元昕，王姝君，唐建開，張立偉

（山西大學(xué) 分子科學(xué)研究所 化學(xué)生物學(xué)與分子工程教育部重點實驗室，山西 太原 030006）

0 引言

連翹為木樨科植物連翹（Forsythia suspensa（Thnub.）Vahl）的干燥果實，主產(chǎn)于山西、陜西、河南、河北等地，具有清熱解毒、消腫散結(jié)之功效，主治溫?zé)?、丹毒、斑疹、瘡瘍腫毒、瘰疬等證。根據(jù)采收期不同，連翹分為青翹和老翹兩種規(guī)格，秋季果實初熟尚帶綠色時采收，除去雜質(zhì)，蒸熟，曬干，習(xí)稱“青翹”；秋季果實熟透時采收，曬干，除去雜質(zhì)，習(xí)稱老翹［1］。連翹主要含有苯乙醇苷類、木脂素類和黃酮類等化學(xué)成分［2-5］?，F(xiàn)行《中華人民共和國藥典：一部》（2020年版）在連翹項下收載了青翹和老翹兩種規(guī)格，并在性狀、鑒別、浸出物、揮發(fā)油含量、連翹酯苷A和連翹苷含量等方面做出了規(guī)定，但以此來評價連翹飲片的質(zhì)量尚存在一定程度的不完整性［6-8］。近年來中藥特征圖譜作為中藥質(zhì)量控制的補充檢測方法，愈來愈受到研究工作者的重視［9-12］，因此，為了比較全面的控制青翹的質(zhì)量，已有較多的學(xué)者對青翹的指紋圖譜或特征圖譜進行了比較充分的研究［13-14］，為進一步完善青翹的鑒別和質(zhì)量評價提供了依據(jù)和方法。目前尚未見到有關(guān)老翹特征圖譜的研究報道，從真?zhèn)涡浴?zhǔn)確度把握老翹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)會有所不足，為了更好地控制老翹飲片品質(zhì)，可以利用中藥特征圖譜考察老翹化學(xué)成分以及各成分之間的差異，比較科學(xué)地控制老翹飲片質(zhì)量，據(jù)此，本文利用高效液相色譜建立老翹特征圖譜，分別指認(rèn)了梾木苷甲基醚、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素5個特征成分，為進一步完善老翹的鑒別及質(zhì)量評價提供依據(jù)。

1 儀器與材料

高效液相色譜儀（Agilent 1260 II，美國Agilent公司）；Agilent Zorbax C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；萬分之一天平（OHAUS CP114型，奧豪斯上海儀器公司）；超聲波掃描清洗機（SB-3200 DTS型，寧波新芝生物科技公司）；十萬分之一天平（EX125DZH型，奧豪斯常州儀器公司）。

連翹酯苷 A（98%，批號MUST-20032804，成都曼思特生物科技有限公司），連翹脂素（98%，批號MUST-19061710，成都曼思特生物科技有限公司），連翹苷（99%，批號MUST-19070810，成都曼思特生物科技有限公司），梾木苷甲基醚（96%，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司提供），蘆?。?9%，批號：101625，江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司），色譜純甲醇、乙腈、冰醋酸（美國Fisher公司），其他試劑均為分析純，實驗用水為超純水。老翹來自藥材市場和山西連翹基地共12批，撿除雜質(zhì)，篩去種子。經(jīng)山西大學(xué)分子科學(xué)研究所張立偉教授鑒定為木樨科連翹屬植物連翹（Forsythia suspensa（Thnub.）Vahl）的成熟干燥果殼。樣品來源信息見表1。

表1 樣品來源Table 1 Origins of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為 Agilent Zorbax C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相為乙腈（A）-0.4%冰醋酸（B），梯度洗脫（0～ 13 min，13%A→16%A；13 min～23 min，16%A；23 min～ 33 min，16%A→21%A；33 min～ 45 min，21%A→28%A；45 min～ 63 min，28%A→45%A），流速0.8 mL·min-1，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，檢測波長280 nm。

2.2 溶液配制

2.2.1 混合對照品溶液

分別精密稱取梾木苷甲基醚、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素和蘆丁對照品9、15、6、2、4 mg置于10 mL容量瓶中，用70%甲醇溶液溶解定容至刻度，得到混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中梾木苷甲基醚濃度為0.9 mg/mL，連翹酯苷A濃度為1.5 mg/mL，連翹苷濃度為0.6 mg/mL，連翹脂素濃度為0.2 mg/mL、蘆丁濃度為0.4 mg/mL。

2.2.2 供試品溶液

準(zhǔn)確稱取老翹藥材（過3號篩）約0.5 g，置于100 mL具塞錐形瓶中，加入15 mL體積分?jǐn)?shù)為70%甲醇溶液，稱重，超聲處理30 min，待冷卻至室溫后，用70%甲醇溶液補足失重，搖勻取上清，用0.45 μm的微孔濾膜過濾即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度實驗

稱取S1樣品，按上述方法制備供試品溶液，并連續(xù)進樣6次，生成色譜圖。參照峰設(shè)置為連翹酯苷A（3號峰），并對本文標(biāo)定的5個特征峰的相對峰面積及相對保留時間進行計算，結(jié)果顯示5個特征峰相對峰面積、相對保留時間的RSD分別小于2.42%、0.18%，均符合要求（RSD＜ 5%），表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性實驗

稱取S1樣品共6份，平行制備6份供試品溶液，注入高效液相色譜儀進行測定，生成色譜圖，參照峰設(shè)置為連翹酯苷A（3號峰），并對本文標(biāo)定的5個特征峰的相對峰面積及相對保留時間進行計算，結(jié)果顯示5個特征峰相對峰面積、相對保留時間的RSD分別小于2.27%、0.13%，均符合要求（RSD＜5%），表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性實驗

稱取S1樣品，并按本文方法制備供試品溶液，分別于 0，4，8，12，24 h注入高效液相色譜儀中，生成色譜圖，參照峰設(shè)置為連翹酯苷A（3號峰），并對本文標(biāo)定的5個特征峰的相對峰面積及相對保留時間進行計算，結(jié)果顯示5個特征峰相對峰面積、相對保留時間的RSD分別小于2.28%、0.15%，均符合要求（RSD＜ 5%），說明樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4 特征圖譜

2.4.1 特征圖譜的建立

取12批老翹樣品粉末，制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件測定。利用2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統(tǒng)”進行相似度分析，以S1樣品的色譜圖作為參照圖譜，并將S2～S12樣品的色譜峰與S1樣品的色譜圖進行自動匹配，生成對照圖譜（R），結(jié)果如圖1所示。選擇共有的主要色譜峰為特征峰，并與對照品比對，確定峰1為梾木苷甲基醚，峰2為蘆丁，峰3為連翹酯苷A，峰4為連翹苷，峰5為連翹脂素，如圖2所示。

圖1 老翹特征圖譜S1-S12：12批老翹藥材特征圖譜R：對照特征圖譜Fig.1 Characteristic chromatograms of ripe F.suspensaS1-S12：The characteristic chromatograms of 12 batches of ripe F.suspensa,R：control characteristic of the chromatogram

圖2 對照品色譜圖1：梾木苷甲基醚；2：蘆丁；3：連翹酯苷A；4：連翹苷；5：連翹脂素Fig.2 HPLC chromatogram of mixed reference substances1:suspensaside methyl ether,2:rutin,3:forsythoside A,4:phillyrin,5:phillygenin

2.4.2 特征峰相對保留時間的確定

將12批老翹樣品按“2.1”項下的色譜條件進行分析，參照峰設(shè)置為連翹酯苷A（3號峰），分別計算梾木苷甲基醚、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素的相對保留時間。結(jié)果顯示各特征峰相對保留時間均在規(guī)定值的±5%之內(nèi)，規(guī)定值分別為：0.85（峰 1）、0.89（峰 2）、1.00（峰 3）、1.67（峰 4）、2.22（峰5）。以連翹酯苷A為參照峰，分別標(biāo)定蘆丁、梾木苷甲基醚、連翹苷以及連翹脂素的相對保留時間，數(shù)據(jù)見表2。

表2 老翹各特征峰的相對保留時間Table 2 The relative retention time of each characteristic peak of ripe forsythia suspensa

2.4.3 老翹藥材特征圖譜相似度分析

將12批老翹樣品的色譜圖導(dǎo)入2012版“中藥色譜指紋圖譜相似度評價軟件系統(tǒng)”進行相似度分析，計算得到12批樣品與對照特征圖譜的相似度分別 為 0.926、0.906、0.961、0.978、0.981、0.947、0.949、0.959、0.971、0.921、0.921、0.973，表明各產(chǎn)地老翹飲片具有較高的相似性。

3 討論

3.1 提取條件確定

首先對提取溶劑進行考察，分別比較乙醇、甲醇、水等溶劑對樣品的提取效果，最終確定以甲醇作為提取溶劑，并對不同濃度甲醇提取效果進行了比較，發(fā)現(xiàn)70%甲醇（體積分?jǐn)?shù)）作為提取溶劑時提取效率最高；其次，對提取方式進行了考察，分別比較了超聲提取法和加熱回流提取法的提取效率，確定以超聲提取法作為提取方法更為簡便，效率更高。

3.2 流動相選擇

分別對甲醇-0.4%醋酸水、乙腈-0.4%醋酸水、乙腈-水等流動相體系進行考察，并對該流動相的梯度洗脫時間進行考察，結(jié)果顯示流動相體系為乙腈-0.4%醋酸水時，各色譜峰分離效果較好且基線平穩(wěn)；并以制備樣品色譜圖基線平穩(wěn)、色譜峰信息量大，特征性強為依據(jù)確定本實驗的梯度體系。

3.3 檢測波長選擇

在老翹特征圖譜中，對235、280和330 nm三個波長進行檢測，結(jié)果顯示，在波長280 nm時，色譜圖基線平穩(wěn)且供試品主要成分的分離度較好，色譜峰信息量大，紫外吸收峰強度較高，因此將280 nm作為特征圖譜的檢測波長。

3.4 特征峰選擇

老翹中主要含有苯乙醇苷類、木脂素和黃酮類成分，因此，本文分別選取了三類成分中具有代表性和特征性的連翹酯苷A、梾木苷甲基醚、連翹苷、連翹脂素和蘆丁作為老翹特征圖譜的特征峰。在連翹藥材中，連翹酯苷A的含量較高，活性較好，且該峰在本文的條件中分離度和穩(wěn)定性均符合要求，所以將連翹酯苷A作為老翹特征圖譜的參照峰。此外，由于梾木苷甲基醚在老翹的甲醇提取物中含量較高，因此，本文建立的老翹特征圖譜與研究報道的青翹特征圖譜的最大區(qū)別在于增加了梾木苷甲基醚特征峰。

4 結(jié)論

本實驗通過HPLC法優(yōu)化了老翹特征圖譜的條件，并通過對照品對照法確認(rèn)了老翹甲醇提取物中梾木苷甲基醚、蘆丁、連翹酯苷A、連翹苷、連翹脂素等5個特征成分，并對所建立的方法進行了精密度、穩(wěn)定性和重復(fù)性等方法學(xué)考察，結(jié)果證明該方法有效可行。并對12批老翹樣品的特征圖譜進行特征峰相對保留時間與相似度分析，結(jié)果表明12批老翹的相似度可達到0.900以上，證明這12批老翹藥材具有較高的相似性，且5個特征峰重復(fù)性、專屬性好。本研究建立的老翹特征圖譜可以為評價老翹質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供很好的依據(jù)。