靳悅，汪河，李明威，張學(xué)軍

（天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系，天津 300070）

肝纖維化是肝臟損傷后細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積與異常分布的修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展過程中的關(guān)鍵階段[1]。研究證明肝內(nèi)巨噬細(xì)胞是肝纖維化進(jìn)程及轉(zhuǎn)歸的重要免疫細(xì)胞[2-3]，單核來源巨噬細(xì)胞被招募到受損的肝臟后，可通過分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等促纖維化因子介導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞活化、分化和增殖，進(jìn)而促進(jìn)慢性纖維化進(jìn)程[4]。

血小板衍生生長因子（platelet derived growth factor，PDGF）是一種促進(jìn)肝星狀細(xì)胞分裂和增殖的生長因子，分為PDGF-A、B、C 和D 4 種不同亞型[5-6]，其中PDGF-B 是促進(jìn)纖維化和HSC 增殖的關(guān)鍵細(xì)胞因子，它的主要受體PDGFR-β 在活化的HSC 上顯著上調(diào)[7-8]。在近幾年的纖維化機(jī)制研究中，PDGF信號通路已被認(rèn)為是與HSC 活化和纖維化進(jìn)展相關(guān)的重要通路[9-10]。

CD24 是一種糖基磷脂酰肌醇錨定分子[11]，由多種免疫細(xì)胞表達(dá)[12]。CD24 也是一種重要的炎癥負(fù)反饋分子，在肝損傷和抗腫瘤先天免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[13-14]。本研究利用阻塞性膽汁淤積引起的肝纖維化動物模型探討了CD24 分子是否通過調(diào)節(jié)肝內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌PDGF-B 進(jìn)而延緩纖維化進(jìn)程。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)對象及分組 C57BL/6J 小鼠（購自北京斯貝福生物技術(shù)有限公司） 與CD24 基因敲除（CD24-/-）小鼠在天津醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心共同飼養(yǎng)。各基因型均采用6～8 周齡，體重18～20 g 的雌性小鼠。各基因型均分為造模組與假手術(shù)組，每組5 只，造模組進(jìn)行膽總管結(jié)扎（BDL）誘導(dǎo)小鼠纖維化，假手術(shù)組和造模組處理相同但不結(jié)扎膽總管，作為對照組，術(shù)后飼養(yǎng)于相同的環(huán)境，術(shù)后7 d 處死小鼠。

1.1.2 主要試劑和儀器 石蠟切片機(jī)購自leica，QPCR 儀LightCycler96 購自Roche 公司，Trizol 購自美國Invitrogen 公司，反轉(zhuǎn)錄酶試劑盒購自美國Promega公司，SYBR Green 購自Genstar，Percoll 購自英國GE Healthcare 公司，Ⅳ型膠原酶購自Sigma，流式抗體購自美國eBioscience公司，Western印跡抗體購自SantaCruz。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 BDL 小鼠模型的構(gòu)建 手術(shù)組按照4 μL/g腹腔注射10%水合氯醛溶液進(jìn)行麻醉，之后刮去腹壁周圍絨毛暴露皮膚，消毒后使用手術(shù)刀沿腹中線切開腹壁，暴露腹腔，找到膽總管用消毒后的手術(shù)線結(jié)扎，最后縫合腹壁。術(shù)后小鼠飼養(yǎng)于消毒后的籠子里，置于溫暖的環(huán)境中。

1.2.2 肝組織的病理染色 冷PBS 灌注肝臟，取下的肝臟在10%甲醛溶液中固定至少24 h，依次進(jìn)行不同濃度梯度的酒精脫水，浸蠟6～8 h 后包埋。用石蠟切片機(jī)進(jìn)行5 μm 厚度的切片，60℃烤片1 h 后進(jìn)行HE和天狼星紅染色，其中，蘇木素染色3 min，分化液30 s，伊紅1 min，天狼星紅染色1 h，染色完成后中性樹膠封片，在Nikon 90i 顯微鏡下拍照，每張片子選取5 個視野，用image J 軟件統(tǒng)計陽性區(qū)域面積進(jìn)行比較。

1.2.3 免疫印跡 將液氮速凍的肝組織加入適量裂解液，置于冰上，使用手持組織破碎儀將組織打成勻漿，再經(jīng)超聲破碎儀對組織勻漿進(jìn)行超聲破碎，超聲15 s，停10 s，循環(huán)3 次。將超聲后的樣品離心后轉(zhuǎn)移上清至新的EP 管，加入Loading buffer 后5 min，100℃變性。加載等量的蛋白通過10%SDS-PAGE 分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上，300 mA 轉(zhuǎn)膜2 h，用含5%BSA 的TBST 緩沖液封閉1 h，然后用相應(yīng)的抗體孵育過夜。用對應(yīng)的二抗室溫孵育1 h，洗膜3～5 遍。α-SMA（1∶500），β-actin（1∶500），辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），通過化學(xué)發(fā)光液檢測抗體條帶。

1.2.4 定量-PCR 將液氮速凍后的肝組織加入1 mL Trizol 裂解，培養(yǎng)皿中的細(xì)胞加入600 μL Trizol裂解，異丙醇沉淀法提取RNA，用分光光度計測定RNA 濃度后，每個樣品取1～2 μg，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Promega）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。將得到的cDNA 進(jìn)行10 倍稀釋，按照cDNA 4.5 μL，引物0.5 μL，SYBR Green 5 μL 的體系使用LightCycler96 運(yùn)行程序。具體的程序?yàn)椋侯A(yù)變性：95℃，300 s；設(shè)置50 個循環(huán)：變性：95℃，15 s；退火：60℃，30 s；延伸：72℃，30 s；溶解：95℃，10 s，65℃，60 s，97℃，1 s；冷卻：37℃，30 s。以Actin 基因?yàn)閮?nèi)參，用2-ΔΔCt計算結(jié)果，所有用到的引物序列見表1。反轉(zhuǎn)錄后的樣品加入SYBR Green 嵌合熒光染料并使用LightCycler96 進(jìn)行QPCR 檢驗(yàn)。

表1 定量-PCR 所用引物序列Tab 1 Primer sequence used for Q-PCR

1.2.5 制備肝內(nèi)巨噬細(xì)胞與星狀細(xì)胞 肝組織依次灌注EGTA 溶液、鏈酶蛋白酶溶液和Ⅳ型膠原酶溶液，將肝臟在消化液中剪碎，37℃、160 r/min 消化15 min，將消化好的肝臟通過70 μm 的篩網(wǎng)過濾，4℃，50×g，3 min，多次離心去除肝細(xì)胞。4℃，500×g，8 min 離心2 遍棄上清，用1×PBS 與預(yù)先配置的Percoll 原液混合成50%和25%的Percoll，用25%Percoll重懸細(xì)胞后緩慢滴加到50%Percoll 上，2 000 r/min，制動0 離心30 min，取Percoll 中間層細(xì)胞即為肝內(nèi)巨噬細(xì)胞。將濾過的單細(xì)胞懸液4℃，580×g，離心10 min，棄上清到10 mL，加120 μLDNaseⅠ重懸，補(bǔ)GBSS/B 至50 mL，4℃，580×g，離心10 min，棄上清至10 mL加120 μL DNaseⅠ，將細(xì)胞懸液平均分到兩個15 mL管中，加GBSS/B 至8 mL，再加入4 mL Nycodenz，混勻后在細(xì)胞懸液上加1.5 mL GBSS/B，制動0，1 380×g，4℃，離心17 min，取白膜層即為肝星狀細(xì)胞。

1.2.6 制備肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞（NPCs）懸液 步驟同提取肝內(nèi)巨噬細(xì)胞，棄上清留底部沉淀后，將10×PBS與預(yù)先配置的Percoll 原液混合成30%Percoll 并重懸細(xì)胞，450×g，20 min 離心留下最底層細(xì)胞，冷ACK進(jìn)行紅細(xì)胞裂解，裂解完成后洗兩遍重懸計數(shù)。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測 制備肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞懸液后，每管取1×106個細(xì)胞，用CD16/32 抗體4℃封閉15 min，之后再進(jìn)行細(xì)胞表面染色30 min。所用抗體如下：Apc-cy7 Anti-mouse CD45、FITC Anti-mouse Ly6G、Percp-cy5.5 Anti-mouse CD11b、APC Antimouse F4/80、PE-cy7 Anti-mouse Ly6C、PE Antimouse CD24。使用BD FACS CantoⅡ流式分析儀進(jìn)行檢測。Flowjo 10.6.2 軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.2.8 巨噬細(xì)胞亞群分選 制備肝非實(shí)質(zhì)細(xì)胞懸液后，將懸液轉(zhuǎn)移到無菌流式管中，4℃，500×g，離心5 min，冰上封閉15 min，再用標(biāo)記抗體Apc-cy7 Anti-mouse CD45、FITC Anti-mouse Ly6G、Percp-cy5.5 Anti-mouse CD11b、APC Anti-mouse F4/80、PE-cy7 Anti-mouse Ly6C 染色30 min，用流式PBS 洗兩遍后用FACS AriaⅡ流式分選儀分選巨噬細(xì)胞亞群，收集到無菌管中。

1.2.9 共培養(yǎng) 將提取的原代星狀細(xì)胞種于6 孔板，于37℃，5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將提取的巨噬細(xì)胞亞群加入提前架好的Transwell 培養(yǎng)小室的6 孔板中，培養(yǎng)條件相同。在原代星狀細(xì)胞培養(yǎng)兩天貼盤穩(wěn)定后，將Transwell 小室放置于培養(yǎng)原代星狀細(xì)胞的6 孔板上，共培養(yǎng)3 d，提取RNA 用于Q-PCR 檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用Graphpad Prism8 進(jìn)行數(shù)據(jù)匯總、分析、制圖，數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布，以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BDL 誘導(dǎo)的CD24-/-小鼠肝纖維化程度加重 首先建立了BDL 誘導(dǎo)的小鼠纖維化模型，HE 結(jié)果顯示，在造模組中，與WT 小鼠相比，CD24-/-小鼠肝組織炎性細(xì)胞浸潤增多，匯管區(qū)增生更加明顯，而假手術(shù)組中兩種基因型小鼠的肝臟則沒有明顯病理改變（圖1A）。天狼星紅染色結(jié)果顯示，造模組CD24-/-小鼠的肝纖維化程度更嚴(yán)重（P＜0.01），而假手術(shù)組無明顯差別（P＞0.05，圖1B）。Q-PCR 結(jié)果顯示，造模組CD24-/-小鼠的肝纖維化指標(biāo)α-SMA（P＜0.05）、Col1α1（P＜0.01）和Timp-1（P＜0.000 1）與WT 小鼠相比有顯著升高，假手術(shù)組無明顯差別（P＞0.05，圖1C）。Western 印跡結(jié)果顯示，肝纖維化標(biāo)志物α-SMA 在CD24-/-小鼠的肝組織中表達(dá)明顯高于WT 小鼠（圖1D），上述結(jié)果提示，CD24-/-小鼠的肝損傷和肝纖維化程度明顯加重。

圖1 CD24 基因敲除后BDL 誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化加重Fig 1 BDL-induced liver fibrosis in mice aggravated after CD24 geng knockout

2.2 CD24-/-小鼠肝纖維化加重 與WT 小鼠相比，CD24-/-小鼠造模后肝臟中定居的巨噬細(xì)胞（CD11bhiF480hi） 比例與數(shù)量都沒有明顯差別（P＞0.05），募集巨噬細(xì)胞群（CD11bhiF480int）比例明顯增加（P＜0.001），數(shù)量也有增加（P＜0.05，圖2A）。進(jìn)一步分析Ly6Chi和Ly6Clo兩種肝內(nèi)募集型巨噬細(xì)胞亞群，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CD24-/-小鼠造模后的Ly6Clo巨噬細(xì)胞亞群比例高于WT 小鼠（P＜0.05），數(shù)量也高于WT 小鼠（P＜0.01），而Ly6Chi巨噬細(xì)胞亞群比例和數(shù)量均無明顯差異（P＞0.05，圖2A）。分析CD24分子在肝內(nèi)不同的巨噬細(xì)胞亞群中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，CD24 分子在Ly6Clo巨噬細(xì)胞亞群中高表達(dá)且造模前后差異明顯（P＜0.05，圖2B）。分選肝內(nèi)巨噬細(xì)胞亞群與提取的原代星狀細(xì)胞共培養(yǎng)后檢測星狀細(xì)胞的纖維化指標(biāo)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，造模后的CD24-/-小鼠肝內(nèi)Ly6Clo群巨噬細(xì)胞亞群對星狀細(xì)胞的活化作用較強(qiáng)，纖維化指標(biāo)表達(dá)明顯升高（圖2C）。

圖2 CD24-/-小鼠肝纖維化加重可能與Ly6Clo 巨噬細(xì)胞亞群相關(guān)Fig 2 The aggravation of liver fibrosis in CD24-/-mice was related to Ly6Clo macrophages subset

2.3 CD24-/-小鼠纖維化與Ly6Clo巨噬細(xì)胞分泌PDGF-B 因子有關(guān) 在造模組中，與WT 小鼠相比，CD24-/-小鼠肝組織中PDGF-A 和PDGF-B mRNA表達(dá)較高且有顯著差異（P＜0.05，P＜0.01），而PDGFC 和PDGF-D 表達(dá)低且無差異（P＞0.05，圖3A）。提取肝內(nèi)巨噬細(xì)胞檢測發(fā)現(xiàn)，Q-PCR 顯示PDGF-A 與PDGF-Bm RNA 在CD24-/-小鼠造模后的肝內(nèi)巨噬細(xì)胞上表達(dá)均有顯著升高，其中以PDGF-B mRNA表達(dá)最為明顯（P＜0.01，P＜0.000 1，圖3B）。進(jìn)一步分析肝內(nèi)不同巨噬細(xì)胞亞群PDGF-A 和PDGF-B mRNA 表 達(dá)，結(jié) 果 發(fā) 現(xiàn)，PDGF-B 在CD24-/-小 鼠 的Ly6Clo巨噬細(xì)胞亞群上高表達(dá)（P＜0.000 1，圖3C）。用巨噬細(xì)胞上清與肝星狀細(xì)胞共培養(yǎng)觀察星狀細(xì)胞上PDGF-B 受體的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CD24-/-小鼠肝內(nèi)Ly6Clo巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)后，肝星狀細(xì)胞PDGFR-β 受體mRNA 表達(dá)量顯著上調(diào)（P＜0.000 1，圖3D）。

圖3 CD24 小鼠纖維化與Ly6Clo 巨噬細(xì)胞分泌PDGF-B 因子密切相關(guān)Fig 3 CD24 mouse fibrosis closely related to the secretion of PDGF-B factor by Ly6Clo macrophages

3 討論

在BDL 誘導(dǎo)的纖維化中，巨噬細(xì)胞與纖維化發(fā)展密切相關(guān)[15]，在不同的巨噬細(xì)胞亞群中，單核衍生的Ly6C 巨噬細(xì)胞亞群可在纖維化的不同階段發(fā)揮重要作用[16-17]。PDGF-B 被認(rèn)為是巨噬細(xì)胞分泌的促纖維化因子，可促進(jìn)星狀細(xì)胞的增殖分化以控制肝纖維化的發(fā)展[18]。

在WT 鼠和CD24-/-小鼠經(jīng)過膽總管結(jié)扎術(shù)造成纖維化后，初步發(fā)現(xiàn)CD24-/-小鼠的纖維化情況較WT 小鼠嚴(yán)重。在研究機(jī)制的過程中發(fā)現(xiàn)CD24-/-造模小鼠中募集群巨噬細(xì)胞顯著增多，CD24 分子在Ly6Clo群巨噬細(xì)胞上高表達(dá)且在造模前后有明顯差異，提示CD24 分子可能通過Ly6Clo群巨噬細(xì)胞來調(diào)節(jié)肝纖維化。

為了探究巨噬細(xì)胞分泌的相關(guān)纖維化因子，首先應(yīng)用Q-PCR 檢測篩選了與纖維化密切相關(guān)的PDGFs 家族成員的mRNA 表達(dá)變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDGF-A 和PDGF-B 在CD24-/-小鼠肝纖維化組織中表達(dá)顯著升高且與WT 小鼠有明顯差異，PDGFC 和PDGF-D 表達(dá)低且無明顯差異，該結(jié)果初步排除PDGF-C 和PDGF-D 的作用。進(jìn)一步檢測肝內(nèi)巨噬細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PDGF-A 和PDGF-B 在造模后的CD24-/-小鼠肝內(nèi)巨噬細(xì)胞上表達(dá)升高，尤其是PDGF-B 表達(dá)顯著升高，因此PDGF-A 和PDGF-B與CD24 敲除后肝纖維化加重有關(guān)。深入分析巨噬細(xì)胞亞群發(fā)現(xiàn)，PDGF-A 和PDGF-B 在CD24-/-小鼠Ly6Clo巨噬細(xì)胞亞群上高表達(dá)且與WT 小鼠有顯著差異，并且PDGF-B 的表達(dá)差異更大，因此，CD24主要通過Ly6Clo巨噬細(xì)胞亞群分泌PDGF-B 來調(diào)節(jié)纖維化的發(fā)展。巨噬細(xì)胞分泌的PDGFs 等促纖維化因子是通過調(diào)節(jié)肝星狀細(xì)胞表達(dá)的相應(yīng)受體來實(shí)現(xiàn)的[19]，為了驗(yàn)證上述結(jié)果，首先將不同巨噬細(xì)胞亞群與星狀細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測星狀細(xì)胞上的相應(yīng)受體的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與CD24-/-小鼠來源的Ly6Clo巨噬細(xì)胞亞群共培養(yǎng)后的星狀細(xì)胞上PDGFR-β 受體表達(dá)顯著升高，而PDGFR-β 是主要與PDGF-B相結(jié)合的配體[20]，因此，共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了PDGF-B 是CD24 通過Ly6Clo巨噬細(xì)胞亞群調(diào)節(jié)纖維化的重要因子。綜上所述，CD24 分子可通過影響Ly6Clo巨噬細(xì)胞PDGF-B 的分泌來調(diào)節(jié)纖維化。