戴文珊，廖 穎，韓雨菲，劉潤東，劉媛媛，王 敏

(贛南師范大學臍橙學院/國家臍橙工程技術(shù)研究中心，江西贛州，341000)

柑桔是世界第一大果樹，其面積和產(chǎn)量均居第一，目前在146個國家和地區(qū)有栽植，產(chǎn)地主要集中在中國、美國、巴西及地中海沿岸國家[1]。根據(jù)FAO的統(tǒng)計數(shù)據(jù)分析，2017年世界柑桔種植面積達927萬hm2，產(chǎn)量達1.58億t，是僅次于小麥、玉米的第三大國際貿(mào)易農(nóng)產(chǎn)品[2]。柑桔也是我國南方地區(qū)最重要的果樹，據(jù)統(tǒng)計，2019年我國柑桔面積和產(chǎn)量分別為261.70萬hm2和4 584.54萬t[3]，柑桔產(chǎn)業(yè)在擴大柑桔主產(chǎn)區(qū)城鄉(xiāng)居民就業(yè)、促進農(nóng)業(yè)經(jīng)濟增收等方面作出了巨大貢獻[4]。

柑桔潰瘍病(citrus bacterial canker disease，CBCD)是由柑桔黃單胞桿菌柑桔亞種Xanthomonascitrisubsp.citri(Xcc)引起的病害，對柑桔產(chǎn)業(yè)威脅極大[5]。作為一種細菌性病害，其致病菌主要通過柑桔傷口或者氣孔、皮孔等孔道進入植物體內(nèi)，僅需約20 min即可完成感染過程，可為害葉片、枝條、果實等器官組織[6-10]。柑桔感染潰瘍病后，最初在柑桔葉背出現(xiàn)點狀黃色或暗黃色的斑點，病斑逐漸擴大，同時葉片病斑兩面均逐漸隆起、表皮開裂、木栓化、周圍伴有黃色暈圈，隨著感病時間的延長，癥狀逐漸加重，感病后期病斑中央成火山口狀開裂，表現(xiàn)出黃褐色的圓形、木栓化病灶[11-12]。柑桔感染潰瘍病后，輕則引起果實外觀和品質(zhì)變差、產(chǎn)量下降等，重則造成柑桔樹落葉、落果、枝梢枯死、幼樹死亡等嚴重后果[13-14]。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同柑桔對柑桔潰瘍病的敏感性有很大差異，金柑對潰瘍病的抗性最強[15-16]，甜橙高感潰瘍病[17]。枳作為常見的柑桔砧木，也會受到柑桔潰瘍病感染。最新研究表明，嫁接柑桔時以枳為砧木較其他砧木對柑桔潰瘍病的敏感度更高[18]。然而，枳、甜橙及金柑對柑桔潰瘍病的綜合抗性尚不清晰。

植物激素信號分子在面對病原物侵染時，能夠形成一個復雜的防御體系，使植物做出最為有效的防御反應[19-23]。水楊酸(salicylic acid，SA)是調(diào)節(jié)植物抗病信號途徑的重要內(nèi)源信號分子，其通過激活植物體內(nèi)防御基因的表達，從而使植物表現(xiàn)出對生物脅迫的抗性反應[24-28]。大量研究表明，SA可以誘導植物對病原菌的抗性反應，主要是通過誘導植物細胞膜脂過氧化，產(chǎn)生超敏(hypersensitive response，HR)反應，并誘導植物PR(pathogenesis-related)基因的表達，進一步誘導植物的系統(tǒng)獲得性抗性(systemic acquired resistance，SAR)[29-33]。因此，采用SA處理植物并分析處理前后植物的抗病性差異與生理變化，從而解析植物對病菌的抵抗機制，是非常有效的辦法。

筆者對柑桔亞科3個屬(枳屬、柑桔屬、金柑屬)中各自代表種(枳、甜橙和金彈)進行外源SA處理，觀察分析3種材料接種柑桔潰瘍病菌后葉片表型變化、發(fā)病癥狀、細菌生長趨勢，并測定植株相應生理數(shù)據(jù)指標，鑒定3種材料在水楊酸處理前后對柑桔潰瘍病抗性的差異。同時，分析3種材料經(jīng)SA處理后抗病相關(guān)基因表達的變化，以期初步探索這3種材料對柑桔潰瘍病敏感度差異的來源。本試驗的研究結(jié)果可為柑桔潰瘍病抗性育種的親本選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)化GFP蛋白的柑桔潰瘍病菌Xanthomonascitrisubsp.citri(Xcc)由本實驗室構(gòu)建并保存，添加50%甘油凍存于-80 ℃冰箱備用。

NA培養(yǎng)基配方：牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，蛋白胨10 g，定容至1 L。若配制NA固體培養(yǎng)基則繼續(xù)加入瓊脂粉 20 g后定容至1 L。

3種柑桔材料分別為金彈Fortunellacrassifolia、哈姆林甜橙Citrussinensis‘Hamlin’和枳Poncirustrifoliata，均由贛南師范大學苗圃中心提供。

1.2 方法

1.2.1 柑桔實生苗培養(yǎng)與水楊酸處理 實生苗培養(yǎng)：金彈、甜橙和枳實生苗采用野生型種子，1 mol/L NaOH溶液浸泡15 min去除表面殘余果膠，再用2% NaClO溶液滅菌20 min，最后用蒸餾水沖洗3～5遍。在30 ℃培養(yǎng)箱中催芽，保證環(huán)境濕潤，待發(fā)芽后移栽于10 cm× 10 cm培養(yǎng)盆中土培，基質(zhì)使用品氏營養(yǎng)土(Pindstrup，丹麥)，與蛭石按照3∶1比例混合后種植，每盆種植1株植物。25 ℃人工氣候培養(yǎng)箱(光照16 h/黑暗8 h)培養(yǎng)10周后用于潰瘍病接種試驗。

SA處理：采用200 μmol/L SA進行處理，每盆材料用50 mL SA溶液噴灑葉片+50 mL SA溶液澆灌盆土，對照采用等量蒸餾水進行同樣處理。分時間點(0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h)取樣各材料葉片，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱以備RNA提取及定量PCR檢測，每組至少取3片葉片。24 h后，分別對SA處理組和對照組進行柑桔潰瘍病菌接種。

1.2.2 接種柑桔潰瘍病菌 菌株活化：接種前從-80 ℃冰箱中取出保存的Xcc菌株，NA固體培養(yǎng)基劃線活化，28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 d后挑取單克隆菌落，繼續(xù)在新NA培養(yǎng)基劃線擴大培養(yǎng)，2 d后刮取生長的Xcc菌體，無菌水稀釋調(diào)節(jié)，配制為5×107CFU/mL的菌懸液。

接種試驗：分別選取金彈、甜橙和枳對照組及SA處理組的盆栽苗各4盆，每盆挑選3片葉，在葉背面采用小號注射器(規(guī)格：1 mL)注射Xcc菌懸液，每片葉注射兩個接種點，每個接種點接種50 μL。此外，各材料再分別挑選4盆未進行SA處理實生苗，葉片背面注射接種蒸餾水，作為陰性對照。接種完成后將實生苗放回光照培養(yǎng)箱中，28 ℃光照培養(yǎng)，觀察材料發(fā)病表型并拍照記錄。

1.2.3 RNA提取與實時熒光定量PCR分析 對材料方法1.2.1中分時間點取樣的各組材料葉片進行RNA提取，植物RNA提取參照RNAiso Plus RNA(TaKaRa，日本)試劑盒的方法進行，cDNA合成利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒K1622 RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，美國)完成。采用實時熒光定量PCR(Real-time quantitative reverse transcription PCR，簡稱qPCR)方法分析各柑桔材料抗病相關(guān)基因的表達，方法參照QuantiNovaTM SYBR○R Green PCR試劑盒(QIGEN，德國)說明書。qPCR的反應體系(10 μL)包括2 × QuantiNova SYBR Green PCR Mix 5.0 μL，Rox染料 0.3 μL，正向引物(10 μmol/L)0.3 μL，反向引物(10 μmol/L)0.3 μL，cDNA模板1.0 μL和ddH2O 3.1 μL。qPCR反應在Applied Biosystems QuanStudioTM 7 Flex Real-Time PCR系統(tǒng)(ABI，美國)內(nèi)完成。反應程序為：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性10 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，45個循環(huán)。以柑桔Actin作為內(nèi)參基因，引物序列為Actin F：CATCCCTCAGCACCTTCC；Actin R：CCAACCTTAGCACTTCTCC。以合成的cDNA為模板，每個樣品重復4次。以2-ΔΔCT 法進行定量數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 臺盼藍染色 臺盼藍(Trypan blue)是一種細胞活性染料，可以讓死亡細胞染色而變藍，因此常用來作為鑒定細胞生死狀態(tài)的指示劑。Trypan Blue母液配方：0.02 g Trypan Blue試劑(Sigma，美國)，10 g苯酚，10 mL乳酸，10 mL甘油，10 mL無菌水。Trypan Blue應用液配制方法：按照母液∶96%乙醇=1∶2的體積比例配制應用液。

在注射Xcc菌懸液9 d后分別對金彈、甜橙和枳各組植物材料進行取樣，只取注射葉片，每組進行3次生物學重復。將需要進行染色的植物材料放入離心管中，加入Trypan Blue應用液至完全浸泡，沸水煮4 min后，取出自然冷卻1 d，再加入脫色液(飽和水合氯醛溶液)進行脫色，中途可更換脫色液，待脫色完全后取出植物材料，平鋪于玻璃板上，拍照保存。

1.2.5 相對電導率測定 電導率是衡量細胞膜透性的重要指標，其值越大，說明電解質(zhì)的滲透量越多，表示細胞膜受損程度越重。在注射Xcc菌懸液9 d后分別對金彈、甜橙和枳各組植物材料進行取樣，只取注射葉片鮮樣0.1 g，每組進行3次生物學重復。將植物樣品用去離子水洗凈，放入50 mL離心管中，加入30 mL去離子水，置于旋轉(zhuǎn)搖床上室溫下緩慢搖動1～2 h，取出樣品，用DSS-307型電導率儀(SPSIC，中國)測量此時電導率C1。之后沸水煮樣品10 min，使細胞內(nèi)離子滲透達到最大，取出樣品，室溫冷卻后測量電導率C2。兩次測量均以空白去離子水為對照組，電導率記為C01和C02。相對電導率=[(C1-C01)/(C2-C02)]×100%。

1.2.6 葉綠素含量測定 參照Liu等[34]的方法，略有改動。具體方法如下：在注射Xcc菌懸液9 d后分別對金彈、甜橙和枳各組植物材料進行取樣，每組進行3次生物學重復。只取注射葉片葉肉鮮樣0.1 g，加入1.9 mL蒸餾水中，冰上研磨成勻漿。取200 μL勻漿液加入4.8 mL 80%丙酮，充分渦旋后，4 000轉(zhuǎn)/min離心5 min，取上清液于分光光度計上測定645 nm處吸光值(記為A645)。總?cè)~綠素含量(Ct，mg/L)計算式如下：Ct=A645×1 000÷34.5。

1.2.7 柑桔潰瘍病菌的熒光顯微鏡觀察 試驗所用的Xcc經(jīng)改造后融合有GFP蛋白，在熒光顯微鏡下可觀察到細菌GFP熒光。在注射Xcc菌懸液后1、3、5、7和9 d，分別選取各組注射柑桔葉片，用6 mm孔徑打孔器在葉片邊緣打孔，每組3個重復，將打孔取下的葉圓片加入2 mL離心管中，放入2顆研磨珠和200 μL無菌水，磨樣機磨樣后3 000 轉(zhuǎn)/min離心30 s，吸取上清液至新的1.5 mL離心管中，取10 μL滴加到血細胞計數(shù)板上，熒光顯微鏡下進行觀察、拍照并計算柑桔潰瘍病菌數(shù)，每組進行3次生物學重復。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用SAS 8.1軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，依據(jù)鄧肯氏新復極差法比較顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SA處理對發(fā)病癥狀的影響

試驗結(jié)果看出，未經(jīng)過SA處理的甜橙與枳均在接種Xcc后的第3天開始出現(xiàn)發(fā)病癥狀，并隨著時間的延長逐漸加重；枳的病癥較甜橙更嚴重，接種第9天枳葉片開始出現(xiàn)顯著的水漬化病癥。經(jīng)過SA處理后，甜橙和枳接種Xcc后的發(fā)病表型均得到緩解，癥狀更輕。經(jīng)過SA處理或未經(jīng)過SA處理的金彈接種Xcc后均無顯著病癥出現(xiàn)，但未經(jīng)過SA處理的葉片接種Xcc后有黃化傾向(見圖1)。這表明金彈對柑桔潰瘍病具有很高的抗性；SA處理確實可以增強3種柑桔材料對柑桔潰瘍病的抗性。

注：Cs：甜橙；Ptr：枳；Fc：金彈；Xcc：接種潰瘍病菌(未經(jīng)水楊酸處理)；Xcc+SA：水楊酸處理后接種潰瘍病菌。圖2和圖3同。

2.2 SA處理對感病后病菌增殖的影響

試驗結(jié)果看出，未經(jīng)SA處理的甜橙、枳和金彈分別在接種Xcc后第3天、第3天和第5天開始能夠觀察到細菌GFP熒光，且隨著時間的推移，細菌數(shù)量逐漸增大，到第9天，甜橙、枳和金彈的Xcc數(shù)量分別為3.36×107、4.75×107和1.9×107CFU/mL。經(jīng)過SA處理的甜橙、枳和金彈均在接種Xcc后第5天開始能夠觀察到細菌GFP熒光；到第9天，甜橙、枳和金彈的Xcc數(shù)量分別為1.39×107、2.05×107和1.18×107CFU/mL，均顯著低于對應時間未處理組材料(見圖2)。這表明，SA處理能夠抑制甜橙、枳和金彈體內(nèi)Xcc的增殖。

圖2 3種柑桔材料經(jīng)水楊酸處理后接種柑桔潰瘍病菌的增殖情況

2.3 SA處理對感病后死亡細胞數(shù)量的影響

試驗結(jié)果看出，甜橙、枳和金彈對照(清水處理并接種清水)葉片均未被染色。未經(jīng)SA處理的甜橙、枳和金彈，葉片接種Xcc后，接種部位出現(xiàn)不同范圍的染色，其中，枳的染色程度最深、范圍最廣，其次是甜橙，金彈僅在接種臨近部位有較淺染色。經(jīng)過SA處理的甜橙、枳和金彈，葉片接種Xcc后，其染色程度均有明顯降低，尤其金彈的葉片幾乎無染色癥狀出現(xiàn)(見圖3)。這表明，接種Xcc后，金彈葉片細胞的死亡量較甜橙與枳更少，同時，SA處理可以降低3種柑桔材料細胞的死亡量。

圖3 3種柑桔材料經(jīng)水楊酸處理后接種柑桔潰瘍病菌葉片的臺盼藍染色

2.4 SA處理對感病后細胞膜透性和葉綠素含量的影響

試驗結(jié)果看出，未經(jīng)SA處理的甜橙、枳和金彈接種Xcc后葉片的相對電導率分別為19.3%、26.6%和13.6%，均顯著高于清水處理并接種清水的對照(分別為14.1%、13.7%和11.0%)，與經(jīng)過SA處理3種柑桔材料接種Xcc后葉片相對電導率(分別為17.5%、25.6%和11.7%)差異不顯著(見圖4)。這表明，接種潰瘍病菌后，金彈葉片細胞膜受損程度最輕，而甜橙和枳葉片受損程度較重；經(jīng)過SA處理后對感染潰瘍病菌后的細胞膜受損的改善不明顯。

注：數(shù)柱上不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。表5同。

未經(jīng)SA處理的甜橙、枳和金彈，接種Xcc后葉片葉綠素含量(分別為1.62、4.46和1.03 mg/g)，顯著低于清水處理并接種清水的各對照(分別為3.89、5.06和8.00 mg/g)。其中，金彈的降幅最大，這與金彈葉片接種Xcc后出現(xiàn)黃化癥狀的現(xiàn)象吻合。經(jīng)過SA處理后的3種材料接種Xcc后葉片中葉綠素含量(分別為2.87、4.84和4.22 mg/g)與經(jīng)SA未處理相比均有不同程度的升高，光合效率均得到一定程度的改善(見圖5)。

圖5 3種柑桔材料經(jīng)水楊酸處理后接種柑桔潰瘍病菌葉片的葉綠素含量

2.5 SA處理對抗性相關(guān)基因表達的影響

試驗結(jié)果看出，經(jīng)SA處理后，抗病基因NPR1、EDS1、ICS1、PAD4和PR1在3種柑桔材料中均有不同程度的上調(diào)表達。其中，NPR1、PR1在金彈中被誘導上調(diào)表達最明顯，SA處理3 h時的相對表達量(NPR1為4.81，PR1為12.59)顯著高于甜橙和枳。經(jīng)SA處理后，PAL1基因在甜橙中的表達量無顯著變化，但在金彈和枳中均上調(diào)表達(見圖6)。

注：星號表示數(shù)值與對應0 h的差異顯著性，*p< 0.05，** p< 0.01，*** p< 0.001。

3 討論

SA是植物免疫反應中起重要作用的信號分子，當植物受到活體營養(yǎng)型病原侵染后，體內(nèi)SA合成急劇增加，進而激活植物對病原產(chǎn)生抗性反應，因此SA是植物體內(nèi)重要的抗病激素[35]。本研究通過比較柑桔亞科3個屬中(金彈屬、柑桔屬和枳屬)代表柑桔種(金彈、甜橙和枳)經(jīng)過SA處理與否，接種柑桔潰瘍病菌后的發(fā)病表型與相關(guān)生理數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與未經(jīng)SA處理的柑桔材料相比，經(jīng)過SA處理的柑桔材料接種柑桔潰瘍病菌后，死亡細胞數(shù)量減少，相對電導率降低，葉綠素含量提高，柑桔潰瘍病菌繁殖量也顯著減少。這證明了，SA確實可以誘導金彈、甜橙和枳對柑桔潰瘍病菌的抗性。

進一步分析SA處理后3種材料抗病相關(guān)基因的表達量，發(fā)現(xiàn)NPR1和PR1在金彈中被誘導上調(diào)表達且顯著高于甜橙和枳。眾所周知，SA能誘導包括PR蛋白(pathogenesis-related protein)等多種抗病相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，從而使植物產(chǎn)生系統(tǒng)獲得性抗性。NPR1基因位于SA信號的下游、PR蛋白的上游，是植物SA信號傳導過程中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[36]。PAD4(phytoalexin deficient 4)和EDS1(enhanced disease susceptibility 1)形成的復合模型位于SA信號通路的上游，可以促進SA在植物體內(nèi)的積累，SA積累的反饋回路又可以增強EDS1、PAD4等基因的表達，從而進一步增加植物的抗性功能[37]。PR1是SA誘導激活的PR家族基因中的一員，也是NPR1的下游調(diào)控因子，在植物抗病防御過程中扮演了重要的作用[38]。以上3個基因都是參與SA信號通路且在植物抗病響應過程中起正向調(diào)節(jié)作用的關(guān)鍵基因。經(jīng)SA處理，NPR1和PR1基因的表達量在金彈葉片中的誘導上調(diào)程度顯著地高于甜橙與枳，PAD4基因上調(diào)表達水平也較高，表明金彈在SA誘導的抗病通路中響應程度較高。進一步推測，金彈對柑桔潰瘍病的高抗能力，可能與其受到柑桔潰瘍病菌入侵時，體內(nèi)這3個抗病基因會顯著上調(diào)相關(guān)。