崔玉晶，高佩，文娟，OKYERE Kumi Samuel，胡延春

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

紫莖澤蘭（Ageratina adenophora），是一種多年生菊科植物，原產(chǎn)于墨西哥和哥斯達黎加，現(xiàn)已入侵至歐洲、大洋洲和亞洲等地［1?2］，1940年從中緬邊境傳入云南［3］，現(xiàn)已廣泛傳播到四川、西藏等地，是我國最重要的入侵植物物種之一，對我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展造成了極大的危害［4］。紫莖澤蘭對羊、大鼠、小鼠等多種動物有很高的毒性，可造成不同動物組織器官的毒性損傷和炎性反應(yīng)，研究已證實紫莖澤蘭可使動物發(fā)生肝臟、脾臟等實質(zhì)臟器的損傷［5］，能夠通過氧化損傷、激活炎癥反應(yīng)損傷器官結(jié)構(gòu)與激活免疫應(yīng)答［6］，但目前仍無紫莖澤蘭對腸道影響的報道。因此本研究以SD 大鼠為試驗對象，對采食紫莖澤蘭的大鼠腸道結(jié)構(gòu)及黏膜免疫的損傷進行探究，旨在為紫莖澤蘭對動物機體致毒性提供一定的參考與理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 飼料制備與飼養(yǎng)管理

紫莖澤蘭葉片于2019年7月采集自四川省西昌市，將葉片清洗后晾干，用CW700 研磨機研磨成粉末，再經(jīng)0.425 mm 網(wǎng)篩過篩后得到紫莖澤蘭草粉，將草粉存放于陰涼干燥處。標準大鼠粉末飼料購自成都達碩試驗動物有限公司。飼料制備參考自Kaushal 等［7］及本試驗室前期試驗［8?9］和預(yù)試驗結(jié)果，即將紫莖澤蘭草粉與標準大鼠粉末飼料按3∶7 的比例加水混合均勻，制作成直徑1 cm 圓柱形顆粒狀飼料，60 ℃烘干，此為含有30%紫莖澤蘭草粉飼料，另按相同的方式用標準大鼠粉末飼料制作不含紫莖澤蘭草粉飼料。

試驗使用16 只7 周齡雄性SD 大鼠，體重（200±25）g，采購自成都達碩試驗動物有限公司［生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2015-030；使用許可證號：SYXK（川）2014-187］，飼養(yǎng)于四川農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗動物房，維持飼養(yǎng)條件在室溫22～25 ℃，相對濕度40%～60%，日夜光照12 h 交替。經(jīng)適應(yīng)性飼喂7 d 后將大鼠隨機分為對照組和試驗組（n=8），對照組飼喂0%紫莖澤蘭草粉飼料（10 g·100 g?1BW），試驗組飼喂30%紫莖澤蘭草粉飼料（10 g·100 g?1BW），自由飲水，飼養(yǎng)周期為14 d。

1.2 樣品采集

將各組大鼠禁食12 h，用乙醚充分麻醉后頸椎脫臼法處死大鼠，立即剖檢，分離腸系膜與脂肪組織，完整的取出腸道，放在盛有預(yù)冷PBS（phosphate buffered saline，PBS）平皿中采集各腸段：在距幽門2～3 cm 處采集十二指腸樣本，在空腸中段采集空腸樣本，在距回腸末端2～3 cm 處采集回腸樣本，在距盲腸盲端0.5 cm 處采集盲腸樣本，在距肛門8 cm 處采集結(jié)腸樣本，在距肛門1 cm 處采集直腸樣本，將各腸段樣本分為三部分，一部分無須沖洗直接放入10%多聚甲醛中，用于制備石蠟切片；一部分用4 ℃PBS 緩沖液洗去腸內(nèi)容物，用無菌紗布擦干準確稱量0.1 g，制備為10%組織勻漿；最后一部分（約50 mg）迅速放入液氮中速凍，用以組織RNA 提取。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 HE 染色及組織病理學(xué)觀察 取制備好的石蠟切片按照制造商說明書進行HE（hematoxylin-eosin staining，HE）染色（武漢塞維爾，G1001），用OLYMPUS 玻片掃描系統(tǒng)掃描HE 切片全片，儲存圖像備用，用OlyVIA 軟件將對照組與試驗組各腸段圖像進行比較，分析其病理變化。

1.3.2 組織學(xué)評分 參照Appleyard 等［10］的方法對各腸段進行病理損傷組織學(xué)評分，評分標準見表1。

表1 病理損傷組織學(xué)評分Table 1 Criteria for histological scoring of damage

1.3.3 形態(tài)學(xué)測量 用OlyVIA 軟件查看HE 切片圖像，選取結(jié)構(gòu)層次清晰，均勻染色區(qū)域拍照，用Image Pro Plus 6.0 軟件測量小腸（十二指腸、空腸、回腸）的絨毛高度，隱窩深度。將絨毛尖端到絨毛隱窩交界處的距離記為絨毛高度，相鄰絨毛間的凹陷深度記為隱窩深度［11］，并根據(jù)上述測量結(jié)果計算絨毛高度/隱窩深度。在每腸段3 個重復(fù)中各分析了10 個定向良好延展均勻的隱絨毛單位。

1.3.4 IELs 及LPLs 計數(shù) 用OlyVIA 軟件查看HE 切片圖像，選取結(jié)構(gòu)層次清晰、均勻染色區(qū)域拍照，觀察IELs 和LPLs 的分布與數(shù)量，約94%的上皮淋巴細胞位于小腸上皮基底部［12］，因此以黏膜上皮層為界，參照Moghaddam 計數(shù)方法［13］，每張小腸切片隨機選取5 根腸絨毛，每張大腸切片隨機選取5 個腸腺，用Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)計數(shù)每1 根腸絨毛或每一個腸腺IELs（intestinal intraepithelial lymphocytes，IELs）與LPLs（lamina propria lymphocytes，LPLs）的數(shù)量。

1.3.5 AB?PAS 染色及GCs 計數(shù) 取制備好的石蠟切片按照制造商說明書進行AB?PAS 染色（武漢塞維爾，GP1049），用OLYMPUS 玻片掃描系統(tǒng)掃描全片，儲存圖像后用OlyVIA 軟件選取染色均勻的視野拍照，每張切片在200 下隨機選取5 個視野并拍照，各試驗組與對照組需選取結(jié)構(gòu)相似區(qū)域，用Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統(tǒng)計數(shù)每個視野內(nèi)杯狀細胞（goblet cells，GCs）的數(shù)量。

1.3.6 qRT?PCR 檢測紫莖澤蘭對大鼠腸道黏膜細胞因子相關(guān)基因mRNA 的影響 采用Oligo 7.0軟件對IL-1β、IL-4、TNF-α、IFN-γ和β-actin基因進行特異性引物設(shè)計，并由上海生工生物有限公司合成，引物序列如表2 所示，使用Bio-RAD 實時熒光定量PCR 儀（CFX96）對腸道黏膜中細胞因子的表達進行定量分析，反應(yīng)體系為20 μL：10 μL SYBR Premix Ex Taq（2×），10 μmol·L?1的上下游引物各0.4 μL，1 μL 樣品DNA 以及8.2 μL DEPC 水，PCR 反應(yīng)程序為：95 ℃5 min 后，95 ℃10 s，60 ℃下退火及延伸30 s，40 個循環(huán)，反應(yīng)結(jié)束后用2?ΔΔCt法計算各基因mRNA 的相對表達量。

1.3.7 ELISA 檢測紫莖澤蘭對大鼠腸道黏膜細胞因子分泌量在蛋白水平的影響 將制備好的10%組織勻漿按ELISA 試劑盒說明書（江蘇晶美），對各腸段IL-1β、IL-4、TNF-α 和IFN-γ 進行定量分析，檢測方法參照ELISA試劑盒說明書。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 25.0 統(tǒng)計分析軟件中IndependentT-test 程序進行統(tǒng)計分析，試驗結(jié)果均以“平均值±標準差”（mean±SD）表示，顯著性置于0.05 水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫莖澤蘭對大鼠腸道病理學(xué)損傷

由表3 及圖1A 可知，與對照組相比，十二指腸黏膜層炎性細胞浸潤，腸絨毛出血及頂端輕度壞死脫落；空腸可見少量淋巴細胞浸潤，黏膜下層血管充血擴張，部分絨毛頂端糜爛性壞死甚至脫落，壞死脫落的柱狀細胞細胞核破碎、裂解、變形、散見少量紅細胞；回腸固有層與上皮層炎性細胞浸潤，出現(xiàn)較大面積黏膜層絨毛頂端組織結(jié)構(gòu)破壞，大量腸絨毛頂端凝固性壞死，并伴有出血；盲腸黏膜下層水腫，固有層輕度充血；結(jié)腸肌層增厚，固有層淋巴細胞增多；直腸漿膜水腫，腸腺變短，黏膜層及黏膜下層有大量淋巴細胞浸潤，出現(xiàn)淋巴細胞增生，局部黏膜上皮細胞壞死脫落。

同時對各腸段進行量化評分，試驗組各腸段組織學(xué)評分均極顯著增加（P＜0.01），其中十二指腸評分增加495.23%，空腸評分增加511.36%，回腸評分增加722.36%，盲腸評分增加366.67%，結(jié)腸評分增加436.50%，直腸評分增加976.00%（表3）。

2.2 紫莖澤蘭對大鼠小腸形態(tài)學(xué)的影響

由表4 可知，與對照組相比，采食紫莖澤蘭可使大鼠十二指腸絨毛高度、隱窩深度及其比值極顯著增加（P＜0.01）；使空腸絨毛高度、絨毛高度與隱窩深度比值極顯著增加（P＜0.01），而隱窩深度雖有增加但無顯著性差異（P＞0.05）；使回腸絨毛高度、隱窩深度及其比值極顯著增加（P＜0.01）。其中絨毛損傷以空腸最為顯著，較對照組絨毛高度降低24.72%，隱窩損傷以十二指腸損傷最為嚴重，較對照組隱窩深度增加249.27%。

2.3 IELs、LPLs 和GCs 計數(shù)結(jié)果

由圖1B 和表5 可知，與對照組相比，采食紫莖澤蘭可極顯著增加大鼠各腸段IELs、LPLs 和GCs 數(shù)量（P＜0.01）。小腸以回腸IELs、LPLs 和GCs 增加量變化最大，增加量分別達到125.64%、33.91%和48.19%；而在大腸中結(jié)腸和直腸IELs 與LPLs 增加量最為顯著，其中結(jié)腸IELs 與LPLs 增加量分別為95.65%與59.20%，直腸IELs 與LPLs 增加量分別為93.33%與74.71%，直腸GCs 增加56.73%。

2.4 紫莖澤蘭對大鼠腸道黏膜sIgA 含量的影響

由表6 可知，與對照組相比，采食紫莖澤蘭使大鼠各腸段sIgA 表達量均極顯著增加（P＜0.01）。其中十二指腸、空腸、回腸sIgA 增加量均達到了80%以上，其中空腸增加量最高，達119.11%；而盲腸、結(jié)腸、直腸增加量相對較低，以結(jié)腸sIgA 表達量增加最低，為12.83%。

2.5 腸道黏膜炎性細胞因子表達

由表7 可知，與對照組相比，各腸段促炎因子（IL-1β、IL-2、TNF-α 和IFN-γ）mRNA 表達量和蛋白分泌量均有不同程度的增加，抑炎因子（IL-4、IL-10）mRNA 表達量和蛋白分泌量均有不同程度的減少。其中小腸以空腸和回腸炎性因子顯著增加或減少（P＜0.05），大腸以直腸炎性因子極顯著增加或減少（P＜0.01）。

3 討論

腸道是機體內(nèi)最大的內(nèi)分泌和免疫器官［14］，在維持腸道平衡穩(wěn)態(tài)中有著重要作用，本試驗結(jié)果顯示，飼喂紫莖澤蘭會導(dǎo)致小腸出現(xiàn)以絨毛出血性壞死和糜爛脫落為特征的病理損傷，大腸出現(xiàn)以漿膜水腫，上皮層充血和大量淋巴細胞浸潤為特征的病理損傷，同時對小腸進行形態(tài)學(xué)測量，結(jié)果顯示，小腸絨毛高度極顯著降低，隱窩深度表現(xiàn)不同程度的加深，二者比值均極顯著增加，研究表明，絨毛主要發(fā)揮吸收作用，長度增加則吸收功能增強，反之降低，而隱窩主要發(fā)揮分泌作用，其深度可反映腸上皮細胞成熟率，變深則腸上皮細胞成熟率降低，反之則表明腸上皮細胞成熟率上升，絨毛高度與隱窩深度的比值則綜合反映了腸道的健康狀況，比值下降表明腸道受損［15］。腸道由內(nèi)向外依次為黏膜層、黏膜下層、肌層和漿膜，被分為小腸和大腸，其各自特殊的腸道結(jié)構(gòu)是構(gòu)成腸道物理屏障的重要組成部分［16］，從本試驗結(jié)果來看，紫莖澤蘭可通過損傷腸道組織結(jié)構(gòu)，降低小腸的吸收功能，降低腸上皮細胞成熟率，增加腸上皮的通透性，使腸道機械屏障的完整性被破壞。

腸道免疫系統(tǒng)由多個水平共同構(gòu)成免疫屏障［17］，以抵御病原微生物的入侵，其中腸道免疫細胞及其分泌蛋白在此過程中發(fā)揮著重要作用。研究表明，腸道淋巴細胞的總數(shù)遠超其存在于骨髓、胸腺、脾臟以及淋巴結(jié)中的數(shù)量［18］，腸道內(nèi)淋巴細胞根據(jù)其分布的不同，可分為IELs 和LPLs。IELs 是腸黏膜免疫系統(tǒng)中最先與外來抗原接觸的免疫細胞［19］，是一種快速有效的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)物［20］，可分泌包括IL-2、IL-4、IL-10 及IFN-γ 等多種細胞因子［21?22］，能夠促進腸道上皮細胞再生、保持腸黏膜結(jié)構(gòu)和功能的完整，保護黏膜免受病原菌的侵害［22］。LPLs 參與宿主防御感染、代謝穩(wěn)態(tài)和組織修復(fù)［23］，有助于維持上皮的完整性，并在腸道發(fā)生炎癥反應(yīng)時維持穩(wěn)態(tài)［24?25］。GCs 是一種典型的黏液細胞，胞質(zhì)內(nèi)充滿黏液顆粒，黏液顆粒內(nèi)富含黏蛋白，分泌排出后與水混合可形成黏液，附著在腸黏膜表面，對組織表面起到潤滑和保護作用，PAS 反應(yīng)呈強陽性，因此，GCs 數(shù)量的多少反映了腸黏膜的健康狀況，是腸黏膜異常的一個敏感指標。而sIgA 可阻止病原體在腸黏膜表面粘附，并中和腸毒素，抑制病原在腸黏膜上皮的移動，進而維持腸黏膜上皮的完整，因此sIgA 在腸道免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著核心作用，且腸道黏膜分布著機體約80%的sIgA 細胞［26］，高sIgA 水平通常表明機體正在發(fā)生過度免疫反應(yīng)，提示腸道黏膜免疫的激活，同時sIgA 的分泌也受到輔助性T 細胞分泌的細胞因子調(diào)控，如IL-2、TNF-γ、IL-4 和IL-10 等，都可促進sIgA 的分泌［27］，多種炎性細胞因子可損害腸上皮細胞屏障功能，導(dǎo)致腸黏膜通透性增高。本試驗發(fā)現(xiàn)，飼喂紫莖澤蘭可通過增加各腸段IELs、LPLs 和GCs 數(shù)量，升高黏膜內(nèi)sIgA 水平，表明紫莖澤蘭通過增加免疫細胞的數(shù)量和具有免疫活性的蛋白引起腸道感染或炎癥，從而觸發(fā)過度免疫反應(yīng)表達。

有研究者［28］認為，細胞因子可以通過不同的途徑誘導(dǎo)腸黏膜屏障損傷，且在腸道黏膜屏障發(fā)生損傷時細胞因子會顯著激活免疫反應(yīng)［29］，已證實TNF（tumor necrosis factor，TNF）會使腸道黏膜屏障破壞，且TNF 幾個小時內(nèi)就會導(dǎo)致屏障破壞［30?31］。此外，TNF 可通過誘導(dǎo)MLCK 通路發(fā)揮其調(diào)控屏障功能，而IFN-γ 在腸上皮細胞中也可通過誘導(dǎo)TNFR2 的表達啟動這一調(diào)節(jié)通路［32］，表明多種因子間在調(diào)控腸道黏膜屏障中可相互影響，共同調(diào)控腸道黏膜免疫。IL-1β 和IL-2 是常見的促炎因子，IL-4 和IL-10 是常見的抑炎因子，這些細胞因子在調(diào)控腸道黏膜屏障中也有一定的作用，例如楊華等［33］用大腸桿菌刺激豬腸道上皮細胞發(fā)現(xiàn)細胞中IL-1β、IL-2、IL-6 mRNA 的相對表達水平顯著升高，而IL-10 mRNA 的相對表達水平顯著降低，且在使用丁酸梭菌治療后細胞中IL-1β、IL-2、IL-6 mRNA 的相對表達水平又顯著降低；也有研究表明腸紊亂后IL-1β 表達量增加，IL-4 表達量顯著降低［34］，同時，前期研究結(jié)果顯示，紫莖澤蘭可引起動物機體血清中IL-2 等細胞因子顯著增加，提示全身性炎性反應(yīng)［35］，因此在本試驗中，促炎因子IL-1β，IL-2，TNF-α 和IFN-γ mRNA 水平與蛋白水平的表達量增高，抑炎因子IL-4 和IL-10 mRNA 水平與蛋白水平的表達量降低，表明紫莖澤蘭可引起大鼠腸道炎癥反應(yīng)，并通過調(diào)控細胞因子的分泌，從而激活腸道黏膜免疫，這與宋曉平［36］在有毒植物狼毒（Stellera chamaejasme）中的研究結(jié)果一致，狼毒中總黃酮對胃腸道有刺激作用，可使胃腸道組織結(jié)構(gòu)破壞，腸黏膜功能異常，而紫莖澤蘭是否通過調(diào)控緊密連接或其他調(diào)節(jié)通路增加腸道黏膜通透性還有待進一步的研究。

4 結(jié)論

紫莖澤蘭可使大鼠出現(xiàn)以十二指腸絨毛出血、空腸絨毛頂端糜爛性壞死、回腸絨毛頂端凝固性壞死、盲腸黏膜下層水腫、結(jié)腸淋巴細胞增多、直腸淋巴細胞增生為病理特征的腸道結(jié)構(gòu)損傷，還可不同程度的降低小腸各段絨毛高度、加深隱窩深度、增加絨毛高度/隱窩深度，進一步破壞腸道結(jié)構(gòu)，同時紫莖澤蘭可通過增加各腸段IELs、LPLs、GCs 數(shù)量，升高黏膜內(nèi)sIgA 分泌量，增加促炎因子IL-1β、IL-2、TNF-α 和IFN-γ 表達量，降低抑炎因子IL-4 和IL-10 表達量，從而激活腸道黏膜免疫，揭示紫莖澤蘭對大鼠腸道的毒性損傷作用。