基于β-CD@AuNPs結(jié)合乳酸的汗?jié)撝赣】梢暬芯?/h1>
2022-06-10 06:27范向洋
刑事技術(shù) 2022年3期
黃 銳，范向洋
（1. 西南政法大學(xué)刑事偵查學(xué)院，重慶 401120；2. 重慶高校物證技術(shù)工程技術(shù)研究中心，重慶 401120；3. 重慶市刑事技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 401120）
乳酸（2-羥基丙酸）是人體在一般的新陳代謝和運(yùn)動(dòng)中產(chǎn)生的一種常見的化學(xué)物質(zhì)。血液中乳酸的含量決定了汗液中乳酸的含量[1]，而血液中乳酸的含量一定程度上反映了人體的生理狀況，例如臨床研究表明糖尿病合并高乳酸血癥較常見[2]，且雙胍類降糖藥和小檗堿均可引起血乳酸含量的升高[3]。
Fischer 等 研究發(fā)現(xiàn)癌癥患者血漿中乳酸濃度和癌癥患病程度成正相關(guān)。在多數(shù)刑事案件中我們很難直接獲得血液樣本，但很容易獲得汗?jié)撝赣?。汗液中水含?90 ～ 994 mg/mL，占99% ～ 99.4%，乳酸含量0.6 mg/mL，占0.06%，尿素含量0.2 mg/mL，占0.04%，氨基酸含量0.07 ～ 0.25 mg/mL，占0.007% ～ 0.025%，葡萄糖含量0.056 mg/mL，占0.0056%[5]。很明顯與氨基酸、尿素等有機(jī)物相比乳酸在汗液中的含量是最高的，因此可以通過檢測(cè)汗?jié)撝赣≈械娜樗岷縼黹g接判斷遺留人的身體狀況，為案件偵破提供線索，縮小刑事偵查的范圍。
超分子是由多個(gè)分子通過氫鍵、范德華力、電荷的庫侖作用、π-π共軛等相互作用力而自動(dòng)結(jié)合成的有序、有組織并能選擇性識(shí)別某些離子或基團(tuán)的聚合物[6]。超分子擁有封閉或半封閉的、對(duì)客體分子具有高親和力和高選擇性的配位“空腔”，該空腔可以通過π-π堆積作用、氫鍵、靜電作用、陽離子-π作用、疏水相互作用等與客體形成穩(wěn)定的復(fù)合物[7]。β-環(huán)糊精(β-CD)作為一種著名的分子受體，其疏水腔可與多種有機(jī)、無機(jī)和生物客源分子形成主客體包合物[8-9]。同時(shí)，β-CD具有水溶性和環(huán)保性，有助于提高功能材料的分散性[10-13]。考慮到大環(huán)超分子具有獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，當(dāng)β-CD附著在AuNPs表面時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)一些新的性質(zhì)和相應(yīng)的新應(yīng)用[14]。Du 等[15]曾利用NR-β-CD@AuNPs對(duì)河水中的亞硝酸根離子進(jìn)行痕量檢測(cè)。
本文使用微波加熱方法利用HAuCl4·3H2O和HS-β-CD制備β-CD@AuNPs[15]，首次將其應(yīng)用于汗?jié)撝赣≈卸S形態(tài)以及成分信息的同步可視化診斷，并創(chuàng)新性地將HSV圖像處理技術(shù)應(yīng)用于汗?jié)撝赣∪樗岢煞值臋z測(cè)分析，旨在研發(fā)一種可以實(shí)現(xiàn)對(duì)汗?jié)撝赣《S形態(tài)以及乳酸成分快速定性分析的方法，進(jìn)而在保證對(duì)汗?jié)撝赣《S形態(tài)可視化的前提下，證明對(duì)汗?jié)撝赣〕煞址治隼玫目尚行?，為案件偵破提供更多的線索。本方法操作簡(jiǎn)單，流程快捷，同時(shí)，原材料HAuCl4·3H2O和HS-β-CD價(jià)格相對(duì)不高，具有推廣的可操作性。數(shù)據(jù)化圖像識(shí)別處理旨在通過機(jī)器識(shí)別判斷代替人眼的識(shí)別判斷，使最終結(jié)果更加客觀可靠。
1 基本原理
1.1 β-CD@AuNPs制備和結(jié)合乳酸的原理
如圖1，在微波的高能環(huán)境下，HS-β-CD作為還原劑和穩(wěn)定劑與AuNPs形成Au-S鍵，將HS-β-CD修飾到AuNPs表面，作為支架和受體，通過主客體相互作用實(shí)現(xiàn)光傳感[15]。
AuNPs表面的β-CD作為一種分子受體，可與環(huán)境中的乳酸分子形成主客體包合物，AuNPs作為結(jié)構(gòu)熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中理想的能量受體，在這一過程中將這一主客體包合物形成的信息轉(zhuǎn)換為人肉眼可見的顏色變化，達(dá)到識(shí)別的目的。
1.2 HSV半定量分析原理
HSV色彩空間即色相（hue）、飽和度（saturation）、明度（value），是一種將RGB色彩空間中的點(diǎn)在倒圓錐體中表示的方法，HSV更類似于人類感覺顏色的方式，對(duì)顏色的表達(dá)比RGB更符合人眼觀察，如圖2。色相表示色彩信息，由繞V軸的旋轉(zhuǎn)角給定。范圍是0° ～ 360°，其中紅色是0°，綠色是120°，藍(lán)色是240°，每一種顏色和它的補(bǔ)色相差180°；飽和度為一比值，它表示成所選顏色的純度和該顏色最大的純度之間的比率。飽和度范圍從0到1，所以圓錐頂面的半徑為1，飽和度＝0時(shí)，只有灰度，灰色的飽和度是0%，純粹的顏色比如大紅（255, 0, 0）、青色（0, 255, 255）等等的飽和度是100%；明度表示色彩的明亮程度，范圍從0到1，明度為0%時(shí)為黑色，明度為100%時(shí)為白色，介于0% ～ 100%之間時(shí)，則用來表示各個(gè)顏色的明暗程度，HSV圓錐模型的頂面對(duì)應(yīng)明度為1，頂點(diǎn)對(duì)應(yīng)明度為0[16-17]。
對(duì)指印圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)化識(shí)別的程序是以HSV色彩空間的代碼為主體（其中我們將色相H的范圍從0° ～ 360°轉(zhuǎn)化為0 ～ 50），結(jié)合了相關(guān)統(tǒng)計(jì)歸納代碼。將指印圖像輸入程序后，程序自動(dòng)分析圖像每個(gè)像素點(diǎn)的色相值與飽和度值，并分別統(tǒng)計(jì)出具有相同色相值、飽和度值的像素點(diǎn)的總數(shù)，最終以統(tǒng)計(jì)圖形式輸出。
2 材料與方法
2.1 試劑與儀器
單（6-巰基-6-去氧）-β-環(huán)糊精（HS-β-CD）購自山東濱州智源生物科技有限公司；L-乳酸（L-(+)-Lactic acid，高級(jí)純，90%）、三水四氯金酸（HAuCl4·3H2O）均購自重慶多愛酷生物公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（臺(tái)灣艾柯Exceed-Dc-60型純水機(jī)）。樣品合成過程中使用BK-360B超聲波洗滌儀（濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司）、ESJ200-4B分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）、G70D20CN1P-D2（S0）微波爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司），紫外可見光譜用UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）測(cè)得。
2.2 β-CD@AuNPs的制備
取0.010 g HAuCl4·3H2O和15.0 mg HS-β-CD，使用超聲儀5 min使其溶解在30 mL的超純水中。在微波爐100%的火力下反應(yīng)40 s得到酒紅色的β-CD@AuNPs溶液[15]。將所得溶液與水以2∶1的比例進(jìn)行稀釋，備用。
2.3 排除性實(shí)驗(yàn)
為了排除汗?jié)撝赣≈衅渌煞謱?duì)β-CD@AuNPs溶液顏色變化的影響，在5份相同的4 mL β-CD@AuNPs溶液中分別加入1.0 mL純水、乳酸溶液、甘油溶液、絲氨酸溶液、葡萄糖溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆虿㈧o置5 min后，分別取1.5 mL溶液裝入2.0 mL的試劑瓶中，在白色背景和正常日光燈的條件下拍照固定。
2.4 對(duì)乳酸的檢測(cè)
取400、500、600、700、800、900 μL的純?nèi)樗岱謩e加入4.0 mL的β-CD@AuNPs溶液中，并使用移液槍反復(fù)混勻，直到顏色無變化。靜置5 min后，分別取1.5 mL溶液裝入2 mL的試劑瓶中，在白色背景和正常日光燈的條件下拍照固定。
2.5 對(duì)汗?jié)撝赣颖局腥樗岬臋z測(cè)
采集一枚志愿者的指印于載玻片上，向指印上滴加100 μL的β-CD@AuNPs溶液至覆蓋整枚指印并在同一載玻片沒有指印處滴加100 μLβ-CD@AuNPs溶液，用于對(duì)照。5 min后，在白色背景和正常日光燈的條件下拍照固定。
2.6 圖像處理
將拍照所得圖像進(jìn)行適當(dāng)裁剪，如果所拍照片顏色太亮或太暗，可對(duì)照片整體進(jìn)行亮度/對(duì)比度的調(diào)整，確保待分析部分的顏色明顯，同時(shí)保證顏色相對(duì)單一。利用數(shù)據(jù)化處理程序，對(duì)上述照片進(jìn)行逐個(gè)分析，得到各自的HSV圖。
3 結(jié)果與討論
3.1 β-CD@AuNPs的紫外-可見光譜
圖3中的三條曲線分別為反應(yīng)物HS-β-CD、HAuCl4與產(chǎn)物β-CD@AuNPs的紫外可見分光光譜圖。反應(yīng)物HS-β-CD、HAuCl4在536 nm處均無吸收峰，而產(chǎn)物β-CD@AuNPs在536 nm處有明顯吸收峰，反應(yīng)物與產(chǎn)物的紫外可見分光光譜圖無論是形態(tài)，還是波峰均不相同，故可以推斷，經(jīng)過微波反應(yīng)產(chǎn)生了新物質(zhì)β-CD@AuNPs。Du課題組[15]報(bào)道β-CD@AuNPs在526 nm處存在吸收峰，與本文結(jié)果存在10 nm的差異，主要原因可能是二者所采取的制備方法和儀器存在差別。Du課題組采用的是微波反應(yīng)器在150 W、120℃條件下攪拌反應(yīng)3 min，采用的條件更溫和，β-CD@AuNPs粒徑可能更小，吸收峰藍(lán)移。
3.2 排除性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
依據(jù)2.3相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，所得結(jié)果如圖4所示，除第2組乳酸溶液外，其余3組的顏色以及所得的HSV圖均與空白對(duì)照組一致（色相值主要集中在46、47處），沒有太大變化，排除了這三種物質(zhì)對(duì)β-CD@AuNPs溶液檢驗(yàn)汗?jié)撝赣≈腥樗岷坑绊憽?/p>
3.3 定性分析結(jié)果
依據(jù)2.4相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，所得結(jié)果如圖5所示，圖5a從1到6所加乳酸體積逐漸減少，其顏色也逐漸由藍(lán)紫色轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色，圖5b為截取圖5a中等大的圖片用于HSV分析得到的HSV圖，所得色相也是由藍(lán)紫色轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色。因此可以得出結(jié)論：適量的乳酸可使β-CD@AuNPs溶液的顏色由原來的酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，并可利用該結(jié)論進(jìn)行指印中乳酸的定性分析。
依據(jù)2.5相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，所得結(jié)果如圖6所示，a為無任何處理的β-CD@AuNPs溶液，b為滴加在汗?jié)撝赣∩系摩?CD@AuNPs溶液。從圖中可以明顯看出，滴在指印上方的β-CD@AuNPs溶液比空白處的酒紅色顏色更淡，更偏藍(lán)紫色，這與圖5中β-CD@AuNPs溶液加入乳酸的顏色變化是一致的。截取兩處液滴圖片用于HSV分析，從圖中可以明顯看出相較于空白處的液滴，位于指印上方的液滴的色相更偏向藍(lán)紫色，根據(jù)上述條件可以推斷該枚指印中是含有乳酸的。因此，β-CD@AuNPs溶液可以用于汗?jié)撝赣≈械娜樗釞z驗(yàn)。同時(shí)，HSV圖的色相分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顏色進(jìn)行了量化、數(shù)據(jù)化，有利于更客觀的評(píng)價(jià)，以及后期半定量分析的研究。
圖7為β-CD@AuNPs溶液滴加覆蓋在以載玻片為載體的指印上，水分干涸后，指印紋線的顯現(xiàn)效果。可以看到，雖然使用液體覆蓋滴加再干燥，該方法顯現(xiàn)的指印紋線及細(xì)節(jié)特征依然清晰，顯現(xiàn)效果不比傳統(tǒng)粉末顯現(xiàn)差。這為之后的汗?jié)撝赣〖y線顯現(xiàn)和指印中乳酸成分的一站式分析提供了基礎(chǔ)和可能。
3.4 實(shí)際應(yīng)用中各種因素的影響
3.4.1 指印遺留時(shí)間對(duì)檢驗(yàn)的影響
如圖8，1～6分別是β-CD@AuNPs溶液滴加在不同遺留時(shí)間的指印上產(chǎn)生的顏色變化以及利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析處理的HSV圖。每一枚指印是在同一時(shí)間由同一捺印人的同一手指在同一種載體（載玻片）上以基本一致的力度捺印形成。為了排除時(shí)間以外因素的影響，設(shè)置了a組（空白對(duì)照組）和b組（實(shí)驗(yàn)組），結(jié)果表明隨著指印形成時(shí)間的增加，β-CD@AuNPs溶液的顏色變化越來越小，也就是指印中可以被檢測(cè)的乳酸含量越來越少，這是符合指印中物質(zhì)隨時(shí)間的推移不斷被環(huán)境中微生物或酶所分解而逐漸減少規(guī)律的。圖8b中相鄰兩組之間的差異是難以通過最初的實(shí)驗(yàn)結(jié)果區(qū)分的，而將其中的結(jié)果進(jìn)行HSV分析后，通過圖中的色相及其分布的差異可以清楚地看到不同組實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的差異。從中可以發(fā)現(xiàn)b-1、2、3 HSV圖中有逐漸遞減的藍(lán)紫色色相，b-4、5、6則幾乎不存在該色相帶，證明了乳酸含量的減少。同時(shí)根據(jù)5、6組空白對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組的橫向?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn)指印形成10 d以后乳酸含量基本趨于穩(wěn)定。雖然其中a-3的HSV分析結(jié)果與預(yù)期結(jié)果存在沖突，但這可能是液滴大小、形狀不同使得邊緣陰影面積不同導(dǎo)致的結(jié)果。總的來說，根據(jù)汗?jié)撝赣≈腥樗犭S時(shí)間遞減的規(guī)律，在正常的遺留指印成分以及面積大小一定的前提下，β-CD@AuNPs溶液可以很好地分辨新鮮指?。ㄐ纬蓵r(shí)間不超過2 d）和陳舊指印。
3.4.2 不同載體對(duì)指印檢驗(yàn)的影響
圖9中1～3分別為不同載體上新鮮汗?jié)撝赣〉渭应?CD@AuNPs溶液后的顏色變化及經(jīng)過分析處理后的HSV圖。每一枚指印是在同一時(shí)間由同一捺印人的同一手指在不同載體上以基本一致的力度捺印形成。為了排除載體以外因素的影響，設(shè)置了a組（空白對(duì)照組）和b組（實(shí)驗(yàn)組）?？梢园l(fā)現(xiàn)在載玻片、易拉罐、塑料卡片等一系列淺色非滲透載體上利用β-CD@AuNPs溶液檢驗(yàn)汗?jié)撝赣≈械娜樗岫季哂休^好的實(shí)驗(yàn)效果，且每一種載體在HSV圖上都有一段獨(dú)特的色相帶，如a-2由于易拉罐底部金屬的獨(dú)特光澤，所以在中間存在一段淺藍(lán)色色相帶，在b-2中同樣存在，因此這屬于載體背景所帶來的不同。但在指印二維形態(tài)的顯現(xiàn)方面，金屬載體和塑料載體的顯現(xiàn)效果不如玻璃載體（圖10）。總而言之，在淺色非滲透性客體上，β-CD@AuNPs溶液有較好的乳酸檢驗(yàn)應(yīng)用效果，但在金屬載體和塑料載體表面沒有得到較好的二維形態(tài)顯現(xiàn)效果。
4 結(jié)論
本文使用微波加熱方式制備了以HS-β-CD為還原劑的β-CD@AuNPs，并將β-CD@AuNPs首次用于汗?jié)撝赣《S形態(tài)和乳酸成分信息的同步可視化診斷，同時(shí)使用HSV對(duì)實(shí)驗(yàn)的圖像結(jié)果進(jìn)行量化、數(shù)據(jù)化處理，使評(píng)價(jià)更客觀，有利于后期的半定量分析研究。在正常的遺留指印成分以及面積大小一定的前提下，根據(jù)β-CD@AuNPs與乳酸反應(yīng)的顏色變化可以有效區(qū)分新鮮指印（形成時(shí)間在2 d以內(nèi)）和陳舊指印，這一方法對(duì)淺色非滲透載體都能有效適用。
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超分子是由多個(gè)分子通過氫鍵、范德華力、電荷的庫侖作用、π-π共軛等相互作用力而自動(dòng)結(jié)合成的有序、有組織并能選擇性識(shí)別某些離子或基團(tuán)的聚合物[6]。超分子擁有封閉或半封閉的、對(duì)客體分子具有高親和力和高選擇性的配位“空腔”，該空腔可以通過π-π堆積作用、氫鍵、靜電作用、陽離子-π作用、疏水相互作用等與客體形成穩(wěn)定的復(fù)合物[7]。β-環(huán)糊精(β-CD)作為一種著名的分子受體，其疏水腔可與多種有機(jī)、無機(jī)和生物客源分子形成主客體包合物[8-9]。同時(shí)，β-CD具有水溶性和環(huán)保性，有助于提高功能材料的分散性[10-13]。考慮到大環(huán)超分子具有獨(dú)特的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，當(dāng)β-CD附著在AuNPs表面時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)一些新的性質(zhì)和相應(yīng)的新應(yīng)用[14]。Du 等[15]曾利用NR-β-CD@AuNPs對(duì)河水中的亞硝酸根離子進(jìn)行痕量檢測(cè)。
本文使用微波加熱方法利用HAuCl4·3H2O和HS-β-CD制備β-CD@AuNPs[15]，首次將其應(yīng)用于汗?jié)撝赣≈卸S形態(tài)以及成分信息的同步可視化診斷，并創(chuàng)新性地將HSV圖像處理技術(shù)應(yīng)用于汗?jié)撝赣∪樗岢煞值臋z測(cè)分析，旨在研發(fā)一種可以實(shí)現(xiàn)對(duì)汗?jié)撝赣《S形態(tài)以及乳酸成分快速定性分析的方法，進(jìn)而在保證對(duì)汗?jié)撝赣《S形態(tài)可視化的前提下，證明對(duì)汗?jié)撝赣〕煞址治隼玫目尚行?，為案件偵破提供更多的線索。本方法操作簡(jiǎn)單，流程快捷，同時(shí)，原材料HAuCl4·3H2O和HS-β-CD價(jià)格相對(duì)不高，具有推廣的可操作性。數(shù)據(jù)化圖像識(shí)別處理旨在通過機(jī)器識(shí)別判斷代替人眼的識(shí)別判斷，使最終結(jié)果更加客觀可靠。
1 基本原理
1.1 β-CD@AuNPs制備和結(jié)合乳酸的原理
如圖1，在微波的高能環(huán)境下，HS-β-CD作為還原劑和穩(wěn)定劑與AuNPs形成Au-S鍵，將HS-β-CD修飾到AuNPs表面，作為支架和受體，通過主客體相互作用實(shí)現(xiàn)光傳感[15]。
AuNPs表面的β-CD作為一種分子受體，可與環(huán)境中的乳酸分子形成主客體包合物，AuNPs作為結(jié)構(gòu)熒光共振能量轉(zhuǎn)移系統(tǒng)中理想的能量受體，在這一過程中將這一主客體包合物形成的信息轉(zhuǎn)換為人肉眼可見的顏色變化，達(dá)到識(shí)別的目的。
1.2 HSV半定量分析原理
HSV色彩空間即色相（hue）、飽和度（saturation）、明度（value），是一種將RGB色彩空間中的點(diǎn)在倒圓錐體中表示的方法，HSV更類似于人類感覺顏色的方式，對(duì)顏色的表達(dá)比RGB更符合人眼觀察，如圖2。色相表示色彩信息，由繞V軸的旋轉(zhuǎn)角給定。范圍是0° ～ 360°，其中紅色是0°，綠色是120°，藍(lán)色是240°，每一種顏色和它的補(bǔ)色相差180°；飽和度為一比值，它表示成所選顏色的純度和該顏色最大的純度之間的比率。飽和度范圍從0到1，所以圓錐頂面的半徑為1，飽和度＝0時(shí)，只有灰度，灰色的飽和度是0%，純粹的顏色比如大紅（255, 0, 0）、青色（0, 255, 255）等等的飽和度是100%；明度表示色彩的明亮程度，范圍從0到1，明度為0%時(shí)為黑色，明度為100%時(shí)為白色，介于0% ～ 100%之間時(shí)，則用來表示各個(gè)顏色的明暗程度，HSV圓錐模型的頂面對(duì)應(yīng)明度為1，頂點(diǎn)對(duì)應(yīng)明度為0[16-17]。
對(duì)指印圖像進(jìn)行數(shù)據(jù)化識(shí)別的程序是以HSV色彩空間的代碼為主體（其中我們將色相H的范圍從0° ～ 360°轉(zhuǎn)化為0 ～ 50），結(jié)合了相關(guān)統(tǒng)計(jì)歸納代碼。將指印圖像輸入程序后，程序自動(dòng)分析圖像每個(gè)像素點(diǎn)的色相值與飽和度值，并分別統(tǒng)計(jì)出具有相同色相值、飽和度值的像素點(diǎn)的總數(shù)，最終以統(tǒng)計(jì)圖形式輸出。
2 材料與方法
2.1 試劑與儀器
單（6-巰基-6-去氧）-β-環(huán)糊精（HS-β-CD）購自山東濱州智源生物科技有限公司；L-乳酸（L-(+)-Lactic acid，高級(jí)純，90%）、三水四氯金酸（HAuCl4·3H2O）均購自重慶多愛酷生物公司；實(shí)驗(yàn)用水均為超純水（臺(tái)灣艾柯Exceed-Dc-60型純水機(jī)）。樣品合成過程中使用BK-360B超聲波洗滌儀（濟(jì)南巴克超聲波科技有限公司）、ESJ200-4B分析天平（沈陽龍騰電子有限公司）、G70D20CN1P-D2（S0）微波爐（廣東格蘭仕微波生活電器制造有限公司），紫外可見光譜用UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）測(cè)得。
2.2 β-CD@AuNPs的制備
取0.010 g HAuCl4·3H2O和15.0 mg HS-β-CD，使用超聲儀5 min使其溶解在30 mL的超純水中。在微波爐100%的火力下反應(yīng)40 s得到酒紅色的β-CD@AuNPs溶液[15]。將所得溶液與水以2∶1的比例進(jìn)行稀釋，備用。
2.3 排除性實(shí)驗(yàn)
為了排除汗?jié)撝赣≈衅渌煞謱?duì)β-CD@AuNPs溶液顏色變化的影響，在5份相同的4 mL β-CD@AuNPs溶液中分別加入1.0 mL純水、乳酸溶液、甘油溶液、絲氨酸溶液、葡萄糖溶液，充分?jǐn)嚢杈鶆虿㈧o置5 min后，分別取1.5 mL溶液裝入2.0 mL的試劑瓶中，在白色背景和正常日光燈的條件下拍照固定。
2.4 對(duì)乳酸的檢測(cè)
取400、500、600、700、800、900 μL的純?nèi)樗岱謩e加入4.0 mL的β-CD@AuNPs溶液中，并使用移液槍反復(fù)混勻，直到顏色無變化。靜置5 min后，分別取1.5 mL溶液裝入2 mL的試劑瓶中，在白色背景和正常日光燈的條件下拍照固定。
2.5 對(duì)汗?jié)撝赣颖局腥樗岬臋z測(cè)
采集一枚志愿者的指印于載玻片上，向指印上滴加100 μL的β-CD@AuNPs溶液至覆蓋整枚指印并在同一載玻片沒有指印處滴加100 μLβ-CD@AuNPs溶液，用于對(duì)照。5 min后，在白色背景和正常日光燈的條件下拍照固定。
2.6 圖像處理
將拍照所得圖像進(jìn)行適當(dāng)裁剪，如果所拍照片顏色太亮或太暗，可對(duì)照片整體進(jìn)行亮度/對(duì)比度的調(diào)整，確保待分析部分的顏色明顯，同時(shí)保證顏色相對(duì)單一。利用數(shù)據(jù)化處理程序，對(duì)上述照片進(jìn)行逐個(gè)分析，得到各自的HSV圖。
3 結(jié)果與討論
3.1 β-CD@AuNPs的紫外-可見光譜
圖3中的三條曲線分別為反應(yīng)物HS-β-CD、HAuCl4與產(chǎn)物β-CD@AuNPs的紫外可見分光光譜圖。反應(yīng)物HS-β-CD、HAuCl4在536 nm處均無吸收峰，而產(chǎn)物β-CD@AuNPs在536 nm處有明顯吸收峰，反應(yīng)物與產(chǎn)物的紫外可見分光光譜圖無論是形態(tài)，還是波峰均不相同，故可以推斷，經(jīng)過微波反應(yīng)產(chǎn)生了新物質(zhì)β-CD@AuNPs。Du課題組[15]報(bào)道β-CD@AuNPs在526 nm處存在吸收峰，與本文結(jié)果存在10 nm的差異，主要原因可能是二者所采取的制備方法和儀器存在差別。Du課題組采用的是微波反應(yīng)器在150 W、120℃條件下攪拌反應(yīng)3 min，采用的條件更溫和，β-CD@AuNPs粒徑可能更小，吸收峰藍(lán)移。
3.2 排除性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
依據(jù)2.3相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，所得結(jié)果如圖4所示，除第2組乳酸溶液外，其余3組的顏色以及所得的HSV圖均與空白對(duì)照組一致（色相值主要集中在46、47處），沒有太大變化，排除了這三種物質(zhì)對(duì)β-CD@AuNPs溶液檢驗(yàn)汗?jié)撝赣≈腥樗岷坑绊憽?/p>
3.3 定性分析結(jié)果
依據(jù)2.4相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，所得結(jié)果如圖5所示，圖5a從1到6所加乳酸體積逐漸減少，其顏色也逐漸由藍(lán)紫色轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色，圖5b為截取圖5a中等大的圖片用于HSV分析得到的HSV圖，所得色相也是由藍(lán)紫色轉(zhuǎn)變?yōu)榫萍t色。因此可以得出結(jié)論：適量的乳酸可使β-CD@AuNPs溶液的顏色由原來的酒紅色變?yōu)樗{(lán)紫色，并可利用該結(jié)論進(jìn)行指印中乳酸的定性分析。
依據(jù)2.5相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作，所得結(jié)果如圖6所示，a為無任何處理的β-CD@AuNPs溶液，b為滴加在汗?jié)撝赣∩系摩?CD@AuNPs溶液。從圖中可以明顯看出，滴在指印上方的β-CD@AuNPs溶液比空白處的酒紅色顏色更淡，更偏藍(lán)紫色，這與圖5中β-CD@AuNPs溶液加入乳酸的顏色變化是一致的。截取兩處液滴圖片用于HSV分析，從圖中可以明顯看出相較于空白處的液滴，位于指印上方的液滴的色相更偏向藍(lán)紫色，根據(jù)上述條件可以推斷該枚指印中是含有乳酸的。因此，β-CD@AuNPs溶液可以用于汗?jié)撝赣≈械娜樗釞z驗(yàn)。同時(shí)，HSV圖的色相分析對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顏色進(jìn)行了量化、數(shù)據(jù)化，有利于更客觀的評(píng)價(jià)，以及后期半定量分析的研究。
圖7為β-CD@AuNPs溶液滴加覆蓋在以載玻片為載體的指印上，水分干涸后，指印紋線的顯現(xiàn)效果。可以看到，雖然使用液體覆蓋滴加再干燥，該方法顯現(xiàn)的指印紋線及細(xì)節(jié)特征依然清晰，顯現(xiàn)效果不比傳統(tǒng)粉末顯現(xiàn)差。這為之后的汗?jié)撝赣〖y線顯現(xiàn)和指印中乳酸成分的一站式分析提供了基礎(chǔ)和可能。
3.4 實(shí)際應(yīng)用中各種因素的影響
3.4.1 指印遺留時(shí)間對(duì)檢驗(yàn)的影響
如圖8，1～6分別是β-CD@AuNPs溶液滴加在不同遺留時(shí)間的指印上產(chǎn)生的顏色變化以及利用實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析處理的HSV圖。每一枚指印是在同一時(shí)間由同一捺印人的同一手指在同一種載體（載玻片）上以基本一致的力度捺印形成。為了排除時(shí)間以外因素的影響，設(shè)置了a組（空白對(duì)照組）和b組（實(shí)驗(yàn)組），結(jié)果表明隨著指印形成時(shí)間的增加，β-CD@AuNPs溶液的顏色變化越來越小，也就是指印中可以被檢測(cè)的乳酸含量越來越少，這是符合指印中物質(zhì)隨時(shí)間的推移不斷被環(huán)境中微生物或酶所分解而逐漸減少規(guī)律的。圖8b中相鄰兩組之間的差異是難以通過最初的實(shí)驗(yàn)結(jié)果區(qū)分的，而將其中的結(jié)果進(jìn)行HSV分析后，通過圖中的色相及其分布的差異可以清楚地看到不同組實(shí)驗(yàn)結(jié)果之間的差異。從中可以發(fā)現(xiàn)b-1、2、3 HSV圖中有逐漸遞減的藍(lán)紫色色相，b-4、5、6則幾乎不存在該色相帶，證明了乳酸含量的減少。同時(shí)根據(jù)5、6組空白對(duì)照和實(shí)驗(yàn)組的橫向?qū)Ρ瓤梢园l(fā)現(xiàn)指印形成10 d以后乳酸含量基本趨于穩(wěn)定。雖然其中a-3的HSV分析結(jié)果與預(yù)期結(jié)果存在沖突，但這可能是液滴大小、形狀不同使得邊緣陰影面積不同導(dǎo)致的結(jié)果。總的來說，根據(jù)汗?jié)撝赣≈腥樗犭S時(shí)間遞減的規(guī)律，在正常的遺留指印成分以及面積大小一定的前提下，β-CD@AuNPs溶液可以很好地分辨新鮮指?。ㄐ纬蓵r(shí)間不超過2 d）和陳舊指印。
3.4.2 不同載體對(duì)指印檢驗(yàn)的影響
圖9中1～3分別為不同載體上新鮮汗?jié)撝赣〉渭应?CD@AuNPs溶液后的顏色變化及經(jīng)過分析處理后的HSV圖。每一枚指印是在同一時(shí)間由同一捺印人的同一手指在不同載體上以基本一致的力度捺印形成。為了排除載體以外因素的影響，設(shè)置了a組（空白對(duì)照組）和b組（實(shí)驗(yàn)組）?？梢园l(fā)現(xiàn)在載玻片、易拉罐、塑料卡片等一系列淺色非滲透載體上利用β-CD@AuNPs溶液檢驗(yàn)汗?jié)撝赣≈械娜樗岫季哂休^好的實(shí)驗(yàn)效果，且每一種載體在HSV圖上都有一段獨(dú)特的色相帶，如a-2由于易拉罐底部金屬的獨(dú)特光澤，所以在中間存在一段淺藍(lán)色色相帶，在b-2中同樣存在，因此這屬于載體背景所帶來的不同。但在指印二維形態(tài)的顯現(xiàn)方面，金屬載體和塑料載體的顯現(xiàn)效果不如玻璃載體（圖10）。總而言之，在淺色非滲透性客體上，β-CD@AuNPs溶液有較好的乳酸檢驗(yàn)應(yīng)用效果，但在金屬載體和塑料載體表面沒有得到較好的二維形態(tài)顯現(xiàn)效果。
4 結(jié)論
本文使用微波加熱方式制備了以HS-β-CD為還原劑的β-CD@AuNPs，并將β-CD@AuNPs首次用于汗?jié)撝赣《S形態(tài)和乳酸成分信息的同步可視化診斷，同時(shí)使用HSV對(duì)實(shí)驗(yàn)的圖像結(jié)果進(jìn)行量化、數(shù)據(jù)化處理，使評(píng)價(jià)更客觀，有利于后期的半定量分析研究。在正常的遺留指印成分以及面積大小一定的前提下，根據(jù)β-CD@AuNPs與乳酸反應(yīng)的顏色變化可以有效區(qū)分新鮮指印（形成時(shí)間在2 d以內(nèi)）和陳舊指印，這一方法對(duì)淺色非滲透載體都能有效適用。
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