高薇薇，高萬(wàn)朋，關(guān)鵬，王梟

天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，天津 300000

膿毒癥(sepsis)是機(jī)體對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致危及生命的器官功能障礙，是感染、燒傷、創(chuàng)傷、休克等急危重患者的嚴(yán)重并發(fā)癥[1-2]，其本質(zhì)是促炎和抗炎反應(yīng)嚴(yán)重失衡導(dǎo)致的組織器官的損傷[3]。膿毒癥可以導(dǎo)致腸道免疫屏障紊亂，主要表現(xiàn)為過(guò)度的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腸屏障完整性受損以及腸道免疫抑制引起的腸道菌群紊亂和移位[4]，并可形成惡性循環(huán)，促進(jìn)或加重膿毒癥多器官功能障礙。增液通腑逐瘀方在增液承氣湯基礎(chǔ)上加味而成，可明顯改善膿毒癥患者胃腸功能及預(yù)后[5-6]，但其分子生物學(xué)機(jī)制尚不完全明確。膿毒癥腸道免疫失衡和腸道菌群紊亂是膿毒癥腸屏障損傷的重要環(huán)節(jié)，本文通過(guò)觀察增液通腑逐瘀方對(duì)膿毒癥大鼠腸道免疫細(xì)胞Th17/Treg平衡和腸道菌群比例的影響，探討其對(duì)膿毒癥腸道免疫和腸道菌群平衡的調(diào)理作用，以及膿毒癥腸屏障損傷可能的發(fā)病機(jī)制，為增液通腑逐瘀方調(diào)理腸道免疫和腸道菌群以防治膿毒癥及其并發(fā)癥提供新的思路和研究方向。

1 材料

1.1 動(dòng)物SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量(200±10) g，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2020-2004，購(gòu)自北京華阜康生物技術(shù)有限公司。大鼠喂養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，保持環(huán)境恒溫恒濕，自由飲水，飼料固定，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院倫理委員批準(zhǔn)，倫理編號(hào)：ZYEFS-QMJH202014。

1.2 藥物與試劑玄參、麥冬、生地黃、生大黃、芒硝、紅藤、敗醬草(天津中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院飲片藥房)。Anti-Rat CD4 FITC、Anti-Rat CD25 APC、Anti-Mouse/Rat Foxp3 PE、Anti-Mouse/Rat IL-17A PE(美國(guó)eBioscience公司，批號(hào)：553654、558642、553102、506906)；BBL培養(yǎng)基、LBC培養(yǎng)基、EC培養(yǎng)基、EMB培養(yǎng)基 (青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)：HB0396、HB0385、HB0133、HB0107)。

1.3 儀器SORVALL LEGEND MACH 1.6/R型冷凍離心機(jī)(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司，離心半徑：8 cm)；IX2-SLP型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；BD FACS Calibur型流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD Biosciences公司)；WMZK-02型厭氧箱(浙江義烏冷凍機(jī)總廠)；ASV-3023型全自動(dòng)高壓滅菌鍋(日本Sakura公司)。

2 方法

2.1 藥物制備增液通腑逐瘀方由玄參20 g，麥冬20 g，生地黃20 g，生大黃(后下)15 g，芒硝(沖)10 g，紅藤30 g，敗醬草30 g組成。將除大黃、芒硝外的藥物用水浸泡0.5 h，武火煎至水開(kāi)后改文火煎 45 min，加入大黃，再煎15 min，加入芒硝攪勻后冷卻至室溫，將湯液濾出，分別制成濃度為 0.5 g·mL-1及 1 g·mL-1的藥液。

2.2 動(dòng)物模型建立、分組與藥物干預(yù)采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只SPF級(jí)雄性SD大鼠分為假手術(shù)組、模型組及增液通腑逐瘀方低劑量組、增液通腑逐瘀方高劑量組，每組10只。除假手術(shù)組外，其余組大鼠采用盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(cecal ligation and puncture surgery，CLP)建立膿毒癥模型[7]，具體如下：大鼠經(jīng)體積分?jǐn)?shù)2%戊巴比妥鈉麻醉后，采取前腹正中切口，取出盲腸，使用4號(hào)絲線在距離盲腸末端 1.5 cm處進(jìn)行結(jié)扎，用18號(hào)針頭在盲腸結(jié)扎處遠(yuǎn)端穿透3次，擠出腸管內(nèi)排泄物少許，并留置橡皮引流條以防針孔閉合，然后回納腹腔，逐層關(guān)腹。假手術(shù)組僅開(kāi)腹取出盲腸翻動(dòng)后再次還納腹腔，不進(jìn)行結(jié)扎和穿刺。增液通腑逐瘀方低劑量組(0.5 g·mL-1)、高劑量組(1 g·mL-1)大鼠術(shù)前及術(shù)后24 h分別以 5 mL·kg-1的劑量灌胃給予增液通腑逐瘀方溶液，模型組及假手術(shù)組灌胃給予同體積生理鹽水，每天1次，連續(xù)3 d。觀察各組大鼠72 h內(nèi)的生存情況。

2.3 HE染色評(píng)估腸黏膜損傷程度在距回盲部15 cm處取2 cm回腸，制作組織切片并進(jìn)行HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。通過(guò)Digimizer彩色網(wǎng)像分析系統(tǒng)確定腸黏膜絨毛高度、腸腺隱窩深度、黏膜厚度以及絨毛表面積。每只動(dòng)物取5張不連續(xù)的病理切片，每張切片順次取光學(xué)顯微鏡下奇數(shù)視野觀測(cè)10個(gè)小腸絨毛，取平均值。腸絨毛表面積=πdh(d為絨毛中段直徑，h為腸絨毛高度)。根據(jù)Chiu′s腸黏膜損傷評(píng)分法[8]，對(duì)小腸黏膜損傷程度進(jìn)行分級(jí)。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下：0分：腸黏膜絨毛正常；1分：絨毛頂端上皮下出現(xiàn)囊狀間隙，并伴有毛細(xì)血管充血；2分：上皮下間隙擴(kuò)大，中度固有層水腫，中央乳糜管擴(kuò)張；3分：固有層明顯水腫，腸黏膜上皮層細(xì)胞變性、壞死，少數(shù)絨毛頂端脫落；4分：上皮細(xì)胞層變性、壞死、脫落、部分絨毛脫落，固有層裸露，毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血；5分：絨毛脫落、固有層崩解，出血或潰瘍形成。

2.4 輔助性T細(xì)胞17(T helper cell 17，Th17，CD4+IL-17+)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell，Treg，CD4+CD25+Foxp3+)的檢測(cè)取出結(jié)腸，去除腸道上粘連的脂肪，并用彎剪剪除Peyer′s Patch(PP結(jié))，縱向剪開(kāi)腸道，用PBS清洗預(yù)消化的腸段2～3次，用剪刀將腸段剪至1～2 mm，置預(yù)冷的含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液中，100目不銹鋼細(xì)胞篩輕輕研磨，400目尼龍網(wǎng)過(guò)濾并于800 r·min-1離心10 min。細(xì)胞重懸在適量培養(yǎng)液中，即獲得腸道固有層淋巴懸液。加細(xì)胞懸液于大鼠淋巴細(xì)胞分離液進(jìn)行分層，2 000 r·min-1離心20 min，輕取界面細(xì)胞，培養(yǎng)液洗1次，細(xì)胞重懸在適量的培養(yǎng)液中。在混勻的細(xì)胞懸液中加入10 μL FITC-抗CD4單抗，孵育30 min。PBS清洗后加入300 μL固定液，避光孵育15 min。PBS清洗后，加入破膜液并于 3 000 r·min-1離心5 min，棄上清。加入20 μL PE-抗IL-17單抗，室溫避光孵育30 min，隨后PBS清洗，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。用0.3 mL PBS重懸細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測(cè)Th17細(xì)胞比例。在混勻的細(xì)胞懸液中加入10 μL FITC-抗CD4單抗、10 μL APC-抗CD25單抗，孵育30 min后利用PBS清洗。每管加入0.5 mL的Foxp3固定液混勻，靜置20 min。PBS清洗后1 000 r·min-1離心 5 min，棄上清，每管加入0.5 mL Foxp3穿孔液重懸細(xì)胞，靜置15 min后1 000 r·min-1離心5 min。棄上清，隨后加入10 μL PE-抗Foxp3抗體室溫避光孵育30 min。孵育結(jié)束后PBS清洗，1 000 r·min-1離心5 min，棄上清。用0.3 mL PBS重懸細(xì)胞上流式細(xì)胞儀檢測(cè)Treg細(xì)胞的比例。

2.5 腸道菌群檢測(cè)無(wú)菌狀態(tài)下取盲腸內(nèi)容物后加滅菌生理鹽水稀釋10倍，振蕩使之均質(zhì)化，再進(jìn)行10倍稀釋?zhuān)?5 μL稀釋液分別接種在各類(lèi)選擇性培養(yǎng)基上，將EMB培養(yǎng)基及EC培養(yǎng)基放入需氧環(huán)境中，35 ℃培養(yǎng)24 h后計(jì)數(shù)；BBL培養(yǎng)基、LBC培養(yǎng)基放入?yún)捬醐h(huán)境中，35 ℃培養(yǎng)48 h之后計(jì)數(shù)。根據(jù)菌落形態(tài)、涂片分析及耐氧實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算各菌群每克糞便中菌落形成單位(Logl0nCFU·g-1)。

3 結(jié)果

3.1 增液通腑逐瘀方對(duì)膿毒癥大鼠72 h生存數(shù)量的影響假手術(shù)組和增液通腑逐瘀方高劑量組72 h內(nèi)有10只大鼠存活，增液通腑逐瘀方低劑量組有9只大鼠存活，模型組有6只大鼠存活。經(jīng)χ2檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，四組大鼠72 h生存數(shù)量差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠72 h內(nèi)生存數(shù)量

3.2 增液通腑逐瘀方對(duì)膿毒癥大鼠小腸病理?yè)p傷的影響假手術(shù)組可見(jiàn)致密緊湊的小腸黏膜絨毛，無(wú)絨毛脫落和倒伏；模型組可見(jiàn)部分絨毛脫落以及倒伏，固有層部分脫落，可及裸露的毛細(xì)血管擴(kuò)張，甚至固有層蛻變或被消化、出血及潰瘍形成；增液通腑逐瘀方低、高劑量組對(duì)于固有層脫落及絨毛倒伏較模型組均有改善作用，其中增液通腑逐瘀方高劑量組改善更明顯。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腸隱窩深度、絨毛高度、絨毛表面積及黏膜厚度顯著降低(P<0.05)，Chiu′s評(píng)分顯著升高(P<0.05)；與模型組比較，增液通腑逐瘀方低、高劑量組大鼠腸隱窩數(shù)量、絨毛高度、絨毛表面積及黏膜厚度明顯升高(P<0.05)，Chiu′s評(píng)分顯著降低(P<0.01)。說(shuō)明增液通腑逐瘀方對(duì)于膿毒癥大鼠腸黏膜損傷具有修復(fù)作用。見(jiàn)圖1，表2。

注：A：假手術(shù)組；B：模型組；C：增液通腑逐瘀方低劑量組；D：增液通腑逐瘀方高劑量組圖1 增液通腑逐瘀方對(duì)膿毒癥大鼠小腸病理?yè)p傷的影響(HE染色，×100)

表2 增液通腑逐瘀方對(duì)膿毒癥大鼠小腸病理?yè)p傷的影響

3.3 增液通腑逐瘀方對(duì)膿毒癥大鼠結(jié)腸 Th17/Treg水平的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠結(jié)腸Th17細(xì)胞、Th17/Treg比值明顯升高(P<0.05)，Treg細(xì)胞比例明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，增液通腑逐瘀方低、高劑量組大鼠結(jié)腸Th17細(xì)胞、Th17/Treg比值明顯降低(P<0.05)，Treg細(xì)胞比例明顯升高(P<0.05)。表明增液通腑逐瘀方對(duì)膿毒癥大鼠腸道過(guò)度的炎癥反應(yīng)具有抑制作用，見(jiàn)表3。

表3 增液通腑逐瘀方對(duì)膿毒癥大鼠結(jié)腸Th17/Treg的影響

3.4 增液通腑逐瘀方對(duì)膿毒癥大鼠腸道菌群的影響與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腸道雙歧桿菌、乳酸菌的含量以及厭氧菌/需氧菌比例明顯降低(P<0.05)，大腸桿菌及腸球菌含量明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，增液通腑逐瘀方低劑量組、高劑量組大鼠雙歧桿菌、乳酸菌的含量以及厭氧菌/需氧菌比例明顯增高(P<0.05)，大腸桿菌及腸球菌含量明顯降低(P<0.05)。表明增液通腑逐瘀方具有維持腸道菌群平衡的作用，見(jiàn)表4。

表4 增液通腑逐瘀方對(duì)膿毒癥大鼠腸道菌群的影響

3.5 Th17/Treg與厭氧菌/需氧菌相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)性分析考察Th17/Treg與厭氧菌/需氧菌的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg與厭氧菌/需氧菌存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(rs<0，P<0.05)。

4 討論

增液通腑逐瘀方在增液承氣湯基礎(chǔ)上加味而成，該方由玄參、麥冬、生地黃，大黃(生)、芒硝、紅藤、敗醬草組成，具有益氣養(yǎng)陰、通腑瀉熱、活血化瘀的功效。方中大黃推陳致新、解毒化瘀、通經(jīng)活絡(luò)，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)，大黃對(duì)維持腸道免疫及腸道微生態(tài)平衡具有積極的作用；大黃素可抑制炎癥信號(hào)通路的激活進(jìn)而保持腸道機(jī)械屏障的完整，還可以減少細(xì)菌移位，保持腸道菌群平衡[9]。

腸道菌群平衡在腸道免疫中發(fā)揮重要作用[10]，與腸道免疫系統(tǒng)維持著一種平衡而又微妙的共生關(guān)系，以保持腸道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[11-12]。乳酸桿菌、雙歧桿菌、腸球菌、大腸桿菌是腸道常駐菌群，能阻止細(xì)菌、毒素和其他有害物質(zhì)入侵，抵抗?jié)撛谥虏⌒缘男柩蹙蛲庖u菌在黏膜上定植形成感染，降低病原體毒素，殺死并抑制外襲菌[13]。膿毒癥發(fā)生時(shí)，機(jī)體腸道菌群失調(diào)、紊亂，表現(xiàn)為厭氧菌數(shù)量減少，而需氧菌數(shù)量增多，厭氧菌、需氧菌比值明顯下降[14]，腸道定植抵抗力降低，潛在性病原體(包括條件致病菌)定植和入侵，引起腸道黏膜的免疫應(yīng)答，一旦這種免疫反應(yīng)超過(guò)了機(jī)體的接受能力，便可能引發(fā)腸道免疫功能失調(diào)，從而引發(fā)局部或全身性炎癥性疾病[15-16]。本次研究發(fā)現(xiàn)，增液通腑逐瘀方具有維持腸道菌群平衡的作用，可以抑制膿毒癥腸道菌群紊亂和菌群移位的發(fā)生，對(duì)于維持腸道穩(wěn)態(tài)具有積極的作用。

Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞之間的平衡對(duì)維持腸道免疫平衡具有重要意義。Th17主要分泌白細(xì)胞介素-17(interleukin-17,IL-17)、IL-22及少量的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、IL-6和IL-23等促炎介質(zhì)[13]，可抑制腸道致病菌在腸道內(nèi)的繁殖，防止腸道菌群移位[17-18]。Treg細(xì)胞被稱(chēng)為抑制性T淋巴細(xì)胞，主要分泌IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming grawth factor-β，TGF-β)[19]，抑制炎癥因子及免疫應(yīng)答過(guò)度激活對(duì)腸道屏障的損傷，進(jìn)而維持腸道屏障的完整性[20]。研究表明，Th17/Treg 失衡與膿毒癥和各種炎癥性疾病有關(guān)[21]。Th17/Treg比值的改變可提示腸道免疫功能紊亂，若這種免疫功能紊亂不能被糾正，則可能進(jìn)一步加重膿毒癥多臟器功能障礙，延長(zhǎng)疾病病程，增加死亡風(fēng)險(xiǎn)[22-26]。因此，調(diào)節(jié) Th17/Treg平衡可能是治療膿毒癥的有效措施[27]。本次研究發(fā)現(xiàn)，Th17/Treg與厭氧菌/需氧菌存在負(fù)相關(guān)關(guān)系。腸道免疫平衡與腸道菌群的穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，為中藥整體調(diào)節(jié)觀的微生態(tài)學(xué)提供了實(shí)驗(yàn)證據(jù)[28]。因此，腸道免疫及腸道微生態(tài)平衡對(duì)于保持腸道屏障完整性以及改善膿毒癥及多臟器功能障礙的預(yù)后具有重要意義[29]。

綜上，增液通腑逐瘀方可以修復(fù)膿毒癥導(dǎo)致的腸黏膜損傷，調(diào)節(jié)腸道菌群紊亂，促進(jìn)免疫平衡。其既可以抑制致病菌在腸道內(nèi)的過(guò)度繁殖，又可以抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)對(duì)腸屏障的損傷，進(jìn)而維持腸道生態(tài)平衡，防止腸道菌群移位對(duì)腸屏障和全身的二次傷害，促進(jìn)腸道功能恢復(fù)，體現(xiàn)了中藥治療的多途徑多靶點(diǎn)和整體觀的特點(diǎn)，為探索中藥調(diào)節(jié)腸道菌群途徑及免疫功能提供新的證據(jù)。