陳 騰，王妍，趙潤(rùn)澤，王鈺，李桐，陳少賢，張子微，楊小林，2，郭利偉，2，劉國(guó)平，2

（1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434025；2.長(zhǎng)江大學(xué)交叉生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)研究中心，湖北荊州 434025）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是一種以繁殖障礙和呼吸系統(tǒng)癥狀為特征的接觸性豬病毒傳染病，是制約生豬養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一。其病原體豬繁殖與呼吸綜合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRSV）是動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬的成員，是一種有囊膜的單股正鏈RNA 病毒[1]。研究[2]表明：各生長(zhǎng)階段豬只均易感染PRRSV，傳播途徑主要有水平傳播和垂直傳播，其中水平傳播包括與患病豬接觸、空氣傳播以及精液傳播等，垂直傳播主要經(jīng)胎盤(pán)傳播。目前在國(guó)內(nèi)流行的PRRSV 按致病力不同，大致可以分為經(jīng)典毒株、高致病性變異毒株和類NADC30 毒株。1995 年國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)疑似PRRS 豬，1996 年從豬陽(yáng)性血清中成功分離出PRRSV，從而證實(shí)了國(guó)內(nèi)有PRRS 流行[3]。1995—2006 年，PRRS 表現(xiàn)經(jīng)典臨床癥狀，以經(jīng)典毒株（CH1a 毒株）流行為主。經(jīng)典毒株主要導(dǎo)致母豬繁殖障礙、仔豬呼吸系統(tǒng)疾病，以及育肥豬呼吸道疾病、生長(zhǎng)發(fā)育緩慢，還會(huì)出現(xiàn)繼發(fā)性疾病，導(dǎo)致哺乳豬、保育豬死亡率上升。母豬群暴發(fā)的經(jīng)典PRRS，一般會(huì)在一個(gè)半月內(nèi)趨于穩(wěn)定，但潛伏期較長(zhǎng)。而高致病性PRRS從2006 年開(kāi)始在我國(guó)流行，其病原是毒力更強(qiáng)的PRRSV 變異株（JXA1 毒株），相比較于經(jīng)典毒株，高致病性變異毒株致病力更強(qiáng)，傳播速度更快，除了引起經(jīng)典毒株的癥狀外，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)也有較強(qiáng)的致病性，仔豬發(fā)病率甚至可高達(dá)100%，死亡率達(dá)50%，母豬流產(chǎn)率超過(guò)30%[4-5]，給國(guó)內(nèi)大部分地區(qū)的規(guī)?；i養(yǎng)殖場(chǎng)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失。從2012 年開(kāi)始，陸續(xù)有PRRSV 新毒株在國(guó)內(nèi)出現(xiàn)的報(bào)道，其與NADC30 毒株同源關(guān)系較近，因此將這類病毒統(tǒng)稱為類NADC30 毒株，但不同NADC30 毒株之間的致病力呈現(xiàn)出一定的差異[6-8]。近年來(lái)有文獻(xiàn)[8-9]報(bào)道，類NADC30 毒株與其他毒株發(fā)生了重組變異，使PRRSV 基因型更加復(fù)雜，這給我國(guó)PRRS 防控帶來(lái)了更大挑戰(zhàn)。

為探究PRRSV 在規(guī)模豬場(chǎng)的流行特征，2021年從湖北省7 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)疑似感染PRRSV 豬群以及所有種公豬群中收集樣品進(jìn)行病原學(xué)檢測(cè)，并從養(yǎng)殖類型、生長(zhǎng)階段、季節(jié)及感染毒株等方面進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以期為今后的PRRS 防控提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 病料采集

2021 年，從湖北省7 個(gè)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)（1 個(gè)存欄1 000～2 000 頭的核心育種場(chǎng)、1 個(gè)存欄＞5 000 頭的商品豬擴(kuò)繁場(chǎng)和5 個(gè)存欄＞5 000 頭的育肥場(chǎng)），對(duì)臨床上出現(xiàn)呼吸和繁殖障礙癥狀以及耳朵發(fā)紫和有繁殖障礙史的豬群進(jìn)行采樣檢測(cè)，對(duì)核心育種場(chǎng)的種公豬進(jìn)行普檢，共采集3 324 份臨床樣品。將樣品置于冰上運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室，并于24 h內(nèi)完成后續(xù)檢測(cè)。

1.2 樣品預(yù)處理及病毒RNA 提取

樣品預(yù)處理方法參照文獻(xiàn)[10]，預(yù)處理樣品用于后續(xù)病毒RNA 提取。樣品病毒RNA 提取，采用Axygen 體液病毒核酸提取試劑盒，具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用Nanodrop 1 000 檢測(cè)所提取RNA 的濃度和純度，將RNA 于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原學(xué)檢測(cè)

采用三重巢式RT-PCR 法[11]，對(duì)樣品進(jìn)行PRRSV 病原學(xué)檢測(cè)（此方法可同時(shí)檢測(cè)經(jīng)典毒株、高致病性變異毒株和類NADC30 毒株）。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

對(duì)不同類型養(yǎng)殖場(chǎng)、不同年齡段、不同季節(jié)及混合感染的檢測(cè)結(jié)果，采用SPSS 24.0 卡方檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析，P≥0.05 為差異不顯著，P＜0.05 為差異顯著。通過(guò)Origin 2019 軟件，對(duì)檢測(cè)樣品的PRRSV 陽(yáng)性檢出率進(jìn)行處理分析。從檢測(cè)出的不同毒株陽(yáng)性產(chǎn)物中各隨機(jī)選取3 份（共9 份陽(yáng)性產(chǎn)物），送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序；將測(cè)序序列通過(guò)NCBI 進(jìn)行BLAST 比對(duì)，并利用MEGA7.0 軟件中Neighbor Joining 法，繪制系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同養(yǎng)殖類型

不同類型養(yǎng)殖場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果（表2）顯示：共檢出PRRSV 陽(yáng)性樣品數(shù)323 份，平均陽(yáng)性檢出率為9.72%（323/3 324），其中核心育種場(chǎng)陽(yáng)性檢出率為2.66%（20/752），商品豬擴(kuò)繁場(chǎng)為11.82%（169/1 430），育肥場(chǎng)為11.73%（134/1 142）；核心育種場(chǎng)陽(yáng)性檢出率顯著低于擴(kuò)繁場(chǎng)和育肥場(chǎng)（P＜0.05），而商品豬擴(kuò)繁場(chǎng)與育肥場(chǎng)陽(yáng)性檢出率差異不顯著（P≥0.05）。結(jié)果表明，與商品豬擴(kuò)繁場(chǎng)和育肥場(chǎng)相比，核心育種場(chǎng)PRRSV 感染程度較輕。

表2 不同類型養(yǎng)殖場(chǎng)PRRSV 檢測(cè)結(jié)果

2.2 不同生長(zhǎng)階段

不同生長(zhǎng)階段豬群檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示：種公豬未檢出陽(yáng)性，陽(yáng)性檢出率為0（0/183），母豬陽(yáng)性檢出率為3.24%（20/618），哺乳仔豬為5.26%（30/570），保育豬為17.23%（152/882），生長(zhǎng)育肥豬為11.30%（121/1 071）；不同生長(zhǎng)階段豬群的PRRSV 陽(yáng)性檢出率差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，不同生長(zhǎng)階段豬群的PRRSV感染程度差異較大，保育豬感染最嚴(yán)重，其余依次是生長(zhǎng)育肥豬、哺乳仔豬和母豬，而種公豬經(jīng)普檢未發(fā)現(xiàn)感染。

表3 不同生長(zhǎng)階段豬群PRRSV 檢測(cè)結(jié)果

2.3 不同季節(jié)

不同季節(jié)豬群檢測(cè)結(jié)果（表4）顯示：春季（3—5 月）的PRRSV 陽(yáng)性檢出率為18.16%（148/815），夏季（6—8 月）為6.94%（60/864），秋季（9—11 月）為6.10%（34/557），冬季（12月—次年2 月）為7.44%（81/1 088），春季陽(yáng)性檢出率顯著高于其他季節(jié)（P＜0.05），而夏秋冬三季間的陽(yáng)性檢出率差異不顯著（P≥0.05）。結(jié)果表明，春季是PRRSV 感染的高峰期，夏秋兩季豬群感染程度明顯下降，冬季開(kāi)始反彈。

表4 不同季節(jié)豬群PRRSV 檢測(cè)結(jié)果

2.4 不同毒株

陽(yáng)性樣品中不同PRRSV 毒株檢出結(jié)果（表5）顯示：323 份PRRSV 陽(yáng)性樣品中，類NADC30 毒株檢出占比最高，為49.54%（160/323），其余依次是高致病性變異毒株（29.10%，94/323）、經(jīng)典毒株（21.36%，69/323），未發(fā)現(xiàn)多重毒株混合感染情況。類NADC30 毒株檢出占比顯著高于其他毒株（P＜0.05），而高致病性變異毒株與經(jīng)典毒株檢出占比差異不顯著（P≥0.05）。

表5 陽(yáng)性樣品中不同PRRSV 毒株檢出情況

選取9 份陽(yáng)性產(chǎn)物測(cè)序并建立系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果（圖1）顯示：9 條序列分別屬于PRRSV經(jīng)典毒株、高致病性變異毒株與類NADC30 毒株，其中3 條序列（HB-01、HB-02 及HB-05）與以VR2332 為代表的經(jīng)典毒株屬于同一進(jìn)化分支，3 條序列（HB-03、HB-08 及HB-09）與以JXA1為代表的高致病性變異毒株屬于同一進(jìn)化分支，剩余3條序列（HB-04、HB-06 及HB-07）與 以NADC30 為代表的類NADC30 毒株屬于同一進(jìn)化分支。

3 討論

本研究對(duì)2021 年湖北省7 個(gè)規(guī)模豬場(chǎng)的PRRSV 感染情況進(jìn)行調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均陽(yáng)性檢出率為9.72%（323/3 324）。趙永祥[12]2013—2014 年對(duì)四川省部分地區(qū)進(jìn)行PRRSV 流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均陽(yáng)性率為38.76%（69/178）；劉曉東[13]2015—2017 年對(duì)國(guó)內(nèi)部分地區(qū)進(jìn)行PRRSV 流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均陽(yáng)性率為31.84%（1138/3 574）；李焱[14]2018—2020 年對(duì)山東省進(jìn)行PRRSV 流行病學(xué)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)平均陽(yáng)性率為16.57%（355/2 143）。從上述調(diào)查結(jié)果可以看出，2018 年后國(guó)內(nèi)PRRSV的感染程度呈下降趨勢(shì)，與本研究以及牛婷婷等[15]的研究結(jié)果一致。這可能是自2018 年非洲豬瘟在國(guó)內(nèi)暴發(fā)以來(lái)，國(guó)內(nèi)許多規(guī)模豬場(chǎng)配套了更完善的生物安全體系，加上全國(guó)限制跨區(qū)域調(diào)豬，這些措施對(duì)PRRS 防控也有積極成效。

不同養(yǎng)殖類型調(diào)查結(jié)果顯示，核心育種場(chǎng)感染程度（2.66%）低于擴(kuò)繁場(chǎng)（11.82%）和育肥場(chǎng)（11.73%），差異顯著（P＜0.05）。核心育種場(chǎng)配備了更嚴(yán)格的生物安全制度，飼養(yǎng)管理水平更高，且是自繁自養(yǎng)體系，杜絕了外來(lái)攜帶病毒豬只的進(jìn)入；PRRSV 也是核心育種場(chǎng)選育體系的凈化病原之一，抗原陽(yáng)性豬只會(huì)被優(yōu)先淘汰。

不同生長(zhǎng)階段豬群調(diào)查結(jié)果顯示，各生長(zhǎng)階段豬群的感染程度差異顯著（P＜0.05），其中保育豬陽(yáng)性檢出率最高，其余依次是生長(zhǎng)育肥豬、哺乳仔豬和母豬，而種公豬普檢未發(fā)現(xiàn)PRRSV 感染。保育豬陽(yáng)性檢出率最高的原因可能是，保育階段處于母源抗體衰減和疫苗免疫的臨界點(diǎn)。何海建等[16]研究表明，隨著日齡增加，仔豬體內(nèi)的母源抗體水平逐漸降低，至42 日齡時(shí)，仔豬體內(nèi)基本檢測(cè)不出PRRSV 抗體。所調(diào)查的規(guī)模豬場(chǎng)大多使用PRRSV 滅活苗，而滅活苗的免疫抗體產(chǎn)生期較長(zhǎng)，同時(shí)由于個(gè)體差異的存在，部分保育豬只未能達(dá)到免疫全覆蓋，因此免疫程序需根據(jù)抗體消長(zhǎng)規(guī)律制定[17]。再加上保育豬的內(nèi)臟器官尚未發(fā)育成熟，自身免疫力低，在高飼養(yǎng)密度的環(huán)境下，易通過(guò)接觸和空氣傳播造成大規(guī)模感染[18]。保育豬是PRRSV 感染的重點(diǎn)豬群，須作為重點(diǎn)防控對(duì)象實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PRRSV 抗體消長(zhǎng)規(guī)律，建立合理的免疫程序，同時(shí)提高飼養(yǎng)管理水平，降低保育豬的感染程度，這對(duì)各階段豬只PRRS 防控意義重大。

不同季節(jié)調(diào)查結(jié)果顯示，PRRSV 一年四季均可流行，但與夏季（6.94%）、秋季（6.10%）、冬季（7.44%）相比，春季（18.16%）是PRRSV感染的高峰期。出現(xiàn)該季節(jié)性差異特征可能是由于湖北省屬于亞熱帶季風(fēng)氣候，夏秋季節(jié)干燥炎熱的環(huán)境易使PRRSV 失去感染性，而春冬季寒冷潮濕的環(huán)境則有利于其存活[15]。在當(dāng)前非洲豬瘟防控的壓力下，國(guó)內(nèi)許多豬場(chǎng)完善了生物安全制度，通過(guò)帶豬消毒這一措施進(jìn)行防控，在炎熱的夏秋季節(jié)，帶豬消毒會(huì)減少熱應(yīng)激對(duì)豬只的影響，而在寒冷的春冬季節(jié)，為了保持豬舍內(nèi)的溫度，極大減少了室內(nèi)外空氣的流通，此時(shí)帶豬消毒加劇了豬舍環(huán)境的濕度，導(dǎo)致PRRSV更易通過(guò)環(huán)境傳播。相較于冬季，春季的氣溫更加多變，冷熱應(yīng)激對(duì)豬只的影響更大，因此春季PRRSV 的感染最為嚴(yán)重。因此，春季需要加強(qiáng)PRRS 防控，在確保豬舍內(nèi)溫度的同時(shí)要保持豬舍內(nèi)干燥。

陽(yáng)性樣品中不同毒株感染結(jié)果顯示，類NADC30 毒株檢出占比（49.54%）高于高致病性變異毒株（29.10%）和經(jīng)典毒株（21.36%），差異顯著（P＜0.05），說(shuō)明類NADC30 毒株是所調(diào)查規(guī)模豬場(chǎng)的優(yōu)勢(shì)流行毒株。目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的PRRSV 商品化疫苗主要是基于經(jīng)典毒株和高致病性變異毒株研制而成的，對(duì)類NADC30 毒株的交叉保護(hù)力度不夠[19-20]。并且類NADC30 毒株之間差異較大，變異速度快，易與其他毒株發(fā)生重組變異[4]，使PRRSV 基因型更加復(fù)雜，這給養(yǎng)殖場(chǎng)PRRS 防控帶來(lái)更大挑戰(zhàn)。在PRRSV 基因型復(fù)雜多變的情況下，需要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)毒株變異情況，分析出毒株的遺傳進(jìn)化規(guī)律，提前制定出相應(yīng)的防控方案[13]。

綜上所述，要做好PRRS 防控工作，需要采取綜合防控策略：一要制定嚴(yán)格的生物安全條例，建立完善的生物安全體系；二要堅(jiān)持自繁自養(yǎng)，確需引種，則需制定完善的引種制度，避免外來(lái)攜帶病毒豬只的進(jìn)入；三要實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)豬只PRRSV 抗體水平及毒株的遺傳進(jìn)化規(guī)律，重點(diǎn)做好保育階段豬只和春季時(shí)節(jié)的PRRS 防控。