王春艷 臘貴曉 蘇秀紅 李萌 董誠明

（1 河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450046；2 呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450000；3 河南省農(nóng)業(yè)科學院經(jīng)濟作物研究所，鄭州 450002）

植物內(nèi)生細菌是指能夠從表面消毒后的植物組織內(nèi)分離得到或植物體內(nèi)提取得到的，并且是對植物無實質(zhì)性危害的一類細菌［1］，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分。研究報道指出，植物內(nèi)生細菌可以通過產(chǎn)生長素IAA、溶磷、產(chǎn)鐵載體以及固氮等直接或間接地促進植物的生長。除此以外，內(nèi)生細菌對宿主植物還具有生物防治，增強植物抗逆性，修復植物重金屬污染等作用。由此說明，內(nèi)生細菌與宿主植物之間的互作對植物的生長具有重要意義。地黃為玄參科植物地黃Rehmannia glutinosa 的新鮮或干燥塊根，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因其藥用歷史悠久、臨床療效確切，已成為我國現(xiàn)代大中藥產(chǎn)業(yè)鏈重點推薦研究利用的大宗藥材之一［2］。隨著需求量的增加，地黃種植面積也逐年增加，在其種植過程中，由于過度施用化肥和農(nóng)藥，造成了其種植地的土壤板結(jié)，肥力下降，微生態(tài)失衡，土地生產(chǎn)能力下降，進而影響了地黃藥材的可持續(xù)發(fā)展。因此，克服過度使用化肥和農(nóng)藥帶來的危害，建立一個綠色環(huán)保的中藥材農(nóng)業(yè)生態(tài)和環(huán)境技術(shù)體系是亟待解決的問題。在當前生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展形勢下，開辟生物菌肥替代部分化肥日益受到重視。

目前地黃的研究主要集中在質(zhì)量評價、藥理作用、有效成分、炮制、配伍、栽培等方面［3-6］，關(guān)于地黃內(nèi)生菌的研究主要集中在內(nèi)生細菌和內(nèi)生真菌的抗病原菌上，而關(guān)于地黃內(nèi)生促生細菌研究鮮為少見，趙龍飛等［7］只在塊根組織中分離了內(nèi)生細菌，并作了促生潛能分析，未對不同時期地黃根、莖、葉進行內(nèi)生促生細菌分離。本研究采用純培養(yǎng)法分離了地黃苗期、盤棵期、膨大前期、膨大中期、膨大后期和成熟采收期等健康植株的內(nèi)生細菌，并采用形態(tài)學、生理生化和16S rRNA相結(jié)合的方法進行了鑒定分析，通過檢測產(chǎn)IAA、鐵載體活性，溶磷，固氮能力實驗，篩選出具有潛在促生能力的內(nèi)生細菌，以期為研究地黃專用微生物促生菌肥提供參考，并為后續(xù)微生物促生菌肥應用到地黃大田實驗中奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料 材料于2020年5月上旬-11月上旬采自河南省焦作市武陟縣不同時期（苗期、盤棵期、膨大前、中、后期和成熟采收期）地黃健康植株，采集樣品后立即放入保鮮袋中，帶回實驗室立即進行內(nèi)生細菌的分離。

1.1.2 主要儀器與試劑 MP-250B型培養(yǎng)箱；ISRDV3型恒溫振蕩器；LDZX-50KMS型立式壓力蒸汽滅菌器；FA2204N型電子天平；SW-CJ-1C型超凈工作臺；XS-A4-SUNNY型生物顯微鏡；5810R型高速冷凍離心機；A5系列雙光束紫外可見分光光度計；DDSJ-308A型酸度計；JS-680D型全自動凝膠成像分析儀。

氯化鈉，硫酸鈉，氯化鉀，乙醇（分析純，天津市致遠化學試劑有限公司）；磷酸二氫鉀，氫氧化鈉（分析純，天津市恒興化學試劑制造有限公司）；次氯酸鈉（分析純，鄭州派尼化學試劑廠）；Salkowski顯色劑；鉬銻鈧顯色劑；CAS檢測液；10 mol/L的磷酸鹽緩沖液（pH 6.8）；0.5%溴百里酚藍溶液；三丁酸甘油酯乳化液。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基；IAA培養(yǎng)基［8］；PKO（固 /液體）培養(yǎng)基［9］；CAS檢測培養(yǎng)基、MKB液體培養(yǎng)基［10］；固氮培養(yǎng)基（Nfb培養(yǎng)基）。

1.2 方法

1.2.1 地黃內(nèi)生細菌的分離 分別選取各個時期的地黃植株的新鮮塊根、莖和葉用流水將其表面的泥土沖洗干凈后，肥皂水浸泡30 min，之后用流水沖洗1-2 h，然后用70%酒精分別消毒塊根（10 min）、莖（8 min）和葉（6 min），無菌水沖洗6次，再用0.1%的HgCl2消毒20 s，無菌水沖洗6次。然后將各組織置于滅菌濾紙皿中，吸干其表面的水分，備用。吸取200 μL最后一次的洗滌水涂布到LB固體平板上作為空白對照，重復3次，置于30℃恒溫箱中培養(yǎng)10 d，期間觀察平板上的變化，如無菌落產(chǎn)生，則表明消毒徹底。分別稱取1 g表面消毒徹底的塊根、莖和葉，置于無菌研缽中，加入9 mL的無菌蒸餾水進行研磨，將其研磨成勻漿狀態(tài)，再分別吸取1 mL研磨好的勻漿，并按照10-1-10-5濃度梯度進行稀釋后，分別取200 μL稀釋液均勻涂布到LB培養(yǎng)基中，各處理重復3 次，30℃下倒置恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3 d。待細菌菌落長出后，參考《伯杰細菌手冊》［11］和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［12］將不同形態(tài)、顏色等特征的單菌落反復連續(xù)劃線培養(yǎng)，直到獲得形態(tài)完全一致的單菌落，對形態(tài)特征完全一致的菌落進行革蘭氏染色，并置于顯微鏡下觀察其鏡檢形態(tài)，如果鏡檢形態(tài)特征也一樣，則將菌株合并為一組，將純化后單菌落保存于斜面培養(yǎng)基上，并用50.0%甘油進行封存，置于-20℃的冰箱中冷凍保存，備用。

1.2.2 菌株生理生化檢測及16S rRNA分子鑒定 根據(jù)《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》［12］對待測菌株進行常規(guī)的生理生化檢測，包括甲基紅（MR）、V-P、檸檬酸鹽、葡萄糖發(fā)酵、乳糖發(fā)酵、H2S、明膠液化、接觸酶、氧化酶、淀粉酶等試驗。

參照李朝輝［13］的方法對其進行DNA的提取與PCR擴增。PCR 產(chǎn)物純化后送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。將所獲得的16S rRNA 基因序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫中，與核苷酸數(shù)據(jù)庫中16S rRNA基因序列進行相似性比對［14］。結(jié)合形態(tài)及生理生化鑒定結(jié)果，初步判定菌株所屬類群，確定地黃內(nèi)生細菌種屬地位。

1.2.3 產(chǎn)IAA內(nèi)生細菌的篩選 菌株產(chǎn)IAA量采用Salkowski 比色法測定，參考Patten［8］的方法，將內(nèi)生細菌接種到含有L-色氨酸（濃度0.2 g/L）的LB液體培養(yǎng)基中，130 r/min、30℃培養(yǎng)48 h后，取一定量的菌液，以10 000 r/min離心5 min后，取1 mL上清液與2 mL Salkowski，S顯色劑充分混勻，以1 mL未接菌的LB液體培養(yǎng)基與2 mL的S顯色劑混合均勻作為空白對照，每個處理3次重復，避光靜置30 min后，觀察混合液的顏色變化。若混合液的顏色變成粉色，表明該菌株具有產(chǎn)IAA的能力。制備 濃 度 為 0、2.5、5.0、7.5、10、12.5、15、17.5、20 mg/L的IAA標準溶液，繪制IAA標準曲線，根據(jù)標準曲線，計算菌株IAA產(chǎn)量。

1.2.4 溶磷內(nèi)生細菌的篩選 用溶磷圈法檢測待測內(nèi)生細菌溶磷能力，每個菌株3次重復，進行溶磷能力初篩。將初篩后具有溶磷能力的內(nèi)生細菌以鉬銻抗比色法測定菌液的有效磷含量，培養(yǎng)液以130 r/min、30℃培養(yǎng)24 h，以10 000 r/min離心5 min，具體操作參考唐玉娟等［9］。

1.2.5 產(chǎn)鐵載體內(nèi)生細菌的篩選 參考Schwyn等［10］的方法檢測內(nèi)生細菌產(chǎn)鐵載體能力。將待測菌株等距離點接種于CAS檢測培養(yǎng)基上，每個菌株重復3次，于30℃培養(yǎng)3 d后，觀察菌落附近是否產(chǎn)生橘黃色的暈圈以此判斷內(nèi)生細菌是否具有產(chǎn)鐵載體的能力。將具有產(chǎn)鐵載體能力的菌株用CAS比色法測定，具體操作參考王歡等［15］。

1.2.6 具備固氮能力內(nèi)生細菌的篩選 按照Andrade等［16］等人的方法對內(nèi)生細菌進行固氮能力的篩選。將已活化的內(nèi)生細菌接種于Nfb半固體培養(yǎng)基中，30℃恒溫培養(yǎng)5 d后，觀察培養(yǎng)基中是否有菌膜的出現(xiàn)，如果有菌膜的出現(xiàn)，則說明該菌種具有固氮的能力，否則，說明該菌種沒有固氮能力。對具固氮潛力的內(nèi)生細菌進行固氮酶基因nifH的擴增：（1）按照1.2.2方法進行內(nèi)生細菌DNA的提取。（2）用引物 nifH-F（5′-AAAGGYGGWATCGGYAART CCACCAC-3′）和 nifH-R（5′-TTGTTSGCSGCRTACAT SGCCATCAT-3′）［17］對提取的 DNA 進行 PCR 擴增。（3）50 μL PCR 反 應 體 系 ：25 mmol/L MgCl25 μL，10×Buffer 5 μL，5 mmol/L dNTPs 1 μL，10 μmol/L nifH-F 1 μL，10 μmol/L nifH-R 1 μL，5 U/μL Taq DNA Polymerse 0.25 μL，DNA 模板 1 μL，補 ddH2O 至 50 μL。（4）PCR 擴增程序［18］：94℃預變性 5 min，30個循環(huán)，包括94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，最后72℃延伸10 min。若PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測，出現(xiàn)特異性條帶（約460 bp），則說明該菌種含固氮酶基因nifH。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 使用 SPSS 16.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用方差分析（ANOVA）和 Tukey 檢驗進行方差分析和多重比較（α=0.05），使用 Origin 8.1軟件進行數(shù)據(jù)處理及作圖。圖表中數(shù)據(jù)為平均值±標準差。

2 結(jié)果

2.1 內(nèi)生細菌的分離

從地黃6個不同時期的塊根、莖和葉中共分離到512株內(nèi)生細菌。其中由苗期分離出45株，盤棵期分離到67株，膨大前期分離出70株，膨大中期分離到95株，膨大后期分到104株，成熟采收期分到131株，共計512株。

根據(jù)平板上菌落的形態(tài)，顏色、菌落透明度、表面是否光滑、是否凸起及菌落邊緣情況等形態(tài)特征，并根據(jù)光學顯微鏡下內(nèi)生細菌的鏡檢結(jié)果，同時參考生理生化特征檢測結(jié)果對分離出的菌株進行同類合并，最終將其初步鑒定分為54組，并從每一組中選取一株內(nèi)生細菌，并進行編號為ER1-ER54，進行16S rRNA分子鑒定，結(jié)果見表1。

表1 地黃內(nèi)生細菌16S rRNA鑒定Table 1 Identification of endophytic bacteria in R.glutinosa via16S rRNA

2.2 產(chǎn)IAA能力的測定

IAA顯色發(fā)現(xiàn)，54株內(nèi)生細菌中有41株（75.9%）在L-色氨酸存在的條件下，與Salkowski，S顯色劑反應后顏色均顯示為粉色。但各個菌株之間呈現(xiàn)的顏色深淺不一，反映菌株合成IAA能力強弱的不同。如 E.soli ER49，E.cloacae ER44、E.bugandensis ER45、E.xiangfangensis ER48，4個菌株顯色反應為粉紅色，顏色表現(xiàn)較深，說明合成IAA的能力較強。有11個菌株顏色表現(xiàn)次之，為粉色，表明其合成IAA的能力中等；其余26個菌株顏色為淺粉色，表明合成IAA的能力相對其他菌株較弱；剩余的13個菌株沒有顏色變化，說明這些內(nèi)生細菌不具備合成IAA的能力。

根據(jù)IAA標準溶液的濃度與對應的OD530，繪制成IAA標準曲線為：y=0.033 2x+0.008 9，其R2值為0.999 3。將上述初篩產(chǎn)IAA的內(nèi)生細菌進一步地進行產(chǎn)IAA含量的測定，結(jié)果（表2）顯示，41株內(nèi)生細菌均能檢測到產(chǎn)IAA，產(chǎn)量在2.15 mg/L-27.35 mg/L之間，且各菌株產(chǎn)IAA的能力具有顯著性差異。其中，菌株E.soli ER49 產(chǎn)IAA的量最高，為27.35 mg/L；其次是菌株E.cloacae ER44和E.bugandensis ER45，產(chǎn)量分別為27.29 mg/L和25.93 mg/L；產(chǎn)IAA量最低的菌株是B.siamensis ER9，只有2.15 mg/L。

表2 內(nèi)生細菌IAA分泌量Table 2 IAA secretion from endophytic bacteria

2.3 溶磷能力的測定

內(nèi)生細菌溶磷初篩結(jié)果發(fā)現(xiàn)，54株內(nèi)生細菌有29株（53.7%）內(nèi)生細菌產(chǎn)生了溶磷圈（圖1，表3），其中有12株內(nèi)生細菌屬于芽孢桿菌屬，占溶磷菌株的41.4%。由表3可知，各個菌株D/d值的大小在1.13-2.44之間。29株內(nèi)生細菌有6種的D/d值在2.0-2.5之間，表明溶磷能力強；11株的D/d值在1.5-2.0之間，表明溶磷能力中等；12株的D/d值在1.0-1.5之間，表明溶磷能力弱。最大的D/d比值出現(xiàn)在菌株K.rosea ER51，其次是菌株P(guān).psychrotolerans ER35和B.siamensis ER9，D/d值分別為2.31和2.17；最小的D/d比值（1.13）出現(xiàn)在菌株P(guān)roteus mirabilis ER37。

圖1 不同菌株溶磷圈的大小Fig.1 Size of phosphorus dissolving circle of different strains

根據(jù)OD700與磷標準溶液濃度繪制有效磷標準曲線，確定了有效磷濃度標準曲線計算公式：y=0.359 3x+0.005 6。其中R2為0.999 2。溶磷量結(jié)果如表3所示，54株內(nèi)生細菌有29株（53.7%）均被檢測到溶磷，溶磷量在6.32 mg/L-133.65 mg/L之間，且菌株之間溶磷量具有顯著差異。其中溶磷量最大的菌株為P.aeruginosa ER32，為133.65 mg/L；其次是菌株B.siamensis ER9，K.rosea ER51和B.aquimaris ER15，溶磷量分別為120.52 mg/L、112.91 mg/L和103.27 mg/L；最小溶磷量的菌株是Terribacillus goriensis ER50，為 6.32 mg/L。

表3 內(nèi)生細菌溶磷能力測定Table 3 Determinationof phosphorus dissolving capacity of endophytic bacteria（D/d）

2.4 產(chǎn)鐵載體能力的測定

54株內(nèi)生細菌有28株（51.9%）內(nèi)生細菌菌落周圍出現(xiàn)了橘黃色的暈圈，說明這些內(nèi)生細菌具有產(chǎn)鐵載體的能力。主要為Bacillus、Pseudomonas、Brachybacterium、Lysinibacillus、Enterobacter、Brevibacterium和Halomonas等7個屬，其中Bacillus屬于優(yōu)勢菌屬，占產(chǎn)鐵載體菌株的53.6%。部分內(nèi)生細菌產(chǎn)鐵載體平板檢測如圖2所示。

圖2 不同菌株產(chǎn)鐵載體活性比較Fig.2 Comparison of the activities of different strains producing iron carrier

初篩得到的產(chǎn)鐵載體內(nèi)生細菌進行產(chǎn)鐵載體定量測定，結(jié)果（表4）顯示，A/Ar（接菌吸光度值/未接菌吸光度值）比值在0.14-0.79之間，各菌株產(chǎn)鐵載體量存在顯著性差異。其中，菌株B.subtilis ER10，L.fusiformis ER43、E.bugandensis ER45和 B.amyloliquefacieus ER7，4個菌株的A/Ar值分別為0.14、0.16、0.17和0.20，說明這4個菌株產(chǎn)鐵載體的能力最強；有9個菌株A/Ar比值次之，范圍在0.28-0.39之間，說明這9個菌株產(chǎn)鐵載體的能力較強。

表4 內(nèi)生細菌產(chǎn)鐵載體的能力Table 4 Abilities of producing iron carrier by endophytic bacteria

2.5 固氮能力內(nèi)生細菌的篩選

內(nèi)生細菌在半固體Nfb培養(yǎng)基中若能產(chǎn)生固氮菌膜，則說明其具備固氮能力。表5結(jié)果顯示，54株內(nèi)生細菌有25株（46.3%）能夠在半固體Nfb培養(yǎng)基中產(chǎn)生固氮菌膜。具有固氮能力的內(nèi)生細菌分布于不同的菌屬，主要包括Bacillus、Pseudomonas、Lysinibacillus、Brachybacterium、Enterobacter、Terribacillus、Kocuria、Halomonas和 Microbacterium等9個屬。固氮內(nèi)生細菌中，Bacillus占44.0%，其次為Pseudomonas，占20.0%。

表5 內(nèi)生細菌固氮能力的篩選Table 5 Screening the nitrogen fixation abilities of endophytic bacteria

利用固氮菌特異性引物對這25株內(nèi)生細菌進行nifH基因的擴增，結(jié)果顯示，均能夠擴增出約460 bp的目的條帶（圖3），由此說明這些具固氮潛力的內(nèi)生細菌均含有固氮酶基因nifH基因。

圖3 內(nèi)生細菌nifH基因的擴增Fig.3 Amplification of nifH gene in endophytic bacteria

3 討論

內(nèi)生細菌是蘊藏在植物體內(nèi)的一類重要微生物資源，對植物的生長發(fā)育具有重要的調(diào)控作用［19］。本研究從地黃中分離出 512 株內(nèi)生細菌，并選出形態(tài)最有辨識特征的54株進行鑒別，并歸為14個屬54個種，主要分布于芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、大腸埃希菌屬。其中芽孢桿菌屬占分離總數(shù)的62.5%，為地黃優(yōu)勢菌屬，除了芽孢桿菌屬和假單胞菌屬，其他菌屬均是首次從地黃中分離得到。分離出的菌株數(shù)量和種類遠高于前人的研究，如楊清香等［20］共從懷地黃中分離出67株內(nèi)生細菌；王瑞飛等［21］分離出30株內(nèi)生細菌。芽孢桿菌屬作為多種植物的優(yōu)勢菌屬已被報道［22-24］。研究表明，芽孢桿菌屬可將土壤中難溶性的磷轉(zhuǎn)化為可溶性的磷［25］，也可通過產(chǎn)IAA促進植物的生長［26］，是研制微生物菌肥的重要類群；不僅如此，該屬還可作為生防細菌，有效防止植物炭疽?。?7］。除芽孢桿菌屬外，本研究分離的假單胞菌屬、腸桿菌屬的種類（8種和6種）僅次于芽孢桿菌屬；這兩個菌屬已被用于合成功能活性物質(zhì)、篩選醫(yī)用抗生素、防治農(nóng)業(yè)病蟲害等領(lǐng)域［28-30］。因此，本研究進一步對分離的內(nèi)生細菌進行了功能篩選。

植物內(nèi)生細菌可通過產(chǎn)生植物激素來促進植物的生長發(fā)育，其中最為活躍的為IAA。目前已經(jīng)從植物中分離鑒定出多種能夠產(chǎn)IAA的菌屬，其中最為常見的為芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腸桿菌屬、微桿菌屬等，且均為高產(chǎn)主體菌［31-32］。本研究的結(jié)果同于前人的研究，在本研究中，54種內(nèi)生細菌中，高產(chǎn)IAA菌株排名前3的均為腸桿菌屬，且不同種類的內(nèi)生細菌產(chǎn)IAA的能力具有顯著性差異，原因可能與內(nèi)生細菌自身的結(jié)構(gòu)有關(guān)，后續(xù)會進一步探索。

由于在土壤中鐵的可溶性含量較低，難以被植物直接吸收利用，因此鐵元素已成為限制植物生長發(fā)育的關(guān)鍵因素之一。內(nèi)生細菌產(chǎn)生的鐵載體可作為鐵和其他礦物或有機化合物中其他金屬的增溶劑，以增加植物和微生物對鐵的利用［33］。本研究發(fā)現(xiàn)菌株ER10 B.subtilis、ER43 L.fusiformis、ER45 E.bugandensis和ER7 B.amyloliquefacieus等4個菌株產(chǎn)鐵載體能力最強，說明芽孢桿菌屬、賴氨酸芽孢桿菌屬和腸桿菌屬為地黃高產(chǎn)鐵載體內(nèi)生菌屬。孫磊等［34］對春蘭根部189株內(nèi)生細菌產(chǎn)鐵載體檢測發(fā)現(xiàn)，只有24.9%的內(nèi)生細菌可產(chǎn)鐵載體，這一結(jié)果小于本研究從地黃中篩選出的產(chǎn)鐵載體的內(nèi)生細菌（51.6%）。這可能與宿主植物的種類，內(nèi)生細菌的生存環(huán)境以及其應對低鐵環(huán)境的能力有關(guān)。

本研究結(jié)果中有25株內(nèi)生細菌具有固氮功能的潛力，且已有文獻證明Bacillus licheniformis ER4［35］、Bacillus cereus ER5［36］、Bacillus amyloliquefacieus ER7［37］、Bacillus subtilis ER10［38］、Bacillus aryabhattai ER12［39］、Bacillus marisflavi ER16［40］、Bacillus flexus ER23［41］、Pseudomonas fluorescens［42］、Enterobacter cloacae ER44［43］、Pseudomonas monteilii ER30［44］等均具有固氮的作用，與本實驗結(jié)果一致。

綜上所述，地黃不同生長發(fā)育時期存在豐富多樣性的內(nèi)生細菌，對于揭示內(nèi)生細菌維持地黃微生態(tài)環(huán)境的動態(tài)平衡提供幫助，同時可為后續(xù)內(nèi)生細菌促生特性的研究提供豐富的內(nèi)生細菌資源，進而為進一步挖掘內(nèi)生細菌與植物之間的互作關(guān)系奠定基礎。

4 結(jié)論

從地黃不同時期根、莖、葉中分離出512株內(nèi)生細菌，其中41株具有產(chǎn)IAA的能力，29株具有溶磷能力，28株具有產(chǎn)鐵載體能力，25株具有固氮能力。