趙亞飛， 李春梅， 閔伊婷， 謝 婕

(哈爾濱商業(yè)大學(xué)藥學(xué)院， 黑龍江 哈爾濱 150070)

紅棗，又名大棗，是鼠李科棗屬植物棗Ziziphuszizyphus.var.iuermis(Bunge)Rehd.的成熟果實(shí)，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[1]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，紅棗水提物中主要成分為多糖類、核苷類和黃酮類3種[2-5]。除此之外還有蛋白質(zhì)，氨基酸，維生素等成分。紅棗多糖是紅棗中一類重要活性成分，研究表明，紅棗多糖具有增強(qiáng)免疫力、抗病毒、抗腫瘤、抗感染、抗氧化[6-7]、抗衰老、抗疲勞[8]、降血脂[9]、保肝和免疫調(diào)節(jié)等多種生理活性[10]。紅棗是我國(guó)傳統(tǒng)“藥食同源”的一種中藥，集保健和食用于一體?？诟泻?，是一種不可多得的優(yōu)良補(bǔ)品。中國(guó)紅棗的研究，在國(guó)內(nèi)和國(guó)外報(bào)道與研究均很少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)紅棗中多糖提取工藝的優(yōu)化及輔料篩選，研制出紅棗多糖顆粒劑，為進(jìn)一步將紅棗多糖作為保健食品或藥品開(kāi)發(fā)提供研究基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 儀器與設(shè)備

CP224S型分析天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；電子調(diào)溫加熱套，天津泰斯特儀器有限公司；UV-5200PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市恒久儀器制造有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與材料

紅棗：產(chǎn)地：新疆圖木舒克市，購(gòu)于人民同泰藥店。

無(wú)水乙醇、丙酮、濃硫酸、5%苯酚溶液、標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖、氫氧化鈉、丙三醇、3,5-二硝基水楊酸、糖粉、糊精、淀粉、乳糖、微晶纖維素等均為分析純。

2 內(nèi)容與方法

2.1 紅棗多糖的提取

紅棗多糖的提取采用熱水浸提法。將紅棗洗凈，粉碎，過(guò)40目篩，按照1:10料液比加入蒸餾水，于60 ℃條件下提取2 h，過(guò)濾，合并濾液，真空過(guò)濾，濃縮后向提取液中緩慢加入3倍體積的無(wú)水乙醇，放置過(guò)夜充分沉淀，減壓抽濾，將沉淀分別以無(wú)水乙醇、丙酮反復(fù)洗滌后，真空干燥后得粗多糖粉末備用。

2.2 總糖含量的測(cè)定

粗多糖中的總糖含量測(cè)定使用苯酚-硫酸法，還原糖含量測(cè)定采用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法，多糖含量等于總糖含量減去還原糖含量。苯酚-硫酸法測(cè)總糖是先用濃硫酸把原多糖斷裂，再和苯酚反應(yīng)顯橙黃色，顏色穩(wěn)定，且在490 nm處有最大吸收，測(cè)出的吸光度值與糖含量呈線性正比關(guān)系。

2.2.1 對(duì)照品溶液制備

精確稱取在105 ℃溫度條件下烘干至恒重的葡萄糖粉末50 mg，將其放于500 mL的容量瓶中，配成濃度為0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.2.2 供試品溶液制備

取紅棗粉末0.50 g，精密稱定，按2.2的方法提取過(guò)濾，合并濾液，移入250 mL容量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，得供試品溶液。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

將標(biāo)準(zhǔn)溶液加入不同體積的蒸餾水，分別配成濃度為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 mg/mL的溶液于六支試管中。每1 mL的標(biāo)準(zhǔn)液分別加入 5% 的苯酚溶液1 mL，并迅速加入濃硫酸5 mL，靜置10 min，混勻，在30 ℃溫度條件下放置30 min后于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，吸光度值作為縱坐標(biāo)，制作得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3 還原糖含量測(cè)定

2.3.1 DNS顯色液的制備

稱取3.25 g DNS，并將其溶于少量蒸餾水，用玻璃棒攪拌溶解，之后轉(zhuǎn)移至500 mL容量瓶中，依次加入體積為162.5 mL 的2 mol/L的NaOH溶液，7.5 mL的丙三醇，振蕩搖勻，加蒸餾水定容至刻度，搖勻。

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取105 ℃溫度條件下烘干至恒重的葡萄糖粉末50 mg于50 mL容量瓶中配成濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。取六支試管，向其中分別加入體積為0.00 mL，0.10 mL，0.20 mL，0.30 mL，0.40 mL，0.50 mL的濃度為1 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，再依次向六支試管中分別加入蒸餾水補(bǔ)至0.50 mL，再向每個(gè)試管中分別加入DNS試劑1.50 mL，振蕩搖勻。六支試管均配制好溶液后，把它們置于沸水浴中煮沸5 min，然后取出迅速流水冷卻，最后分別在每支試管中加入4 mL蒸餾水，振蕩混勻。在540 nm的波長(zhǎng)處測(cè)量吸光度值。以葡萄糖濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程。

2.4 紅棗多糖含量測(cè)定

總糖含量測(cè)定：吸取1.00 mL樣品液，按照2.3.3的步驟操作，計(jì)算出樣品的總糖含量。

還原糖含量測(cè)定：吸取0.50 mL樣品液，按照2.4.2的步驟操作，計(jì)算出樣品的還原糖含量。

紅棗多糖含量=總糖含量-還原糖含量。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液0.80 mL，補(bǔ)蒸餾水到1 mL，再加入 5% 苯酚溶液1 mL，并迅速加入濃硫酸5 mL，靜置10 min。搖勻，30 ℃放置30 min后于490 nm測(cè)定吸光度值，重復(fù)測(cè)定6次，求RSD值。

2.5.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

以上述供試品溶液做穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)。供試品溶液取0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL于試管中，并標(biāo)號(hào)1、2、3，用2.3的方法進(jìn)行測(cè)定, 分別選取三只試管中吸光度在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)良好的一支試管，在60 min內(nèi)，每隔10 min 測(cè)定一次其吸光度，求得RSD值。

2.5.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

精密吸取供試品溶液6份，每份0.80 mL，補(bǔ)蒸餾水到1 mL，再用2.3的方法測(cè)定吸光度值，計(jì)算RSD值。

2.6 紅棗多糖的提取工藝

2.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)

以料液比，溫度，提取時(shí)間三因素做單因素實(shí)驗(yàn)，分別討論以上三因素對(duì)多糖提取率的影響，為下文正交實(shí)驗(yàn)篩選出最適的研究范圍。

(1)提取溫度對(duì)紅棗多糖提取率的影響

稱取紅棗10 g，采用1:10的料液比，在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃按2.3.2的提取方法分別提取2 h，選出最適提取溫度范圍。

(2)料液比對(duì)紅棗多糖提取率的影響

稱取紅棗10 g，在60 ℃條件下，按料液比1:5、1:10、1:15、1:20按2.3.2的提取方法分別提取2 h，選出最佳提取的料液比范圍。

(3)提取時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取率的影響

稱取紅棗10 g，在60 ℃條件下，采用1:10的料液比，按2.3.2提取方法分別提取1 h、2 h、3 h、4 h，選出最佳提取時(shí)間范圍。

2.6.2 正交實(shí)驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)分別選取出的三個(gè)水平，安排三水平正交實(shí)驗(yàn)，以多糖得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取熱水提取紅棗多糖的最佳條件。

2.7 紅棗多糖顆粒劑的制備工藝

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出淀粉和乳糖進(jìn)行混合輔料配比的篩選。以原料藥與輔料比為1:3，70%的乙醇作為潤(rùn)濕劑進(jìn)行制粒。淀粉和乳糖的比例設(shè)置為1:1；1:2；2:1。以顆粒成型率和吸濕率為指標(biāo)，對(duì)以上輔料進(jìn)行優(yōu)選。

成型率的測(cè)定：取制備的樣品顆粒稱重，將顆粒通過(guò)一號(hào)篩和五號(hào)篩，能夠通過(guò)一號(hào)篩并且不能通過(guò)五號(hào)篩的顆粒即為成型較好的顆粒，收集這種顆粒并稱重。計(jì)算顆粒成型率。公式為：

成型率=(通過(guò)一號(hào)篩而未通過(guò)五號(hào)篩顆粒重量/樣品顆粒重)×100%

吸濕率的測(cè)定：將盛有氯化鈉過(guò)飽和溶液的干燥器放入50 ℃的烘干箱內(nèi)2 h，稱取樣品顆粒約1.00 g，置恒重稱量瓶中，干燥至恒重后精密稱取重量，放于底部盛有氯化鈉過(guò)飽和溶液的干燥器內(nèi)，并將稱量瓶蓋打開(kāi)，放置2 h，稱量重量，計(jì)算吸濕率。公式為：

吸濕率=(吸濕后的重量-吸濕前的重量)/吸濕前的重量×100%

以上述兩項(xiàng)指標(biāo)對(duì)輔料綜合評(píng)分，其中成型率占50分，吸濕率占50分，選擇成型率高且吸濕率低的輔料為最優(yōu)輔料。

紅棗多糖顆粒劑的制備采用濕法制粒的方法。將得到的粗多糖溶解，加入上述比例的輔料混合，混合均勻，至輕握成團(tuán)輕壓即散，用20目篩過(guò)篩使成顆粒分鋪烘盤上，于60 ℃以下干燥24 h，得到紅棗多糖顆粒劑。

2.8 紅棗多糖顆粒劑的質(zhì)量檢測(cè)

根據(jù)《中國(guó)藥典》(2020版)顆粒劑項(xiàng)下要求檢查外觀、粒度、水分，干燥失重和溶化性等顆粒劑項(xiàng)下指標(biāo)。

3 結(jié)果與討論

3.1 總糖含量測(cè)定結(jié)果

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。得回歸方程y =4.885x-0.0137，r=0.9998。結(jié)果表明葡萄糖在0.02～0.1 mg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2 還原糖含量測(cè)定結(jié)果

DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示。得回歸方程y =0.766x-0.0058，r=0.9998，結(jié)果表明葡萄糖濃度在0.1～0.5 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 DNS標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 方法學(xué)考察結(jié)果

3.3.1 精密度實(shí)驗(yàn)

[1]馬少波、章力輝等：《中國(guó)京劇史》，中國(guó)戲劇出版社，北京市藝術(shù)研究所，上海藝術(shù)研究所組織編，1990年.

吸光度值見(jiàn)表1，求得RSD值為1.06%，吸光度穩(wěn)定，說(shuō)明精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)表

續(xù)表1

3.3.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

吸光度值見(jiàn)表2。由其數(shù)據(jù)可以看出在490 nm 波長(zhǎng)測(cè)定總糖含量時(shí), 吸光度穩(wěn)定, RSD為2.49%。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性良好。

表2 穩(wěn)定性試驗(yàn)表

3.3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

吸光度值見(jiàn)表3，算出RSD為1.36%，吸光度穩(wěn)定，說(shuō)明重復(fù)性良好。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)表

3.4 紅棗多糖含量的測(cè)定結(jié)果

根據(jù)上文的方法，測(cè)得在60 ℃，料液比1:10，提取時(shí)間為2 h的條件下，紅棗多糖含量為2.76%。

3.5 紅棗多糖提取工藝結(jié)果

3.5.1 單因素實(shí)驗(yàn)

稱取紅棗10 g，采用1:10的料液比，在60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃按上述提取方法分別提取2 h，結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取溫度對(duì)紅棗多糖提取率的影響

由圖3可以看出，隨著水浴溫度的升高，紅棗多糖的提取率也不斷升高，80 ℃時(shí)達(dá)到最高，超過(guò)80 ℃，多糖提取率又呈下降趨勢(shì)。提取溫度過(guò)高會(huì)使多糖分解，溫度過(guò)低不易于多糖的浸出。因此，紅棗多糖的最適提取溫度范圍是70～90 ℃。

(2)料液比對(duì)紅棗多糖提取率的影響

稱取紅棗10 g，在60 ℃條件下，按料液比1:5、1:10、1:15、1:20，即稀釋5倍、10倍、15倍、20倍，按上述提取方法分別提取2 h，結(jié)果如圖4所示。

圖4 料液比對(duì)紅棗多糖提取率的影響

由圖4可以看出，隨著加水倍數(shù)的增加，紅棗多糖的提取率也隨之增加，稀釋倍數(shù)為10即料液比達(dá)到1:10時(shí)，紅棗多糖提取率達(dá)到最大值，最后又呈下降趨勢(shì)，水量過(guò)少會(huì)使紅棗粉浸泡不完全，水量過(guò)多不會(huì)顯著提高提取率，可能還會(huì)使多糖水解，降低提取率。

(3)提取時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取率的影響

稱取紅棗10 g，在60 ℃條件下，采用1:10的料液比，按上述提取方法分別提取1 h、2 h、3 h、4 h，結(jié)果如圖5所示。

圖5 提取時(shí)間對(duì)紅棗多糖提取率的影響

由圖5可以看出，隨著提取時(shí)間的增加，紅棗多糖的提取率也不斷升高，2 h時(shí)達(dá)到最高，超過(guò)2 h，多糖提取率又呈下降趨勢(shì)。因此，提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或過(guò)短都會(huì)影響紅棗多糖的提取率。提取時(shí)間短多糖沒(méi)有完全提取出來(lái)，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致多糖分解，降低提取率。

3.5.2 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別選取三個(gè)水平，正交實(shí)驗(yàn)的因素水平表見(jiàn)表4，安排三水平正交實(shí)驗(yàn)，做L9(34)正交表，以多糖得率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取熱水提取紅棗多糖的最佳條件，結(jié)果見(jiàn)表5。

從上述試驗(yàn)結(jié)果和方差分析，可以看出：(1)極差R反映各因素對(duì)指標(biāo)影響的大小。由于RA>RB>RC，由此可知，以上3個(gè)因素對(duì)紅棗多糖提取率影響大小是：提取溫度>料液比>提取時(shí)間。(2)均值K反映該因素水平對(duì)指標(biāo)的影響的大小。由正交實(shí)驗(yàn)表得知，KA3>KA2>KA1，在提取溫度這一因素下，80 ℃比其他兩個(gè)水平要好；KB2>KB3>KB1，在料液比這一因素下，1:10比其他兩個(gè)水平要好；KC1>KC2>KC3，在提取時(shí)間這一因素下，2 h比其他兩個(gè)水平要好。綜上所述，最佳提取工藝是A2B2C1，即提取溫度80 ℃，料液比1:10，提取時(shí)間2 h。在此條件下紅棗多糖的提取率為3.37%。

表4 因素水平表

表5 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

工藝驗(yàn)證：根據(jù)正交實(shí)驗(yàn)篩選出的最佳工藝提取，連續(xù)提取五次，提取率分別是3.37%，3.29%，3.24%，3.33%，3.26%，RSD=1.60%，該工藝穩(wěn)定可行，紅棗多糖的平均提取率為3.30%。

3.6 紅棗多糖顆粒劑制備工藝結(jié)果

對(duì)成型性和吸濕率綜合評(píng)價(jià)，根據(jù)表6，綜合評(píng)價(jià)最佳輔料配比是可溶性淀粉:乳糖=2:1。

表6 混合輔料配比的篩選

3.7 紅棗多糖顆粒劑的質(zhì)量檢測(cè)結(jié)果

制成的紅棗多糖顆粒顏色為米黃色，顆粒大小均一，顆粒飽滿，干燥后顆粒疏松干燥，色澤一致，總混后顆粒顏色變淺，變白，色澤基本一致。外觀、粒度、水分，干燥失重和溶化性均符合《中國(guó)藥典》(2020版)顆粒劑項(xiàng)下的規(guī)定。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉法提取紅棗中粗多糖，含量測(cè)定采用苯酚-硫酸法測(cè)總糖含量；DNS法測(cè)還原糖含量；二者相減即為多糖含量。根據(jù)正交試驗(yàn)選出紅棗多糖的最佳提取方案為80 ℃，料液比1:10，提取時(shí)間2 h，多糖提取率為3.37%。在紅棗多糖顆粒劑的輔料篩選工藝中，以成型率和吸濕率為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)分，選出分?jǐn)?shù)最高的兩種輔料進(jìn)行混合輔料制劑，再以上述指標(biāo)對(duì)混合輔料配比進(jìn)行篩選，篩選出淀粉和乳糖為最佳輔料進(jìn)行混合輔料制粒，比例為原料藥:可溶性淀粉:乳糖=1:2:1。紅棗作為一種眾所周知的藥食同源的中藥材，前景十分廣闊，本課題的研究也是對(duì)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究的一次探索。