鄭坤明

(1. 福建中檢華日食品安全檢測(cè)有限公司，福州 350028；2. 貴州大學(xué) 精細(xì)化工研究開發(fā)中心，綠色農(nóng)藥與農(nóng)業(yè)生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地和教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550025)

中藥材水蛭H i r u d o 為水蛭科動(dòng)物螞蟥Whitmania pigraWhitman、水蛭Hirudo nipponicaWhitman 或柳葉螞蟥Whitmania acranulataWhitman 的干燥體[1]。目前，關(guān)于中藥材中農(nóng)藥殘留檢測(cè)的前處理方法多采用液-液萃取、固相萃取、凝膠滲透色譜等[2-5]。這些方法需要特殊的設(shè)備、大量的溶劑，且前處理繁瑣、成本較高，從而限制了中藥材中農(nóng)藥痕量分析的快速檢測(cè)。QuEChERS 方法自從2003 年被Anastassiades等[6]建立以來，因?yàn)槠渚哂锌焖?、?jiǎn)便、廉價(jià)、有效、耐用、安全等特點(diǎn)而成為農(nóng)藥殘留檢測(cè)的熱點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于食品中農(nóng)獸藥的殘留檢測(cè)。經(jīng)后期改進(jìn)，美國和歐洲標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)已將QuEChERS方法作為官方分析方法[7]。針對(duì)中藥材中農(nóng)藥殘留檢測(cè)方法多采用氣相色譜法[8-9]、氣相色譜 -質(zhì)譜法[10-11]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[12]，這些方法檢測(cè)對(duì)象主要是植物源性中藥材，而采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)動(dòng)物源性中藥材中農(nóng)藥多殘留的方法尚未見報(bào)道。目前《中國藥典》中尚無關(guān)于水蛭中農(nóng)藥殘留的測(cè)定方法，而文獻(xiàn)報(bào)道主要集中在有機(jī)氯類農(nóng)藥，其采取的凈化手段主要有固相萃取和磺化，檢測(cè)儀器為氣相色譜[13-15]。這些方法研究的對(duì)象比較單一、前處理復(fù)雜、采用的氣相色譜抗干擾性差、易出現(xiàn)假陽性的概率，且無法同時(shí)檢測(cè)不同類別的農(nóng)藥。本文選取稻田中常用的農(nóng)藥，利用改進(jìn)的QuEChERS 凈化技術(shù)，同時(shí)結(jié)合串聯(lián)質(zhì)譜儀選擇性高、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)，建立了QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GCMS/MS)同時(shí)測(cè)定中藥材水蛭中73 種農(nóng)藥殘留的分析方法，旨在為水蛭中農(nóng)藥多殘留的快速檢測(cè)提供實(shí)用性分析技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑、材料

Agilent 8890-7000D 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(安捷倫科技有限公司 )；低速離心機(jī)(德國Sigma 公司)；MTV-100 型多管漩渦混合儀(杭州奧勝儀器有限公司)；QL-901 型渦旋混合器(江蘇海門市麒麟醫(yī)用儀器廠)；TGL-20B 型臺(tái)式高速離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)。73 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品均購自德國Dr. Ehrenstorfer 公司；乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA，安譜科技有限公司)；十八烷基鍵合硅膠(C18，安譜科技有限公司)；所用的試劑均為分析純或色譜純；試驗(yàn)用水為三重過濾去離子水。

水蛭為福州市各藥店抽檢樣品(主要來源于湖南、安徽、江蘇)。

1.2 樣品前處理

稱取500 g 水蛭樣品，粉碎，過450 μm 篩，準(zhǔn)確稱取5 g (精確至0.01 g)于50 mL 聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 超純水渦旋30 s 后浸泡30 min，加入10 mL 的V(1%乙酸) :V(乙腈) =1 : 99溶液、1 g 氯化鈉、5 g 無水硫酸鎂、1.5 g 乙酸鈉及1 顆陶瓷均質(zhì)子，劇烈振蕩2 min，于4 000 r/min 下離心5 min；取5 mL 上清液于10 mL 離心管(150 mg PSA、150 mg C18，500 mg 無水硫酸鎂)中，渦旋振蕩2 min，于15000 r/min 下離心5 min；取2 mL 上清液氮吹干后，用1 mLV(丙酮) :V(正己烷) = 1 : 1 溶液復(fù)溶，待測(cè)。

1.3 GC-MS/MS 儀器檢測(cè)條件

色譜條件：HP-5 MS 色譜柱(Agilent，30 m ×250 μm, 0.25 μm)；載氣為高純氦氣(純度≥99.999%)；進(jìn)樣口溫度280 ℃；進(jìn)樣量1μL；脈沖不分流進(jìn)樣；流速2.0 mL/min；程序升溫：60 ℃保持1 min，以20 ℃/min 升溫至140 ℃，再以15 ℃/min 升溫至250 ℃，最后以20 ℃/min 升溫至300 ℃保持5 min。

質(zhì)譜條件：帶拉出極的電子轟擊離子源(Xtr-EI)；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；傳輸線溫度280 ℃；碰撞氣為高純氮?dú)?純度 ≥ 99.999%)；淬滅氣為高純氦氣(純度≥ 99.999%)；溶劑延遲時(shí)間5.0 min；動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(dMRM)。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的73 種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用丙酮溶解，配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于?18 ℃保存。分別吸取不同體積的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用丙酮稀釋，配制成10 mg/L 的73 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，于?18 ℃保存。

基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：按照 1.2 節(jié)的方法提取樣品，得到水蛭空白樣品提取液。用水蛭空白樣品提取液稀釋73 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，配制成10.0、50.0、100、200、400 和500 μg/L 的系列基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3 的條件進(jìn)行檢測(cè)。以其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L)，定量離子峰面積為縱坐標(biāo)(y) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以3 倍信噪比計(jì)算73 種農(nóng)藥在基質(zhì)中的檢出限(LOD)，以最小添加水平為定量限(LOQ)。

1.5 基質(zhì)效應(yīng)

對(duì)于GC-MS/MS 來說，基質(zhì)可降低進(jìn)樣口色譜柱等部位的活性位點(diǎn)的活性，減少了待測(cè)物與該活性位點(diǎn)的結(jié)合，使待測(cè)物可順利通過氣相色譜色譜系統(tǒng)到達(dá)檢測(cè)器，從而減少了拖尾和降解的情況，因此表現(xiàn)出基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)[16]。此外，基質(zhì)成分和農(nóng)藥結(jié)構(gòu)的差異也會(huì)導(dǎo)致基質(zhì)效應(yīng)的不同。本研究中按公式(1)計(jì)算基質(zhì)效應(yīng) (Me) ，當(dāng)Me在?20% 和20% 之間可以忽略基質(zhì)效應(yīng)的存在，否則不可忽略基質(zhì)效應(yīng)[17]。

式中，A1為水蛭基質(zhì)的峰面積，A2為標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜與質(zhì)譜檢測(cè)條件的優(yōu)化

本文考察了DB-1701 MS 和HP-5 MS 兩種色譜柱分析目標(biāo)物的情況。結(jié)果表明：部分農(nóng)藥在DB-1701 MS 上的分離度不如在HP-5 MS 上的(如苯醚甲環(huán)唑)，故采用HP-5 MS 作為分離目標(biāo)物的色譜柱。

關(guān)于三重四極桿的質(zhì)譜條件一般包括母離子、子離子及其碰撞能的參數(shù)。取73 種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液自動(dòng)進(jìn)樣，設(shè)置掃描范圍m/z50～700進(jìn)行MS1 全掃描，使用Agilent 提供的NIST17標(biāo)準(zhǔn)譜庫進(jìn)行確證目標(biāo)物的保留時(shí)間，利用自動(dòng)優(yōu)化軟件自行優(yōu)化，確定特征離子碎片和碰撞能量。優(yōu)化后的73 種農(nóng)藥的定量離子、定性離子及碰撞能量結(jié)果見表1，在動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式掃描下的總離子流圖如圖1 所示。

圖1 73 種農(nóng)藥的總離子流圖(0.05 mg/L)Fig. 1 Total ion chromatogram of 73 pesticides (0.05 mg/L)

表1 73 種農(nóng)藥質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass spectrum acquisition parameters of 73 pesticides

2.2 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.2.1 樣品加水量的優(yōu)化 為提高水蛭的浸潤(rùn)性并減少極性物質(zhì)對(duì)目標(biāo)物的干擾，加入適量水浸泡水蛭樣品?？疾炝朔謩e向5 g 水蛭中加入5、10、15 和20 mL 水浸泡對(duì)待測(cè)物回收率的影響。結(jié)果表明：隨加水量增加，農(nóng)藥回收率呈先升高后降低的趨勢(shì)變化，當(dāng)加水量為10 mL 時(shí)，大部分農(nóng)藥的回收率在70%～110% 之間，因此選定5 g 水蛭中加水量為10 mL。

2.2.2 提取溶劑的選擇 乙腈不僅適用極性范圍相對(duì)廣泛的農(nóng)藥且以飽和鹽析效應(yīng)加入氯化鈉促使水相和有機(jī)相分層，不用后期進(jìn)行除水[18-20]。參照AOAC 提取方法，向含體積分?jǐn)?shù)為1%乙酸的乙腈溶液中加入1.5 g 乙酸鈉作為緩沖體系，可以使提取溶液的pH 值在5.5～6.0 之間。結(jié)果表明：?jiǎn)渭円砸译孀鳛樘崛∪軇r(shí)，異菌脲等農(nóng)藥在水蛭中的回收率較低，但加入緩沖體系時(shí)，所有農(nóng)藥的回收率均能滿足要求，故選擇提取溶劑為[V(乙酸) :V(乙腈) = 1 : 99]和1.5 g 乙酸鈉緩沖溶液。

2.2.3 凈化劑的選擇 傳統(tǒng)的QuEChERS 吸附劑常用的凈化劑有PSA、GCB、C18和MgSO4。PSA 可用于除去樣品中的有機(jī)酸、脂肪酸和糖類等物質(zhì)從而減少基質(zhì)效應(yīng)，但對(duì)含羥基、氨基、巰基等官能團(tuán)的農(nóng)藥會(huì)因形成氫鍵作用導(dǎo)致提取效率偏低[21]，而作為含有長(zhǎng)烷基鏈的C18，對(duì)脂溶性農(nóng)藥和蛋白質(zhì)有一定的吸附作用[22]，故在水蛭中加入適量PSA 和C18可以減小干擾物對(duì)分析結(jié)果準(zhǔn)確度的影響。水蛭的主要成分是脂肪酸和蛋白質(zhì)，色素較少，故本研究不考慮用GCB 進(jìn)行凈化。在其他條件不變的情況下，向水蛭空白基質(zhì)中加入0.04 mg/kg 的73 種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以73 種農(nóng)藥添加回收率(試驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值)在70%～110%之間的農(nóng)藥個(gè)數(shù)來衡量試驗(yàn)結(jié)果，分別考察了50、100、150、200 和250 mg 的PSA 和C18對(duì)提取效率的影響。結(jié)果表明(圖2)：隨著PSA 用量的增加，處于70%～110%之間的農(nóng)藥個(gè)數(shù)隨之增加，但超過200 mg 時(shí)，提取液的顏色逐漸變淺，回收率在70%～110%之間的農(nóng)藥個(gè)數(shù)也有所下降，這可能與PSA 含有兩個(gè)氨基使其呈堿性，對(duì)部分具有酸性基團(tuán)的有機(jī)磷農(nóng)藥有一定吸附有關(guān)。同樣地，隨C18用量的增加，回收率在70%～110% 的農(nóng)藥個(gè)數(shù)也增加，但過多的C18會(huì)吸附部分脂溶性農(nóng)藥，導(dǎo)致回收率在70%～110%的農(nóng)藥個(gè)數(shù)也有所下降。當(dāng)PSA 和C18的用量均為100 mg 時(shí)，所有農(nóng)藥雖可滿足檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的要求，但用量增加到150 mg 時(shí)，回收率處于70%～110%的農(nóng)藥數(shù)量更多，故選用150 mg PSA和150 mg C18作為凈化劑。

圖2 不同吸附劑組成對(duì)提取回收率(70%～110%)的影響Fig. 2 Recoveries (70%-110%) of pesticides using different amounts of sorbents in the purification process

2.2.4 復(fù)溶溶劑的優(yōu)化 對(duì)于氣相質(zhì)譜來說，一般采用易揮發(fā)的溶劑作為復(fù)溶溶液，因?yàn)橐译鎸?duì)弱極性的色譜柱有一定的傷害性且其沸點(diǎn)較高，在程序升溫時(shí)需較高的初始溫度，最終導(dǎo)致試驗(yàn)的重復(fù)性較差，所以須對(duì)復(fù)溶溶液進(jìn)行轉(zhuǎn)換。考察了沸點(diǎn)相對(duì)較低的乙酸乙酯、丙酮、V(丙酮) :V(正己烷) = 1 : 1 分別作為復(fù)溶溶液對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響。結(jié)果表明(圖3)：當(dāng)采用V(丙酮) :V(正己烷) = 1 : 1 進(jìn)行復(fù)溶時(shí)，溶解出來的雜質(zhì)較少。而用乙酸乙酯和丙酮復(fù)溶時(shí)，溶解出來的雜質(zhì)較多，對(duì)儀器會(huì)造成污染。故用V(丙酮) :V(正己烷) = 1 : 1 作為復(fù)溶溶液。

圖3 3 種復(fù)溶溶劑對(duì)水蛭空白樣品的全掃描總離子流色譜圖Fig. 3 The full scan total ion current chromatograms of the blank Hirudo sample in three different solvents

2.3 方法評(píng)價(jià)

2.3.1 方法的線性范圍、檢出限、定量限與基質(zhì)效應(yīng) 結(jié)果顯示，在10.0～500 μg/L 范圍內(nèi)，73種農(nóng)藥的質(zhì)量濃度與其峰面積間呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)(r)均 > 0.99，73 種農(nóng)藥的檢出限為0.001～0.008 mg/kg，定量限為0.02 mg/kg。73 種農(nóng)藥中，部分有機(jī)磷農(nóng)藥表現(xiàn)出輕微的基質(zhì)效應(yīng)(0.7～20.3)，水胺硫磷、對(duì)硫磷和殺螟硫磷等7 種有機(jī)磷農(nóng)藥表現(xiàn)為中等增強(qiáng)基質(zhì)效應(yīng)(22.4～38.4)，倍硫磷及其代謝物倍硫磷砜和倍硫磷亞砜表現(xiàn)為基質(zhì)抑制效應(yīng)(?27.6～?39.8)，而菊酯類農(nóng)藥如高效氯氟氰菊酯、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯等存在基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)(28.4～102.9) (表2)。因此本研究采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析，以提高分析結(jié)果的正確度和精密度。

2.3.2 方法的正確度與精密度 往水蛭空白樣品中添加0.02、0.04 和0.2 mg/kg 3 個(gè)水平的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)水平重復(fù)6 次，按優(yōu)化后的條件測(cè)定，結(jié)果如表2 所示，從中可看出，73 種農(nóng)藥回收率范圍在71%～117%之間，RSD 為1.1%～12%。表明該方法的正確度、精密度較高，可用于測(cè)定樣品中多種農(nóng)藥殘留[23]。

表2 73 種農(nóng)藥在水蛭中的檢出限、平均回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 2 LOD, average recoveries and relative standard deviations(RSD) of 73 pesticides in Hirudo

續(xù)表2Table 2 (Continued)

2.4 實(shí)際樣品的檢測(cè)

從福州市區(qū)大型藥店隨機(jī)抽取20 批市售干燥的水蛭樣品(主要來源于湖南、安徽、江蘇)，應(yīng)用本研究建立的方法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：有3 個(gè)批次樣品中檢出氯氰菊酯，檢出值分別為0.023、0.034 和0.043 mg/kg，1 個(gè)批次樣品中同時(shí)檢出氯氟氰菊酯和溴氰菊酯，檢出值分別為0.028 和0.037 mg/kg，其余農(nóng)藥均未檢出。目前，氯氰菊酯、氯氟氰菊酯和溴氰菊酯在水蛭中暫無MRL，參照GB 2763—2021《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中氯氰菊酯和和氯氟氰菊酯在藥用植物殘留限量分別為2、0.05～2 mg/kg，參照NY 5070—2001《無公害食品 水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》中溴氰菊酯限量要求不超過0.1 mg/kg，水蛭樣品均未超標(biāo)。菊酯的檢出說明水蛭在人工養(yǎng)殖過程中可能由于土壤和水質(zhì)受到污染，導(dǎo)致其在水蛭體內(nèi)富集。因此建議加強(qiáng)對(duì)中藥材水蛭中農(nóng)藥殘留的監(jiān)測(cè)，以便于中藥材安全使用和管理。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)樣品前處理方法和色譜-質(zhì)譜條件的篩選與優(yōu)化，建立了中藥材水蛭中73 種農(nóng)藥殘留量的QuEChERS-氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)方法。樣品用V(乙酸) :V(乙腈) = 1 : 99 和1.5 g 乙酸鈉溶液作為緩沖體系提取后，采用優(yōu)化后的QuEChERS 方法進(jìn)行凈化，并在GC-MS/MS 的帶拉出極的電子轟擊離子源和動(dòng)態(tài)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下檢測(cè)，用基質(zhì)匹配外標(biāo)法定量。73 種農(nóng)藥的LOD 為0.001～0.008 mg/kg，LOQ 為0.02 mg/kg；在0.02、0.04 和0.2 mg/kg 添加水平下，73 種農(nóng)藥在水蛭中的回收率在71%～117%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.1%～12%之間。該方法簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確、靈敏度高、實(shí)用性強(qiáng)，符合殘留檢測(cè)的要求，適用于中藥材水蛭中73 種農(nóng)藥殘留量的快速檢測(cè)。