宋應(yīng)周，孟松峰

肝細(xì)胞癌在全球肝臟惡性腫瘤中發(fā)病率呈上升趨勢，已成為癌癥死亡的第二大誘因［1］。乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒慢性感染、肝硬化、酒精性肝病和黃曲霉毒素等造成了肝細(xì)胞癌的高發(fā)病率［2-4］。然而，促進(jìn)肝癌發(fā)病機(jī)制仍不清楚。在肝細(xì)胞癌發(fā)生過程中，細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的改變可能與癌癥形成密切相關(guān)［5］。細(xì)胞分裂周期基因20（CDC20）是細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的調(diào)節(jié)劑，與細(xì)胞周期后期中復(fù)合物/環(huán)體相互作用的調(diào)節(jié)蛋白和有絲分裂相關(guān)［6］。CDC20可與APC結(jié)合并在有絲分裂和G1期激活細(xì)胞周期蛋白的泛素化活性，促進(jìn)細(xì)胞增殖［7］。CDC20可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制惡性轉(zhuǎn)化［8］。研究表明，多種癌癥中CDC20的高表達(dá)，與腫瘤的增殖、侵襲及不良預(yù)后有關(guān)［9-12］。然而，CDC20在肝細(xì)胞癌中的研究較少，該研究通過檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20的水平，分析CDC20的表達(dá)與病人臨床病理特征的關(guān)系及對預(yù)后的影響，為肝細(xì)胞癌的預(yù)后判斷提供參考。

1 資料與方法

1.1一般資料收集2016年5月至2017年12月在商丘市第三人民醫(yī)院行手術(shù)治療的肝細(xì)胞癌病人146例，男115例，女31例，年齡范圍為38～62歲，收集病人的臨床資料。收集手術(shù)切除的肝細(xì)胞癌組織及對應(yīng)的癌旁組織，放置于?80℃超低溫冰箱中。術(shù)后采用電話的方式定期隨訪，最短隨訪時間5個月，最長隨訪時間36個月，隨訪截止日期為2020年12月1日，146例的臨床資料及隨訪資料完整。該研究經(jīng)商丘市第三人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)（20160412），病人或其近親屬同意并簽署知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1實(shí)時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR） qRT-PCR檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20mRNA的表達(dá)。組織中的總RNA根據(jù)Trizol試劑盒進(jìn)行提取。提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cD‐NA），進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。CDC20正向引物序列5′-TCGAAGTCACTCGGTAGCGT-3′，反向引物序列5′-GATCCTGCATACTGCTTGCA-3′；U6正向引物序 列5′-GGCCTCATCCTCATCATGGCAGUAG-3′，反向引物序列5′-AGCCAGATGCCTAGCGACGTGC‐GC-3′?？偡磻?yīng)體系為20μL，反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個循環(huán)。以管家基因U6 mRNA水平作為內(nèi)參照，采用2?ΔΔCt法計算CDC20 mRNA的相對表達(dá)水平。

1.2.2蛋白質(zhì)印跡法 蛋白質(zhì)印跡法檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20的表達(dá)。取組織中的總蛋白，根據(jù)BCA蛋白定量試劑盒取30μg的蛋白，行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），將電泳凝膠上的蛋白濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，PVDF膜放置含有1%BSA的盒子中，孵育2 h、之后經(jīng)過一抗孵育（1∶1 000稀釋，4℃過夜）、TBST洗滌3次、二抗孵育（1∶4 000稀釋，室溫1 h）、TBST洗滌3次后，在PVDF膜上滴加適量化學(xué)發(fā)光顯色液，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，根據(jù)灰度值估測CDC20蛋白表達(dá)水平。

1.2.3免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn) 免疫組織化學(xué)檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20的表達(dá)。切制冷凍切片，經(jīng)過脫蠟和梯度乙醇水化處理后，利用PV6000法染色，加入3%過氧化氫滅活內(nèi)源性過氧化物酶。置于修復(fù)液中，加熱行抗原進(jìn)行修復(fù)，然后放置室溫自然冷卻。經(jīng)封閉后，滴加一抗（1∶200），置于4℃冰箱孵育過夜。利用磷酸緩沖鹽溶液（PBS）沖洗，滴加相應(yīng)種屬二抗（1∶400），室溫下孵育60 min，并用PBS進(jìn)行3遍沖洗。滴加新鮮配制的顯色液，利用蘇木素染料復(fù)染，中性樹膠封固，最后置于顯微鏡下觀察。染色強(qiáng)度評分：強(qiáng)陽性、中等陽性、弱陽性和陰性評分分別為3分、2分、1分和0分，陽性細(xì)胞數(shù)的評分：>75%～100%、>50%～75%、>25%～50%、5%～25%和<5%評分分別為4分、3分、2分、1分和0分，染色強(qiáng)度評分和陽性細(xì)胞數(shù)的評分的乘積即為總分，0～7分為低水平，8～12分為高水平。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用SPSS 21.0軟件行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用配對t檢驗(yàn)；計數(shù)資料以例（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間的兩兩比較檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.016；采用Kaplan-Meier法繪制疾病無進(jìn)展生存率和總生存率曲線，log-rank檢驗(yàn)比較不同組間的生存率。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1qRT-PCR檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20mRNA的表達(dá)CDC20 mRNA在肝細(xì)胞癌組織表達(dá)水平（2.33±0.67）高于對應(yīng)的癌旁組織（0.97±0.29）（t=5.95，P<0.001）。

2.2蛋白質(zhì)印跡法檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20的表達(dá)CDC20蛋白在肝細(xì)胞癌組織中相對表達(dá)水平（0.91±0.05）高于對應(yīng)的癌旁組織（0.14±0.05）（t=34.30，P<0.001）。

2.3免疫組織化學(xué)檢測肝細(xì)胞癌組織中CDC20的表達(dá)CDC20在肝細(xì)胞癌陽性表達(dá)率（77.4%，113/146）高于對應(yīng)癌旁組織（8.2%，12/146），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=142.69，P<0.001）。見圖1（僅展示3例病人的結(jié)果）。

圖1 細(xì)胞分裂周期基因 20（CDC20）在3例肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況（免疫組織化學(xué)×200）

2.4CDC20表達(dá)與病人臨床病理特征的關(guān)系CDC20的表達(dá)與病人的腫瘤長徑、被膜侵犯、脈管侵犯、腫瘤多發(fā)、分化程度和TNM分期有關(guān)（P<0.05），見表1。

表1 細(xì)胞分裂周期基因20（CDC20）表達(dá)水平與肝細(xì)胞癌病人臨床病理特征的關(guān)系/例（%）

2.5CDC20表達(dá)對病人術(shù)后生存率的影響CDC20高水平組總生存率為（61.7%）和疾病無進(jìn)展生存率（50.0%）均低于CDC20低水平組（87.2%、69.8%）（log-rankχ2=14.19，P<0.001；log-rankχ2=9.61，P=0.005）。

3 討論

肝細(xì)胞癌是常見的惡性腫瘤，在過去的20年中，觀察到與肝細(xì)胞癌相關(guān)的年死亡率顯著增加［13-14］。此外，根據(jù)美國國立癌癥研究所“監(jiān)測、流行病學(xué)和結(jié)果數(shù)據(jù)庫”SEER注冊機(jī)構(gòu)項目研究，到2030年肝細(xì)胞癌的發(fā)病率將繼續(xù)上升［15］。準(zhǔn)確估計預(yù)后，在肝細(xì)胞癌治療中起著至關(guān)重要的作用。尋找預(yù)測肝細(xì)胞癌預(yù)后的生物標(biāo)志物具有重要的臨床價值。許多CDC20底物都參與有絲分裂過程，包括細(xì)胞周期蛋白B1、細(xì)胞周期蛋白A、分離酶抑制蛋白（Securin）、雙能蛋白（Geminin）和周期素依賴激酶抑制劑p21（P21）［16］。最近，越來越多的研究顯示CDC20在人類癌癥中起致癌作用，在多種人類腫瘤中觀察到CDC20的過度表達(dá)，與生存率降低有關(guān)［17］。

CDC20在結(jié)直腸癌、乳腺癌、前列腺癌和胃癌中的表達(dá)均增加［9-12］，在該研究中，肝細(xì)胞癌組織中CDC20 mRNA和蛋白質(zhì)水平均高于癌旁組織，提示CDC20促進(jìn)肝細(xì)胞癌的發(fā)生發(fā)展。目前多項研究顯示，CDC20高水平參與多種腫瘤的進(jìn)展，例如Kim等［12］研究顯示，CDC20在腸化生、低度不典型增生、高度不典型增生和早期胃癌中的表達(dá)明顯高于正常黏膜，且在高度不典型增生中的表達(dá)水平最高，且CDC20過表達(dá)與胃癌病人的年齡、腸道組織學(xué)、較低的腫瘤-淋巴結(jié)-轉(zhuǎn)移階段以及較長的無復(fù)發(fā)生存期和癌癥特異性生存期相關(guān)。CDC20與前列腺癌的惡性進(jìn)展相關(guān)，CDC20高水平病人更具侵略性的臨床病理特征和不良預(yù)后［11］。Li等［18］證明了膀胱尿路上皮癌病例中CDC20升高，而CDC20高水平與病人的無復(fù)發(fā)生存期較短和總體生存期較差相關(guān)。該研究中，CDC20在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平與腫瘤長徑、被膜侵犯、脈管侵犯、腫瘤多發(fā)、分化程度和TNM分期有關(guān)，說明在腫瘤長徑、被膜侵犯、脈管侵犯、腫瘤多發(fā)分化程度低和TNM晚期的病人中CDC20的表達(dá)水平更高。提示CDC20可能與肝細(xì)胞癌的增殖與侵襲有關(guān)，CDC20高水平的肝細(xì)胞癌病人具有較強(qiáng)的增殖活性和更強(qiáng)的侵襲能力，與肝細(xì)胞癌的發(fā)展密切相關(guān)。在該研究中，CDC20高水平病人的術(shù)后3年總生存率和疾病無進(jìn)展生存率均較低，提示CDC20有可能成為評價肝細(xì)胞癌預(yù)后的有效標(biāo)志物。CDC20促進(jìn)肝細(xì)胞癌的進(jìn)展，其失活可能對治療肝細(xì)胞癌有一定療效。目前已發(fā)現(xiàn)幾種CDC20抑制劑，例如類毒素-抗毒素混合物酯酶、pro-TAME和2-［芐基-（2-硝基-苯磺?；?氨基］-N-羥基-3-甲基-N-丙基-丁酰胺［19-20］。對CDC20抑制劑的研究可能有助于闡明CDC20在人類癌癥中的作用機(jī)制，這也是后期該研究的方向之一。

綜上所述，CDC20在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)水平增加，可能參與腫瘤的增殖和侵襲。CDC20高水平預(yù)示病人的預(yù)后不良，有望成為判斷肝細(xì)胞癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。