王存良，吳秋歌

（1.鄭州大學第一附屬醫(yī)院a.藥學部；b.呼吸內(nèi)科，河南 鄭州 450052；2.河南省精準臨床藥學重點實驗室，河南 鄭州 450052）

近年來，肺癌的治療取得了長足進步，但肺癌仍是世界范圍內(nèi)與癌癥相關的死亡的主要原因，平均5 a生存率僅為18%［1］。非小細胞肺癌（non－small cell lung carcinoma，NSCLC）患者約占所有肺癌病例的85%，其中近50%有肺腺癌，是最常見的肺部腫瘤之一［2］。雖然肺腺癌的早期檢測、診斷和靶向治療已經(jīng)取得了很大進展，但5 a生存率仍然很低，根據(jù)區(qū)域差異和疾病分期從4%～17%［3］。有腫瘤和合并癥負擔的患者由于未接受有效或特異性治療而死亡的風險較高［3］。因此，了解肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制和發(fā)現(xiàn)新的潛在治療藥物具有重要意義。關聯(lián)性圖譜（connectivity map，CMAP）是基于基因表達譜芯片研究藥物作用機制和藥物重定位的技術與數(shù)據(jù)資源，主要的優(yōu)勢在于能夠高效地對全基因組上的基因表達做整體分析［4］。相對于低通量的藥理學、毒理學方法以及色譜技術，該技術具有全面、高通量、準確等優(yōu)點，因而廣泛應用于藥物研究［5］。基因表達譜描述了在給定疾病狀態(tài)和時間內(nèi)發(fā)生的所有轉錄改變?？梢阅孓D某些變化的化合物可能會成為特定疾病狀態(tài)的潛在抑制劑［6］。本研究利用肺腺癌組織與癌旁正常肺組織的差異基因表達譜數(shù)據(jù)，通過CMAP數(shù)據(jù)庫和生物信息學方法，篩選對肺腺癌基因表達具有反向作用的負相關小分子化合物，期望尋找出潛在的有望在將來用于干預肺腺癌發(fā)生發(fā)展及其治療的化合物，從而開辟出治療肺腺癌的新方法。

1 材料和方法

1.1 基因表達譜數(shù)據(jù)基因表達數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）是公共功能基因組數(shù)據(jù)存儲庫，是當今最大、最全面的公共基因表達數(shù)據(jù)資源。它創(chuàng)建于2000年，收錄了世界各國研究機構提交的高通量基因表達數(shù)據(jù)。通過輸入檢索詞“l(fā)ung adenocarcinoma”，及其他篩選條件檢索得到3個數(shù)據(jù)集（GSE10072［7］、GSE87340［8］、GSE40419［9］）作為 本研究所需的肺腺癌組織樣本的基因表達數(shù)據(jù)。

1.2 差異表達基因的篩選下載經(jīng)log2轉化后的表達矩陣用于后續(xù)分析，使用limma包（linear models for microarray data，微陣列數(shù)據(jù)的線性模型）對肺腺癌組織和癌旁正常組織的差異基因進行鑒定。篩選差異基因的標準為經(jīng)錯誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）校正后的adj P＜0.05和｜log2FC｜≥1。對3個數(shù)據(jù)集分別進行上述篩選，取交集后得到3個基因集共同上調(diào)和共同下調(diào)的差異基因。

1.3 差異基因的通路富集分析為了差異基因對肺腺癌影響的潛在機制，將1.2中的所有基因上傳到DAVID數(shù)據(jù)庫（Database for Annotation，Visualization，and Integrated Discovery）［10］進行在線分析。通過基因本體論（gene ontology，GO）分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析，進一步探討疾病的發(fā)病機制和藥物的作用機制。以P＜0.05為界值篩選顯著影響的代謝通路。

1.4 候選小分子的鑒定CMAP是一個通過小分子藥物來處理人類細胞，然后利用治療后差異表達基因建立小分子藥物、基因表達與疾病相關的數(shù)據(jù)庫［4，6］。有助于研究人員快速鑒定與疾病高度相關的分子藥物，分子藥物的化學結構和可能的作用機制。首先將共同上調(diào)和下調(diào)的基因名稱通過affymetrix（https：／／www.affymetrix.com）HGU133A平臺在線批量轉換為探針名稱，分別保存為.grp格式文件備用。然后將上述文件導入CMAP（https：／／portals.broadinstitute.org／cmap／）數(shù)據(jù)庫進行檢索。

2 結果

2.1 肺腺癌差異基因的篩選從GEO數(shù)據(jù)庫下載3個肺腺癌相關mRNA基因表達譜數(shù)據(jù)。GSE27262包括513個肺腺癌組織和59個癌旁正常組織，GSE87340包括27個肺腺癌組織和27個癌旁正常組織，GSE40419包括87個肺腺癌組織和77個癌旁正常組織，詳細結果見表1。差異分析結果如圖1所示，其中GSE27262中1 213個基因上調(diào)，1 895個基因出現(xiàn)下調(diào)（圖1A）；GSE87340中528個基因上調(diào)，712個基因出現(xiàn)下調(diào)（圖1B）；GSE40419中1 634個基因上調(diào)，1 780個基因出現(xiàn)下調(diào)（圖1C）。venn圖結果顯示3個數(shù)據(jù)集共同上調(diào)差異基因285個（圖1D），共同下調(diào)差異基因513個（圖1E）。

圖1 3個數(shù)據(jù)集中的差異表達基因和共同差異表達基因

表1 3個GEO數(shù)據(jù)集的臨床信息

2.2 差異基因富集分析使用DAVID數(shù)據(jù)庫對共同差異基因進行GO富集分析（P＜0.05）后，共獲得457個富集結果。其中包括生物過程306項，分子功能74項，細胞成分49項，排名前十的GO富集結果如圖2所示。KEGG富集出28條通路，其中富集靶點較多的主要相關信號通路為：PI3K－Akt信號通路，Rap1信號通路，趨化因子信號通路，cGMP－PKG信號通路，HIF－1信號通路等（見圖2和表2）。

表2 共同差異基因通路KEGG注釋

圖2 共同差異基因的GO和KEGG通路富集分析

2.3 鑒定潛在肺腺癌治療小分子根據(jù)分析肺腺癌樣本和相鄰正常樣本之間基因表達的探針組，確定了具有高度顯著相關性的相關小分子藥物。正值connectivity score評分代表正相關，表示藥物擾動的表達譜與疾病擾動的表達譜正相關，即藥物可以引起或者加劇該疾病狀態(tài)；負值connectivity score評分代表負相關，表示藥物擾動的表達譜與疾病擾動的表達譜負相關，即藥物能夠減輕甚至逆轉該疾病狀態(tài)。根據(jù)該策略，本研究以負相關評分connectivity score＜－0.9為條件，篩選得到10個候選小分子（表3），按照負性富集關聯(lián)系數(shù)由高到低依次為洛貝林、芐普地爾、莫西賽利、蓽茇酰胺、碘化丙啶、奎尼卡因、氯丙嗪、酞氨西林、掌葉防己堿、羅利環(huán)素。

表3 CMAP分析結果

3 討論

肺腺癌是最常見的肺癌類型，約占所有肺癌病例的40%［11］。肺腺癌是最具侵襲性的腫瘤類型之一，確診時往往已至晚期，患者常需接受放射治療、化學治療及靶向治療等輔助治療。但是，肺腺癌對常規(guī)放射療法和化學療法耐藥性高，這是其治療的主要挑戰(zhàn)，因此發(fā)掘新的肺腺癌治療藥物及方法非常重要。本研究通過比較GEO數(shù)據(jù)集中肺腺癌組織與癌旁正常肺組織的差異基因表達譜數(shù)據(jù)，結合CMAP數(shù)據(jù)庫和生物信息學方法，篩選對肺腺癌基因表達具有抑制作用的小分子化合物。通過藥物重定位策略拓展小分子藥物的適用范圍，為候選藥物下一步的體外、體內(nèi)和臨床試驗提供基礎。藥物重定位是近年來逐漸興起的一種新的研發(fā)思路，即“老藥新用”，挖掘已知藥物的新用途。該策略可大幅度降低研制新藥的時間和經(jīng)濟成本，尤其適用于對于研究經(jīng)費有限的罕見病藥物的開發(fā)以及需要緊急研發(fā)藥物的情況等，如近年來新型冠狀病毒肺炎的治療，就多次用到這一策略［12－13］。

本研究最終篩選出的小分子藥物有洛貝林、芐普地爾、莫西賽利、蓽茇酰胺、碘化丙啶、奎尼卡因、氯丙嗪等。洛貝林為一種中樞興奮藥，可選擇性刺激頸動脈體化學感受器，提高呼吸和血管運動中樞的興奮性，常用于治療各類窒息和呼吸衰竭等，不良反應少，安全范圍廣。其可能利用MAPKs途徑以及抗氧化酶AOEs活性來減輕脂多糖誘導的非特異性肺部炎癥，從而發(fā)揮緩解極性肺損傷的作用［14］?；诖耍茰y洛貝林可能通過核因子κB（nuclear factor kappa－B，NF－κB）信號通路和氧化應激反應，緩解肺癌組織微環(huán)境的免疫炎癥，進而發(fā)揮抗肺腺癌的作用。芐普地爾是一種長效、非選擇性的鈣通道阻滯劑，曾被用作抗心絞痛治療藥物［15］。通過數(shù)據(jù)庫檢索，發(fā)現(xiàn)芐普地爾存在多個靶基因，CRK、FGFR4、LAMB1、PIK3R2、CD47、ELANE、HPGD和PRKCB，這些靶基因多與癌癥的發(fā)生發(fā)展及治療相關，因此，有望成為肺腺癌又一候選治療藥物［16］。蓽茇酰胺為PI3K抑制劑，受其負向調(diào)節(jié)的基因主要與免疫、細胞應激、Toll樣受體信號通路、補體系統(tǒng)、NF－κB信號通路和PI3K－Akt信號通路有關［17］，據(jù)此推測蓽茇酰胺在治療肺腺癌方面具有一定的潛力，但該結論仍需要更深層次的實驗驗證。氯丙嗪是一種多巴胺受體阻斷劑，為常用的抗精神病藥物。有研究表明，其對肺腺癌A549細胞的增殖、侵襲、遷移具有顯著的抑制作用，且該種作用呈劑量依賴性［18］。另有報道稱氯丙嗪與抗感染藥物戊雙瞇聯(lián)合使用，能有效抑制腫瘤細胞增殖，其可能的機制是氯丙嗪是有絲分裂驅動蛋白KSP／Eg5的特異性抑制劑，通過有絲分裂阻滯和單極紡錘體的積累抑制腫瘤細胞的增殖［19］。具體的分子機制仍需進一步的實驗研究。藥物重定位策略目前越來越被科研人員和制藥公司所重視，可通過數(shù)據(jù)庫、人工智能和實驗等多種方法來識別可重復利用的候選藥物，但是其后續(xù)的臨床應用仍面臨重大技術挑戰(zhàn)，相關的政策要求和監(jiān)管措施也需同步落實［20］。

綜上所述，本研究利用3個肺腺癌基因表達譜數(shù)據(jù)集，通過生物信息學的方法篩選出差異表達基因，根據(jù)此特征結合CMAP數(shù)據(jù)庫篩選出具有肺腺癌治療潛力的小分子藥物，進一步的文獻分析驗證了該方法的可靠性，為肺腺癌的治療提供了新的可能，為下一步的體內(nèi)體外實驗奠定基礎。