常艷賓 張麗麗 李 雁

（黑龍江省中醫(yī)藥科學院心五科，黑龍江 哈爾濱 150036）

肺動脈高壓（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種病變累及肺動脈血管內(nèi)皮細胞、肌層以及外膜而使肺動脈血流受限，導致肺血管阻力（Pulmonaryvascular resistance，PVR）進行性升高為主要特征，血流動力學異常致使右心負荷增大、右心功能不全，進而右心室肥厚擴張的一類惡性心臟血管性疾病[1-3]。PAH 患者大多數(shù)以活動耐力下降為首發(fā)癥狀，預(yù)后差，其致殘率及病死率都很高，是目前醫(yī)療衛(wèi)生急需解決的重要問題之一，其可以發(fā)展為難治性右心衰竭，并且其他類心臟疾病也可以在病程中晚期合并PAH，預(yù)后更為惡劣。目前臨床對PAH 的治療藥物主要有：前列環(huán)素類藥物、內(nèi)皮素受體拮抗劑、一氧化氮（NO）、5 型磷酸二酯酶（PDE-5）抑制劑等，但由于費用昂貴，給患者帶來了沉重的經(jīng)濟負擔。外科治療主要有房間隔造口術(shù)、肺移植等，手術(shù)風險大，適用范圍小，只能作為治療PAH 的最后手段。而且術(shù)后需終身口服免疫抑制劑等一系列術(shù)后問題及相關(guān)并發(fā)癥。因此，在PAH 的治療上仍需開發(fā)新型藥物。

PAH 主要的病理生理改變是內(nèi)皮功能障礙，導致肺血管收縮，最終產(chǎn)生肺動PAH。肺血管重塑、肺小動脈狹窄導致肺循環(huán)阻力增加，右心負荷增大，最終導致右心功能衰竭，是目前國內(nèi)外專家學者關(guān)于PAH 比較認可的發(fā)病機制。既往研究表明蘇木有免疫抑制、抗炎、抗動脈粥樣硬化、抑制心肌細胞凋亡、增強心肌收縮力、穩(wěn)定斑塊、保護心肌組織等作用[4-8]。但蘇木對PAH 是否具有防治作用及作用機制尚不明確。故本研究通過腹腔注射野百合堿（MCT）建立PAH 大鼠模型，觀察蘇木乙酸乙酯提取物對MCT 致PAH 模型大鼠保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心。實驗動物飼養(yǎng)按衛(wèi)生部發(fā)布的實驗動物管理指南執(zhí)行，在通風、溫度及濕度適宜的環(huán)境下自由攝食、飲水。

1.1.2 實驗藥物 蘇木乙酸乙酯提取物采用超聲振蕩提取法提取，由黑龍江中醫(yī)藥大學制劑室制備提供，用蘇木乙酸乙酯提取物溶于羧甲基纖維素鈉溶液，配制成濃度為73.6 mg/mL（低濃度）和147.2 mg/mL（高濃度）的藥液，現(xiàn)用現(xiàn)配。阿魏酸鈉購于黑龍江省哈爾濱博潤生物公司（純度為97%），用純度為97%阿魏酸鈉粉末9 g 溶于300 mL 羧基纖維素鈉溶液中，配制成濃度為30 mg/mL的溶液。

1.1.3 主要試劑及儀器 野百合堿（C240l-600 mg；購自sigma 公司，USA）；蘇木精-尹紅染色液（北京，biosharp 公司），大鼠血栓素A2 試劑盒（黑龍江省哈爾濱博潤生物公司，批號：R-D140305），前列環(huán)素試劑盒（黑龍江省哈爾濱博潤生物公司批號：R-D140305），雷杜酶標儀RT-6100（美國雷杜公司），光學顯微鏡（日本OLYMPUS 公司），Q5100W 病理圖像分析系統(tǒng)（德國LEICA公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 PA H 模型復(fù)制 將MCT 用2∶8 的無水乙醇和生理鹽水混合液配成為1%的溶液，按照60 mg/kg 一次性腹腔注射。

1.2.2 實驗分組與給藥方法 采用完全隨機化的分組方法，將50 只雄性SD 大鼠隨機分為5 組（每組10 只）?？瞻捉M：第1 天腹腔注射生理鹽水10 mL/kg，第15 天開始給予羧甲基纖維素鈉溶液10 mL/（kg·d）灌胃。其他4組第1 天腹腔注射MCT60 mg/kg，第15 天開始，模型組給予羧甲基纖維素鈉溶液10 mL/（kg·d）灌胃；蘇木乙酸乙酯提取物高劑量組（高劑量組）給予高濃度蘇木乙酸乙酯提取物10 mL/（kg·d）（相當于生藥量2.3 g/kg）灌胃；蘇木乙酸乙酯提取物低劑量組（低劑量組）給予低濃度蘇木乙酸乙酯提取物10 mL/（kg·d）（相當于生藥量1.15 g/kg）灌胃。對照組給予阿魏酸鈉10 mL/（kg·d）灌胃。以上至實驗第28 天最后1 次灌胃，實驗期滿后進行相關(guān)檢查、處死大鼠，肺臟固定于10%中性福爾馬林緩沖液，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 觀察指標

1.3.1 血清血栓素A 2（TX A 2）、前列環(huán)素（PG I2）測定 完成血流動力學測定后，用真空冷卻抗凝試管從腹主動脈中抽取血液，于低溫離心機3500 r/min 離心（離心半徑13.5 cm）后，分離血清，-20 ℃以下貯存待測。

1.3.2 H E 染色觀察病理形態(tài)學變化 將肺臟固定于10%中性福爾馬林緩沖液，經(jīng)脫水，包埋，切片，染色，封片，光學顯微鏡檢測，觀察肺小動脈形態(tài)學改變。

1.4 統(tǒng)計學方法 所有數(shù)據(jù)均運用SPSS 18.0 分析軟件進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（）表示，多樣本均數(shù)之間比較運用方差分析，組間兩兩比較采用q 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 實驗期間，空白組大鼠呼吸平穩(wěn)，活潑好動，皮毛光亮，體質(zhì)量逐漸增加。其他組腹腔注射MCT 7 d 后，活動減少，倦臥，食量減少，第14 天開始出現(xiàn)皮毛枯槁，蜷縮，活動逐漸減少，出現(xiàn)喘息，體質(zhì)量增加明顯減慢；模型組第21 天出現(xiàn)鼻部及唇周紫紺，大鼠出現(xiàn)死亡；對照組，高、低劑量組在第15 天開始給藥，20 d 后對照組，高、低劑量組大鼠精神狀態(tài)開始好轉(zhuǎn)，活動量逐漸增多，毛發(fā)較前光整，呼吸喘息減輕，食量及體質(zhì)量增加。大鼠腹腔注射MCT 28 d 后，空白組10 只均存活（存活率100%），模型組有5 只存活（存活率100%），高劑量組和對照組均有8 只存活（存活率80%），低劑量組有9 只存活（存活率90%）。其中模型組有2 只大鼠、高劑量組有1 只大鼠和對照組2 只大鼠有不同程度的胸水和（或）腹水。

2.2 肺組織及肺血管病理形態(tài)學 空白組肺動脈壁清晰，小動脈管壁內(nèi)皮細胞扁平連續(xù)，厚薄較為一致，血管周圍無炎性細胞浸潤（見圖1A）；模型組大鼠肺泡少量出現(xiàn)漿液性滲出，局部伴有炎性細胞浸潤，肺小動脈壁增生，尤以平滑肌層增生最為顯著，管腔變窄，血管內(nèi)皮細胞變成不規(guī)則形狀，致使血管內(nèi)皮粗糙，血管內(nèi)有漿液性滲出，并伴有充血，支氣管腔內(nèi)有少量漿液性滲出（見圖1B）；對照組肺臟的肺泡內(nèi)出現(xiàn)大面積的漿液性滲出，滲出物呈現(xiàn)淡粉色，其中混有少量的紅細胞以及脫落的肺泡上皮細胞，局部伴有炎性細胞浸潤，肺小動脈擴張充血，小動脈壁厚度與模型組相比明顯變薄，但與空白組相比增厚明顯（見圖1E）；高劑量組和低劑量組肺小動脈壁厚度差異不大，高劑量組、低劑量組與空白組增厚明顯，但厚度介于模型組與對照組之間而優(yōu)于對照組（見圖1C、圖1D）。

圖1 各組大鼠肺血管病理切片圖（H E×100）

2.3 血清TX A 2 水平 與空白組比較，模型組、高劑量組、低劑量組和對照組血清TXA2 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量組、低劑量組和對照組血清TXA2 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高劑量組與低劑量組相比，低劑量組血清TXA2 水平較低，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清TXA2水平的比較（，pg/mL）

表1 各組大鼠血清TXA2水平的比較（，pg/mL）

注：與空白組對比，△P<0.05；與模型組對比，▲P<0.05；與高劑量組相比，★P<0.05。

2.4 血清PG I2 水平 與空白組比較，模型組、高劑量組、低劑量組和對照組血清PGI2 水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，高劑量組、低劑量組和對照組血清PGI2 水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；高、低劑量組與對照組之間血清PGI2 水平相互比較，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），高劑量組與低劑量組優(yōu)于對照組，且高劑量組優(yōu)于低劑量組。見表2。

表2 各組大鼠血清PGI2水平的比較（，pg/mL）

表2 各組大鼠血清PGI2水平的比較（，pg/mL）

注：與空白組對比，△P<0.05；與模型組對比，▲P<0.05；與對照組相比，★P<0.05。

3 討論

PAH 的主要病理改變?yōu)榉窝芙Y(jié)構(gòu)重構(gòu)，病理學特點主要表現(xiàn)為：肺動脈中膜肥厚、內(nèi)膜增生及特征性叢樣病變。組織學研究表明重構(gòu)的肺動脈周圍發(fā)生了明顯的炎癥細胞浸潤。本次研究模型組大鼠肺泡少量出現(xiàn)漿液性滲出，局部伴有炎性細胞浸潤，肺小動脈壁增生，尤以平滑肌層增生最為顯著，管腔變窄，血管內(nèi)皮細胞變成不規(guī)則形狀，致使血管內(nèi)皮粗糙，血管內(nèi)有漿液性滲出，并伴有充血，支氣管腔內(nèi)有少量漿液性滲出，說明模型組大鼠存在肺血管重構(gòu)，產(chǎn)生明顯炎癥反應(yīng)。蘇木乙酸乙酯提取物高、低劑量組大鼠肺泡漿液性滲出明顯減少，局部炎性細胞浸潤較輕，肺小動脈壁增生及管腔變窄程度較模型組明顯改善，說明蘇木乙酸乙酯提取物可有效逆轉(zhuǎn)肺血管的重塑及抑制炎性滲出。既往研究[6，9-12]表明，蘇木乙酸乙酯提取物可有效升高血清IL-1β、IL-4、IL-10，抑制IL-6 的分泌，調(diào)整T 細胞亞群及促進細胞毒性T 淋巴細胞的凋亡，具有較好的免疫抑制作用，可有效抑制肺動脈周圍炎癥細胞浸潤，可有效降低肺動脈壓力。因此，蘇木乙酸乙酯提取物逆轉(zhuǎn)PAH 肺血管重構(gòu)，抑制炎癥反應(yīng)可能是通過其免疫抑制作用達到治療作用。

PGI2 和TXA2 是血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的花生四烯酸代謝物。PGI2 有很強地松弛血管平滑肌擴張血管、抑制血小板凝聚、抑制血管平滑肌細胞增殖作用，與PAH 的形成及發(fā)展密切相關(guān)[13]；而TXA2 是一種血管內(nèi)皮細胞和血小板產(chǎn)生的血管收縮劑，可引起血小板凝聚。肺血管內(nèi)皮細胞損傷將使PGI2 分泌下降，從而使血管緊張度增高，平滑肌細胞增生，同時促進血小板黏附、激活，有利于血栓形成及血栓素分泌的增加，促成并加劇肺動脈高壓[14]。在PAH 患者的尿檢里，PGI2 代謝物水平降低，而TXA2 的代謝物水平升高。因此，研制具有升高PGI2而抑制TXA2 的藥物對治療PAH 具有廣泛前景。本研究中蘇木乙酸乙酯提取物能使血清TXA2 明顯降低，PGI2 水平明顯升高。本研究的同期實驗研究顯示蘇木乙酸乙酯提取物能夠明顯降低PAH 模型大鼠的肺動脈壓力，說明蘇木乙酸乙酯提取物可能是通過降低血清TXA2 水平，減輕TXA2 收縮血管的作用，而升高PGI2 水平，擴張血管、抑制血小板、抗細胞增殖，從而降低肺動脈壓力。

綜上所述，蘇木乙酸乙酯提取物對MCT 誘導的PAH大鼠具有防治作用。蘇木乙酸乙酯提取物可通過逆轉(zhuǎn)PAH 大鼠的肺血管重構(gòu)，降低血清TXA2 水平，恢復(fù)內(nèi)皮功能，減輕肺動脈阻力，達到降低肺動脈壓力的目的。關(guān)于蘇木乙酸乙酯提取物對PAH 是如何恢復(fù)內(nèi)皮功能，逆轉(zhuǎn)肺血管重構(gòu)，降低血清TXA2 水平，發(fā)揮治療作用，是否存在其他的作用機制及途徑，有待進一步的研究探討。