余仲昊，徐曲毅，肖 成，李 歡，吳偉斌，杜蔚安，趙 建，劉 宏，王慧君,*，劉 超,,*

（1.南方醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，廣州 510515；2.廣州市刑事科學(xué)技術(shù)研究所，公安部法醫(yī)病理學(xué)重點實驗室，廣州 510442；3.重慶醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，重慶 400016；4.廣東華美眾源生物科技有限公司，廣東 佛山 518000）

溺死，是由于溺液阻塞呼吸道及肺泡，阻礙氣體交換，造成體內(nèi)缺氧及二氧化碳潴留而發(fā)生的窒息性死亡。水中尸體的死因診斷是法醫(yī)工作的重點和難點。早期法醫(yī)工作者常通過相關(guān)尸體征象，如口、鼻部蕈樣泡沫，水性肺氣腫等[1]來初步推斷水中尸體死因是否為溺死。然而，隨著尸體在水中浸泡時間的延長，尸體征象常因腐敗而消失，且一些其他死因的尸體也偶有上述征象出現(xiàn)，故單獨依靠尸體征象來診斷溺死的準(zhǔn)確性較低。

硅藻檢驗診斷溺死有其歷史，法醫(yī)工作者在光學(xué)顯微鏡下觀察計算尸體臟器組織中的硅藻形態(tài)和數(shù)量而推斷是否溺死。該法雖操作簡單，但由于光鏡觀察的局限性，檢驗陽性率較低，且其操作過程也較易造成污染[2-5]。隨著技術(shù)的進步，通過對傳統(tǒng)光鏡下硅藻檢驗的改良優(yōu)化，Zhao等[6-8]建立了微波消解-真空抽濾-自動掃描電鏡法（MD-VF-Auto SEM），以自動掃描電鏡代替了傳統(tǒng)的光鏡，既提高了檢測靈敏度，又使方法具有定量能力而將準(zhǔn)確性大幅提高。但該法所需要的儀器設(shè)備價格較昂貴，使用條件要求高，難以在基層實驗室廣泛開展。

近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，已有不少研究者將DNA檢測應(yīng)用到溺死診斷領(lǐng)域中。以水體中的硅藻、藍藻、氣單胞菌等溺死相關(guān)浮游微生物的特定基因[9-13]為靶點，PCR毛細(xì)管電泳檢測法（PCR-CE）可完成水中尸體臟器硅藻、氣單胞菌等微生物的檢測，從而可診斷溺死。如麥柏盛等[14]采用PCR-CE法檢測嗜水氣單胞菌gyrB和16S rRNA基因，彭帆等[15]檢測rbcL基因，均表明PCR-CE檢測技術(shù)在一般案件中具有較高的實用價值。然而，該法耗時較長、靈敏度也不高。

在PCR基礎(chǔ)上發(fā)展起來的實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR，qPCR）是一種實時監(jiān)控核酸擴增的技術(shù)，通過在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化對PCR過程進行實時監(jiān)控，以此實現(xiàn)對初始模板的定量分析。憑借其特異性強、靈敏度高和檢測周期較短等特點，qPCR技術(shù)現(xiàn)在被廣泛應(yīng)用于臨床病原檢測、腫瘤診斷以及基因差異表達中[16-18]。在水質(zhì)研究領(lǐng)域，也有學(xué)者采用qPCR檢測技術(shù)來監(jiān)測水體中有害藻華的動態(tài)變 化[19-20]。

在我們前期研究發(fā)現(xiàn)并檢測的有限硅藻種類中，以硅藻UPA基因為靶點的qPCR檢測技術(shù)在溺死診斷研究中具有較好的應(yīng)用價值[21]?；趯V東省內(nèi)珠江水體微生物的研究[22-23]，針對水體中常見的硅藻、藍藻、氣單胞菌等浮游生物，我們設(shè)計了6對特異性引物ND、UPA、CBR、AER、HLYA、rPOD，擬構(gòu)建一種qPCR溺死診斷方法，以便能夠更加全面、快速、靈敏地檢測水體微生物的DNA，從而為溺死診斷提供更多的證據(jù)信息，為法醫(yī)學(xué)溺死診斷再提供一種鑒定手段。

1 材料和方法

1.1 試劑與儀器

PowerSoilTMDNA Isolation Kit試 劑 盒、20 mg/ mL蛋白酶K (Qiagen)，DTT、Qubit?dsDNA HS Assay Kit DNA定量試劑盒 (Thermo fisher Scientific)，NuHi?Robustic SYBR Green Mix（蘇州新海），濃硝酸（分析純，廣州化學(xué)試劑廠）。

高速冷凍離心機（Sigma），Thermomixer Vortex振蕩儀及恒溫混勻儀（Eppendorf），Qubit?fluoro- meter v2.0熒光定量儀（Invitrogen），Milli-Q超純水系統(tǒng) （Millipore），高壓蒸汽滅菌鍋（Hirayama），Quant-StudioTM7 Flex Real-Time PCR System實時熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific)，MW 3000微波消解儀（Anton Paar），HL-6型多聯(lián)濾膜富集裝置（珠海黑馬儀器公司），F(xiàn)EI Quanta 600型掃描電鏡（FEI公司）。

1.2 樣本準(zhǔn)備

1.2.1 藻種、菌種標(biāo)準(zhǔn)株及人基因組DNA

根據(jù)前期研究基礎(chǔ)，針對廣東省珠江流域水體中常見的溺死相關(guān)浮游生物種類，特購置以下藻種、菌種標(biāo)準(zhǔn)株：4種淡水硅藻（小環(huán)藻Cyclotella sp.、針桿藻Synedra radians、菱形藻Nitzschia sp.、舟 形 藻Navicula sp.），5種 海 水 硅 藻（三 角褐指藻Phaeodactylum tricornutum、旋鏈角毛藻Chaetoisceros curvisetus、威氏海鏈藻Thalassiosira weissflogii、中肋骨條藻Skeletonema costatum、隱秘小環(huán)藻Cyclotella cryptita），4種淡水藍藻（念珠藻Nostoc sp.、魚腥藻Anabaena sp.、產(chǎn)毒銅綠微囊藻Toxic microcystis、不產(chǎn)毒銅綠微囊藻Microcystis aeruginosa），2種海水藍藻（鈍頂螺旋藻Spirulina platensis、聚球藻Synechococcus），以上藻種標(biāo)準(zhǔn)株均購自廈門譜藍生物科技公司；5種水生氣單胞菌（殺鮭氣單胞菌Aeromonas salmonicida、嗜水氣單胞菌Aeromonas hydrophila、舒氏氣單胞菌Aeromonas schubertii、維氏氣單胞菌Aeromonas veronii、溫和氣單胞菌Aeromonas sobria），3種人體共生菌（長雙歧桿菌Bifidobacterium longum、大腸桿菌Escherichia coli、白色念珠菌Candida albicans），以上菌種均購自廣東省微生物研究所；人類女性基因組DNA 9947A購自Thermo Fisher Scientific公司。

1.2.2 實驗兔樣本

經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：L2020064）后，選取38只普通級新西蘭兔作為實驗對象，雌雄參半，體重在2 ～ 2.5 kg之間，由南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物管理中心提供。

實驗兔隨機分為甲、乙、丙三組：甲組為溺死組（drowned group, DG, n ＝ 16），將實驗兔置于兔籠沉入水下溺死，死后在水下浸泡30 min；乙組為死后浸泡組（postmortem submersion group, PSG, n＝16），在遠離水的地面上采用空氣栓塞法將兔子處死，待確認(rèn)兔子完全死亡后，將兔子置于水下浸泡30 min；丙組為空白對照組（blank control group, BCG, n＝6），在遠離水的環(huán)境中采用空氣栓塞法將兔子處死，后將兔子置于解剖臺上等待解剖。為提高檢出率及避免交叉污染，每只實驗兔均采用一次性器械解剖，分別提取其所有的肺、肝、腎組織。同時收集溺死地水樣2 L，-80 oC保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 DNA提取及定量

藻種和菌種培養(yǎng)液：取1 mL加入到含有細(xì)胞裂解液及研磨珠的PowerBread管中，10 000 r/min離心30 min，棄上清液0.5 mL。

器官組織樣本：取0.5 g，置于PowerBread管中，采用滅菌后的剪刀剪碎，然后于其中加入10 μL的蛋白酶K和10 μL的DTT；恒溫振蕩儀56 oC振蕩3 h，振幅為1 500 r/min。

水樣中浮游生物：取200 mL溺死地點水樣，經(jīng)真空抽濾富集于濾膜上，置于PowerBread管中，采用滅菌后的剪刀將濾膜剪碎，然后于其中加入10 μL的蛋白酶K和10 μL的DTT。

以上三種樣本均采用PowerSoilTMDNA Isolation Kit試劑盒按說明書提取各自DNA。以Thermo Fisher Scientific公司Qubit熒光定量試劑盒制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：1 μL樣品DNA，199 μL工作液，振蕩離心，室溫避光孵育3 min，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并測定DNA 濃度。

1.4 引物設(shè)計

根據(jù)前期硅藻形態(tài)學(xué)研究基礎(chǔ)，針對廣東省珠江流域內(nèi)常見的硅藻、藍藻及氣單胞菌等浮游生物，選取其在GenBank數(shù)據(jù)庫中的6個特異性基因，使用引物設(shè)計軟件Primer Express 3.0.1設(shè)計特異性引物，經(jīng)過NCBI中Primer-BLAST的引物特異性驗證，最終篩選出6對高度特異的引物：ND、UPA、CBR、AER、rPOD、HLYA（表1）。委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成這些引物。

表1 篩選所得的引物詳細(xì)信息Table 1 The selected primers and their detailed information

1.5 qPCR檢測

25 μL的qPCR擴增檢測體系：NuHi?Robustic SYBR Green Mix 12.5 μL，正、反向引物各0.5 μL（濃度均為 10 μmol/L），DNA模板1 μL，擴增水10.5 μL。qPCR擴增程序參數(shù)：95 oC × 5 min；95 oC × 5 s, 60 oC × 25 s, 40個循環(huán)；熔解曲線分析：60 oC × 1 min，95 oC × 1 min，升溫過程中收集信號。使用QuantStudioTM7實時熒光定量PCR儀進行擴增檢測，相關(guān)操作按該設(shè)備操作說明書進行。

1.6 引物特異性及靈敏度

分別使用上述6對引物，擴增9種硅藻、6種藍藻、5種水生氣單胞菌以及3種人體共生菌和人類基因組DNA 9947A，采用qPCR檢測方法，驗證引物特異性。

經(jīng)Qubit熒光定量儀檢測所提取的藻種和菌種標(biāo)準(zhǔn)株DNA濃度后調(diào)整至1 ng/μL，續(xù)以10×倍比濃度梯度稀釋6次，用qPCR方法確定上述6對引物對各種模板DNA的最低檢測范圍以確定引物的靈 敏度。

1.7 陽性率實驗

使用上述6對引物，經(jīng)qPCR法檢測實驗兔的臟器組織；采用微波消解-真空抽濾-自動電鏡掃描法（MD-VF-Auto SEM）對實驗兔的臟器組織及水樣進行硅藻形態(tài)學(xué)檢驗。參照法醫(yī)學(xué)診斷溺死的陽性標(biāo)準(zhǔn)，以肺組織檢出陽性為基礎(chǔ)，肝、腎任一組織檢出陽性，則診斷為溺死。

計算上述6對引物產(chǎn)物的總體檢測陽性率，與MD-VF-Auto SEM法檢測結(jié)果陽性率相比較，分析兩種方法對溺死診斷的有效性。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 20.0做統(tǒng)計分析，根據(jù)數(shù)據(jù)分布類型，選擇Fisher精確性檢驗比較上述6對引物分別對38只實驗兔的溺死診斷正確率和38只實驗兔的所有肺、肝、腎樣本的溺死診斷陽性率是否與MD-VF-Auto SEM法具有顯著性差異。檢驗水準(zhǔn)α ＝ 0.05，若P＜ 0.05，則差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性和靈敏度

經(jīng)qPCR，用ND、UPA、CBR、AER、HLYA、rPOD等6對引物分別擴增上述的硅藻、藍藻、氣單胞菌、人體共生菌以及人基因組DNA。結(jié)果顯示：ND引物能特異擴增舟形藻、三角褐指藻和旋鏈角毛藻；UPA引物能特異擴增小環(huán)藻、針桿藻、菱形藻、威氏海鏈藻、中肋骨條藻和隱秘小環(huán)藻；CBR能特異擴增念珠藻、魚腥藻、產(chǎn)毒銅綠微囊藻、不產(chǎn)毒銅綠微囊藻、鈍頂螺旋藻和聚球藻；AER能特異擴增殺鮭氣單胞菌；HLYA能特異擴增嗜水氣單胞菌和舒氏氣單胞菌；rPOD能特異擴增維氏氣單胞菌和溫和氣單胞菌。

6對引物均不能擴增長雙歧桿菌、大腸桿菌和白色念珠菌等3種人體共生菌的DNA以及人基因組DNA 9947A，表明上述引物特異性較好，在尸體溺死診斷中不會受到宿主因素的影響。

Qubit測定標(biāo)準(zhǔn)株DNA濃度并調(diào)整至1 ng/μL及10×倍比濃度梯度稀釋6次后，qPCR方法測定上述6對引物對各種模板DNA的最低檢測范圍而確定引物的靈敏度為：除UPA對菱形藻的檢測下限為0.001 ng外，其余引物對其特異擴增的藻種或菌種均能達到0.000 1 ng的檢測下限，表明該溺死診斷方法靈敏度較高，能夠在一定程度上解決因尸體腐敗而造成的部分檢材降解的診斷難題。

2.2 實驗兔檢測結(jié)果

利用上述6對引物，經(jīng)qPCR方法分別檢測了38只實驗兔（16只溺死兔，16只死后入水兔，6只空白對照實驗兔）的肺、肝、腎組織及溺死所用水樣，結(jié)果表明，16只溺死實驗兔的肺、肝、腎組織和溺死水樣皆有不同程度的檢出（表2）；在16只死后入水實驗兔和6例空白對照實驗兔的肺、肝、腎組織檢測中，只有5例死后入水兔的肺組織檢測結(jié)果呈陽性，檢出引物分別是ND、UPA、AER和rPOD（如圖1所示），同時這5例肺組織的掃描電鏡觀察到的硅藻大多是小環(huán)藻和菱形藻等硅藻屬（如圖2所示），表明在硅藻檢測方面，MD-VF-Auto SEM和qPCR兩種方法具有一定程度的一致性。

表2 兔子樣本浮游生物檢出率Table 2 The detection rate of plankton from the handling-different sampling rabbits killed

2.3 統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果

qPCR和MD-VF-Auto SEM兩種方法對38只實驗兔的診斷正確的結(jié)果以及對38只兔子的所有肺、肝、腎組織的診斷陽性分析的結(jié)果分別見表3，經(jīng)Fisher精確性檢驗分析，上述兩種方法對該38只實驗兔的總體檢測診斷結(jié)果差異不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.49＞0.05），對38只實驗兔的所有肺、肝、腎樣本檢測的結(jié)果診斷陽性率差異也無統(tǒng)計學(xué)顯著性（P＝0.29＞0.05）。

表3 實驗兔診斷結(jié)果匯總分析表Table 3 Summary about the diagnosis results from the experimental rabbits

這表明在溺死診斷方面，本文所建立的qPCR方法和MD-VF-Auto SEM法一樣，具有較高的準(zhǔn)確性，具有應(yīng)用于實際檢案中的潛能。

3 討論

3.1 對所選6對引物的評價

溺死研究，不少學(xué)者采用多種技術(shù)、多層次分析診斷，比如形態(tài)學(xué)層次的硅藻電鏡檢驗方法，分子生物學(xué)層次的藻類16S rRNA、SSU以及水生氣單胞菌areA等基因靶點的PCR-CE檢測方法。

基于以上研究，本文選擇珠江水體中常見的浮游生物，包括硅藻、藍藻、水生氣單胞菌等，針對不同物種的不同基因，設(shè)計特異性引物（ND、UPA、CBR、AER、HLYA、rPOD）。

經(jīng)過特異性實驗驗證，引物ND、UPA能夠特異性擴增小環(huán)藻、針桿藻、舟形藻、菱形藻等硅藻屬；引物CBR能夠特異擴增念珠藻、聚球藻、魚腥藻等藍藻屬；而針對水中常見的水生氣單胞菌如殺鮭氣單胞菌、嗜水氣單胞菌以及維氏氣單胞菌等，引物AER、HLYA和rPOD則能分別完成特異性擴增。而用上述6對引物對常見的人體共生菌（長雙歧桿菌、大腸桿菌、白色念珠菌）以及人類基因組DNA 9947A擴增檢測均呈陰性，故正常條件下，上述引物在實際案件檢測中不會受到人體宿主DNA及體內(nèi)常見共生菌的干擾，具有較高的特異性。

同時，引物靈敏度實驗表明，除引物UPA對菱形藻的檢測下限為0.001 ng外，其余引物對其特異擴增的藻種或菌種均能達到0.000 1 ng的檢測下限，擴增產(chǎn)物熔解曲線平穩(wěn)，峰尖且窄，表明該6對引物靈敏度較高，能夠在一定程度上解決因尸體腐敗而造成的部分檢材降解的診斷難題。

應(yīng)用qPCR方法檢測已知的溺死/非溺死實驗動物尸體中的水生浮游生物（硅藻、藍藻、氣單胞菌屬）DNA分子標(biāo)記，在16例已知溺死動物尸體中有14例檢出水生浮游生物，剩余2例只在肺中檢出而肝、腎未檢出，根據(jù)硅藻檢驗結(jié)果診斷溺死原則，該2例檢出結(jié)果不能判定為陽性。

此外，在16例死后浸泡以及6例空白對照的實驗兔肺、肝、腎組織檢驗中，有5例死后浸泡實驗兔的肺組織檢出陽性，而肝、腎則為陰性，表明這5例的檢出結(jié)果與實驗設(shè)計相一致，均為死后浸泡，即非溺死。此5例的肺組織檢驗呈陽性，可能是它們在水中浸泡時，水中浮游生物經(jīng)呼吸道進入到肺組織所致。

上述結(jié)果表明以qPCR法為基礎(chǔ)的浮游生物DNA檢測方法具有可行性，對溺死案件的診斷能起幫助作用。

3.2 對建立的qPCR方法的評價

按照溺死標(biāo)準(zhǔn)，本研究中16例溺死實驗兔的肺、肝、腎組織以及溺死所用水樣經(jīng)MD-VF-Auto SEM法檢驗浮游生物，結(jié)果陽性率均為100%，而qPCR檢測方法對肺、肝、腎以及溺死所用水樣的浮游生物檢出率分別為100%、81.25%、87.50%和100%，總檢出率為87.50%；16例死后浸泡兔的檢測，MDVF-Auto SEM法和qPCR法都只在5例肺組織中檢出陽性：掃描電鏡下觀察主要為小環(huán)藻和菱形藻等硅藻屬，但數(shù)量不多，計算總數(shù)分別為36個/10 g肺組織和41個/10 g肺組織；qPCR的檢出陽性引物分別為UPA、ND、AER和rPOD，硅藻檢出結(jié)果與掃描電鏡檢出結(jié)果相一致。因掃描電鏡觀察細(xì)菌的前處理操作較為復(fù)雜，且對實驗環(huán)境以及儀器的要求更嚴(yán)格，本次實驗未進行細(xì)菌層面下兩種方法的比較。

MD-VF-Auto SEM方法檢材用量較多（肺3 g、肝10 g 和腎10 g），過程耗時，且易產(chǎn)生污染實驗環(huán)境的酸霧或污染物，對實驗設(shè)備和操作技術(shù)要求也高，故難以同時處理大量樣本。qPCR法檢材用量少（肺、肝和腎各 0.5 g），從DNA提取到qPCR結(jié)束僅需4～6 h，分析擴增曲線即可得到結(jié)果，無須電泳檢測擴增產(chǎn)物的步驟，操作簡便、省時，又不產(chǎn)生環(huán)境污染物，因而有利于處理大量樣本。且在檢測全面性上，本研究建立的qPCR檢測方法能同時檢測硅藻屬、藍藻屬以及氣單胞菌屬。因此，在大規(guī)?？焖俸Y查檢測方面，qPCR法更具優(yōu)勢。

但是需要指出的是，在診斷準(zhǔn)確率方面中，qPCR法稍低于MD-VF-Auto SEM法，原因可能是：

1）檢材提取因素：溺死過程中，浮游生物進入各器官、組織后并不是均勻分布，qPCR法的單次檢材提取量較少（肺、肝、腎均0.5 g），取材覆蓋面較低，可能無法包含組織中所有的浮游生物，從而導(dǎo)致診斷準(zhǔn)確率低于檢材提取量多（肺3 g、肝10 g、腎10 g）的電鏡法。

2）浮游生物活性因素：電鏡法為藻類形態(tài)學(xué)檢驗，觀察到的是藻類堅硬的外殼，即使藻類活性喪失，其外殼仍不受影響，電鏡下仍可檢出陽性。而qPCR法為核酸檢驗，浮游生物的活性喪失、提取方法不夠成熟導(dǎo)致的DNA缺失等問題就會直接影響到后續(xù)的DNA模板質(zhì)量，從而導(dǎo)致該法的診斷準(zhǔn)確率較電鏡法略低。

綜上，本研究基于硅藻、藍藻和氣單胞菌檢測所建立的qPCR溺死診斷方法，雖存在診斷準(zhǔn)確率稍低的問題，但其具有所需檢材少、檢測周期較短、檢測通量大等優(yōu)點，隨qPCR檢測和DNA提取技術(shù)的不斷完善，將其與MD-VF-Auto SEM法聯(lián)用，將能極大提高硅藻以及其他浮游生物在溺亡者內(nèi)臟中的檢出率，降低電鏡法所致的假陽性率，增強溺死相關(guān)浮游生物檢驗診斷溺死的證據(jù)力。盡管現(xiàn)在還缺少qPCR診斷溺死的標(biāo)準(zhǔn)，但該法作為溺死診斷的輔助性手段，對于溺死樣本的快速篩查檢驗相關(guān)技術(shù)研發(fā)與拓展應(yīng)會有較好的應(yīng)用前景。