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1。根據(jù)表1，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線紫外檢測(cè)結(jié)果求出標(biāo)準(zhǔn)曲線方程：y=7.8016x-0.039，R2=0.9975，線性范圍：0.064～0.721。

表1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線紫外檢測(cè)結(jié)果

2.2 供試品前準(zhǔn)備稱重

高壓后的樣品烘干的重量變化情況見(jiàn)表2。

表2 高壓后靈芝子實(shí)體的干燥重量變化

2.3 供試品溶液靈芝多糖的測(cè)定

靈芝多糖紫外檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表3和圖1。從表3及圖1靈芝多糖紫外檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，本實(shí)驗(yàn)中，赤靈芝子實(shí)體加鹽酸浸泡后高壓，提取檢測(cè)的靈芝多糖明顯高于未加鹽酸浸泡后高壓的芝子實(shí)體，其中，加鹽酸浸泡后高壓靈芝子實(shí)體(ω=3.669%)中靈芝多糖的含量是未加鹽酸浸泡后高壓芝子實(shí)體的9.9倍(ω=0.370%)。紫靈芝子實(shí)體加鹽酸浸泡后高壓，提取檢測(cè)的靈芝多糖明顯高于未加鹽酸浸泡后高壓的芝子實(shí)體，其中，加鹽酸浸泡后高壓靈芝子實(shí)體(ω=1.676%)中靈芝多糖的含量是未加鹽酸浸泡后高壓芝子實(shí)體的4.2倍(ω=0.400%)。

表3 靈芝多糖紫外檢測(cè)結(jié)果

續(xù)表3

圖1 靈芝多糖檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)把靈芝子實(shí)體用粉碎機(jī)粉碎，然后將粉碎后的靈芝子實(shí)體用1～5倍的0.5%～3%的鹽酸浸泡1～3 h，然后，放進(jìn)高壓鍋高壓，121 ℃維持30 min，然后，高壓降溫后取出樣品置于65 ℃烘箱烘干5～8 h，之后，采用加熱回流的方法提取靈芝子實(shí)體中靈芝多糖。赤靈芝對(duì)提取得到的靈芝多糖的含量是沒(méi)有經(jīng)過(guò)高壓處理的9.9倍，紫靈芝對(duì)提取得到的靈芝多糖的含量是沒(méi)有經(jīng)過(guò)高壓處理的4.2倍。綜上所述：加鹽酸浸泡后高壓靈芝子實(shí)體中主要成份靈芝多糖的含量更高。